비자극성 펩타이드 MHC 복합체는 T 세포를 활성화시키지 않지만 고뇌스트 펩티드 MHC에 대한 T 세포 반응을 향상시킬 수 있다. 이 프로토콜은 인간 CD8 T 세포 활성화 중 공동 작용증을 조사하는 실험 시스템을 설명합니다. 우리는 MHC 분자를 공유적으로 연결된 무거운 사슬, 베타-2-마이크로글로불린 및 펩타이드를 가진 단일 사슬 복합체로 표현합니다.
이것은 미리 결정된 펩티드를 제시하는 MHC 분자로 돌연변이를 소개하는 것을 허용합니다. 이 프로토콜은 인간 CTN 클론을 사용, B 형 간염 바이러스의 에피토프에 대한 특정. 간염에 대한 T 세포 반응 도중 공동 작용의 기계장치를 이해하는 것은 이 바이러스성 감염에 대하여 면역tropics의 발달에 기여할 수 있습니다.
제시된 방법은 알려진 펩타이드 MHC 특이성을 가진 인간 T 세포 시스템에서 T 세포 활성화의 연구 및 기타 근본적인 양상에서 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 신호 서열, 관심 펩타이드, 링커, 인간 베타-2-마이크로글로불린 링커 및 MHC 헤비 체인으로 구성된 단일 체인 인간 MHC 클래스 I 분자를 사용합니다. B형 간염으로부터E1A3 펩타이드는 작용제 펩타이드로 사용된다.
HIV에서 개그 비 자극 펩 티 드로 사용 됩니다. 단일 사슬 인간 MHC 분자는 테트라사이클린 억압을 포함하는 햄스터 세포주에서 발현된다. 아고니스트 단일 체인 MHC는 테트라사이클린 유도 할 수없는 플라스미드를 사용하여 표현되어 테트라 사이클린이 없는 경우 발현 수준이 매우 낮고 테트라사이클린이 있는 상태에서 높은 발현 수준을 생성합니다.
고뇌스트 펩티드 MHC의 낮은 수준을 발현하는 CHO 세포는 구성적으로 발현되지 않는 펩타이드 MHC로 전염된다. 이 실험 시스템의 사용은 비 자극 펩타이드 MHC의 존재 또는 부재에서 고뇌스트 펩티드 MHC에 T 세포 반응을 비교할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Cho 세포를 T-75 플라스크에서 배양합니다.
T 세포 활성화 실험 전날, PBS로 플라스크에서 세포를 씻는다. PBS에서 05%의 트립신과 2%EDTA가 포함된 솔루션을 추가하고 실온에서 5~10분 동안 배양합니다. 가벼운 현미경을 사용하여 세포를 관찰하여 분리되었는지 확인하십시오.
그런 다음 트립시니화를 중지하기 위해 플라스크에 완전한 F12를 추가합니다. 세포 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 옮기. 400G의 원심분리기는 5분 동안 피펫팅 또는 디캔팅하여 상퍼를 제거합니다.
완전한 F12의 5밀리리터에서 셀 펠릿을 다시 중단합니다. 혈세포계를 사용하여 세포를 계산하고, CF12에서 밀리리터당 세포 농도를 200, 000 세포로 조절한다. 테트라사이클린밀리리터당 50~60나노그램을 아고니스트 전용 샘플에 추가하여 고뇌스트 pMHC 클래스 I 발현을 양성 대조군으로 유도한다.
이 후, 소용돌이 또는 파이펫팅에 의해 CHO 세포를 혼합. U-바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 셀 서스펜션 100마이크로리터를 추가합니다. 이산화탄소 5%와 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다.
실험 전날, 원심분리기 CTLS 세포는 400배 G, 섭씨 4도에서 5분간 세포를 나타낸다. 혈종계를 사용하여 세포를 계산하고, 사이토카인이나 PHA없이 완전한 인간 T 세포 매체에서 밀리리터 당 백만 세포의 밀도로 다시 중단하십시오. CTL을 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 하룻밤 동안 배양합니다.
다음 날, T 세포를 400배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다. 상체를 버리고 완전한 혈청이없는 매체의 2 밀리리터에서 세포를 다시 중단하십시오. 혈종계를 사용하여 T 세포를 계산하고, 완전한 인간 T 세포 매체에서 밀리리터 당 백만 개의 살아있는 세포로 밀도를 조절한다.
항인간 CD107a 항체를 1-100 희석에 넣고 브레펠딘 A를 1-1000 희석에 넣습니다. 다음으로, CHO 셀을 포함하는 96웰 플레이트를 회수한다. 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 CHO 셀에서 미디어를 흡인시합니다.
T 셀 서스펜션의 마이크로리터 200개를 각 웰에 추가합니다. 3~4시간 동안 5%의 이산화탄소를 가진 37°C의 CHO 세포를 공동 배양한다. 공동 문화의 끝에서, 원심 분리는 96 웰 플레이트를 400 배 G와 섭씨 4도에서 5 분 동안 분리합니다.
스파이어 또는 플리킹으로 상체를 제거합니다. 그런 다음 CD3 항체의 2.5 마이크로리터와 2.5 마이크로리터의 CD8 항체를 PBS에 50 마이크로리터에 PBS에 5%BSA의 마이크로리터를 각각 양에 첨가하고, 세포 표면 항원 염색을 위해, 파이펫팅하여 혼합한다. 어둠 속에서, 그리고 얼음위에 30분 동안 샘플을 배양합니다.
그 후, 샘플을 세척하기 위해 각 웰에 150 마이크로 리터의 세척 버퍼를 추가합니다. 원심 분리는 400 배 G와 섭씨 4도에서 5 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 스파이어 또는 플리킹으로 상체를 제거합니다.
고정/투과성 키트를 설정하고 고정/투과화 솔루션 100마이크로리터를 각 웰에 추가하고 파이펫을 혼합합니다. 20분 동안 얼음에 배양하세요. 그런 다음, 원심 분리는 5 분 동안 섭씨 4도에서 400 배 G에서 접시를 분리합니다.
상체를 버리고 각 우물에 1X 파마 / 세척 버퍼의 200 마이크로 리터를 추가합니다. 파마/세척 버퍼를 한 번 추가하여 원심분리에서 이 과정을 반복합니다. 그 후, 밀리리터당 3마이크로그램의 농도로 인터페론-감마를 함유한 파마/세척 버퍼 50마이크로리터에서 세포를 다시 중단한다.
어둠 속에서 30분 동안 얼음을 배양합니다. 다음으로 1X 파마/워시 버퍼의 마이크로리터 150기를 추가합니다. 섭씨 400G의 원심분리기는 5분간.
상체를 제거하고 1X 파마/워시 버퍼200 마이크로리터를 추가합니다. 접시를 다시 400배, 섭씨 4도, 5분간 원심분리하고, 진동또는 플릭으로 상퍼를 제거합니다. 세척 버퍼의 200 마이크로 리터에서 샘플을 다시 중단하고 세포 측정 분석을 진행합니다.
실험 하루 전에, 소용돌이 또는 파이펫팅에 의해 CHO 세포를 혼합. 다음으로 12웰 플레이트의 각 웰에 셀 서스펜션 1밀리리터를 추가합니다. 이산화탄소 5%와 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다.
실험 당일, 세포 스크레이퍼를 사용하여 각 웰의 바닥에서 CHO 세포를 분리합니다. 각 우물에서 FACS 튜브로 세포를 포함하는 미디어의 1 밀리리터를 전송합니다. 원심분리기는 G 400배, 섭씨 4도에서 5분간.
세척 버퍼에서 희석된 항 HLA 항체의 100마이크로리터에서 다시 중단합니다. 얼음에 30분 간 배양하세요. 그런 다음 각 CHO 샘플에 1 밀리리터의 세척 버퍼를 추가합니다.
원심분리기는 400배, 섭씨 4도에서 5분간 폐기하고, 상신기를 폐기한다. 각 샘플을 세척 버퍼 3밀리리터로 다시 중단하고 세포 측정 분석을 진행합니다. 이 연구에서는, 인간 CD8 양성 T 세포 활성화 도중 분자 상호 작용의 조사를 위한 강력한 공구가 제시됩니다.
공동 고뇌스트 pMHC의 존재 또는 부재에서 저수준 의 작용제 pMHC를 제시하는 엔지니어링 된 xenogenic 시스템이 생성됩니다. 이러한 엔지니어링 된 APC는 E183 특이적 인간 CD8 양성 T 세포 클론을 자극하는 데 사용됩니다. 비자극성 단일 체인 개그-MHC 복합체를 발현하는 초세포 및 초세포는 활성화를 유도하지 않는다.
양성 대조군인 고뇌스트 단일 체인 E183-MHC 복합체의 높은 수준의 발현은 매우 효율적인 인터페론 감마 생성및 탈과화를 유도하여 단일 체인 E183 구조가 T 세포 이펙터 기능을 활성화하기 위해 특정 TCR에 의해 인식될 수 있음을 입증한다. 단일 체인 E183-MHC 복합체의 낮은 수준의 발현은 비자극성 개그-MHC 복합체의 존재에 의해 강화된 인터페론 감마 생산 및 탈과립의 낮은 수준을 유도한다. CD107a+T 세포의 매우 높은 백분율은 이전 연구와 일치하는 항원 성 pMHC의 낮은 수준에 대한 응답에서도 관찰된다.
그러나 비자극성 개그-MHC 컴플렉스의 존재는 CD107a MFI를 증가시킵니다. 이 절차 동안, 자극성 펩티드의 유무에 관계없이 동등한 작용제 프리젠 테이션을 보장하기 위해 고뇌스트 펩티드 MHC 발현을 제어하는 것이 중요합니다. 각 실험에서 TCR 유사 항체를 사용하여 고뇌스트 펩티드 MHC 발현을 정량화하는 것이 중요합니다.
대안적인 접근법은 지원되는 지질 이중층 또는 구슬을 사용하여 비자극성 펩타이드 MHC가 있는 상황에서 고정량의 작용제 펩티드 MHC를 제시하는 것이다. 그 실험 시스템은 공동 작용에 대한 여러 비 자극 펩티드 서열의 테스트를 허용해야합니다. 단일 체인 MHC 기술은 CD4 T 세포 활성화에서 분자 상호 작용을 조사하고 비고전성 MHC 분자를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 인간의 혈액과 인간 세포를 사용합니다. 혈액 질환의 전염 위험을 줄이기 위해 인간의 혈액과 함께 작업 할 때 필요한 모든 예방 조치를 따르십시오.
