우리 연구실에서는 키메라 항원 수용체와 같은 인공 면역 수용체를 설계하고 이것이 조절 T 세포 생물학에 어떤 영향을 미치는지 연구합니다. 새로운 DNA 염기서열을 발명하고 질병에 대한 인간화된 마우스 모델을 사용함으로써 자가면역 질환, 이식 거부 반응, 암 및 노화에 대한 공학적 면역 세포 치료법을 만드는 것을 목표로 합니다. 조절 T 세포를 위한 키메라 항원 수용체를 설계할 때는 그 강도를 고려하는 것이 중요합니다.
친화도가 높은 CAR Tregs는 effector T 세포와 더 유사하게 작용하여 염증성 사이토카인을 증가시키고 더 큰 사멸 활성을 보여줍니다. 현재 진행 중인 연구에 따르면 CAR 친화도를 줄이면 CAR Tregs의 사이토카인 프로필과 기능이 개선됩니다. CAR Treg 필드는 초기 단계이며 표준화가 부족합니다.
당사의 프로토콜은 CAR Tregs를 생성하고 테스트하기 위한 강력하고 보편적인 접근 방식을 도입합니다. 이를 통해 재현성을 높이고 혁신을 가속화하는 동시에 특히 Treg 부족 및 특수 요구 사항의 문제를 감안할 때 CAR Treg 연구를 처음 접하는 실험실을 안내합니다. 우리는 조절 T 세포가 면역 균형을 유지하고 조직 치유를 촉진하는 데 사용하는 메커니즘을 연구합니다.
우리의 연구에는 CAR Treg 신호 전달 및 기능에 대한 이해뿐만 아니라 CAR Treg 요법이 현재 전략에 비해 고유한 이점을 제공할 수 있는 새로운 질병 맥락을 탐색하는 것이 포함됩니다. 시작하려면 류코팩의 내용물을 50ml 원추형 튜브에 옮깁니다. 2%태아 소 혈청과 동일한 부피의 DPBS를 추가하고 피펫으로 부드럽게 혼합합니다.
실온에서 300g으로 튜브를 10분 동안 돌립니다. 상등액이 흡인되면 2%의 소 태아 혈청으로 2ml의 DPBS로 세포 펠릿을 재구성합니다. 그런 다음 8ml의 염화암모늄 용액을 세포 현탁액에 첨가하고 부드러운 반전으로 혼합합니다.
분리된 상태에서 세척된 셀을 150g에서 실온에서 10분 동안 회전시킵니다. 상등액을 흡인시킨 후, 세포 펠릿을 2% 소 태아 혈청과 함께 30ml의 DPBS에 재현탁합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 500g에서 9개의 PBMC의 8의 거듭제곱으로 10을 8의 거듭제곱으로 돌립니다.
그리고 세포 분리 완충액에 5 곱하기 10의 농도로 밀리리터당 7 세포의 힘으로 재현탁합니다. 조절 T 세포의 형광 보조 세포 분류를 위해 CD4 양성 세포를 500g에서 5분 동안 회전시킵니다. 그런 다음 200마이크로리터의 DPBS에서 세포를 재구성합니다.
100만 개의 세포마다 1마이크로리터의 항인간 CD4 FITC를 첨가하고, 1마이크로리터의 항인간 CD25 APC 및 1마이크로리터의 항인간 CD127 PE를 첨가합니다. 튜브를 부드럽게 소용돌이친 후 섭씨 4도의 냉장고에 30분 동안 넣습니다. 2%의 소 태아 혈청이 함유된 DPBS 10ml로 세포를 세척한 후 500g에서 5분 동안 회전시키고 염색된 세포를 2%의 소 태아 혈청이 있는 DPBS 1ml당 7개의 힘으로 1.5배의 10배로 부드럽게 재현탁합니다. 다음으로, 염색된 세포 현탁액을 40마이크로미터 필터 캡을 통해 형광 보조 세포 분류 튜브에 통과시킵니다.
RPMI10 배지 3ml가 들어 있는 15ml 수집 튜브를 준비하고 얼음 위에 놓습니다. 마지막으로, 형광 보조 세포 분류를 사용하여 CD4 양성, CD25 높음, CD127 음성 조절 T 세포 및 CD4 양성, CD25 낮음, CD127 양성 기존 T 세포를 분류합니다. 먼저, 활성화 후 48시간이 지나면 인간 혈액에서 분리한 조절 T 세포를 채취하여 재현탁시킵니다.
세포를 계수한 후 실온에서 500g으로 5분간 돌립니다. RPMI10의 조절 T 세포를 1.25 곱하기 10으로 1밀리리터당 6개 세포의 거듭제곱으로 인터루킨-2 밀리리터당 1,000 국제 단위로 재현탁합니다. 이제 각 렌티바이러스 분취액을 마이크로 원심분리기 튜브에서 200마이크로리터에 있는 5개의 조절 T 세포의 거듭제곱에 2.5 곱하기 10에 추가합니다.
1, 32 섭씨 온도에 1 시간 동안 000g에 Spinoculate. 각 200마이크로리터 반응을 24웰 플레이트로 이동합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 형질도입된 조절 T 세포가 있는 플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다.
RPMI10 배지로 각 웰을 2밀리리터로 채우고 최종 인터루킨-2 농도는 밀리리터당 1, 000 국제 단위입니다. 다음과 같이 유세포 분석을 사용하여 유전자 변형 효율을 평가합니다. 먼저, 활성화 48시간 후 15ml 원추형 튜브에 anti-CD3, CD28 beads가 있는 재현탁 조절 T 세포를 취합니다.
세포 현탁액을 자석으로 3분 동안 배양합니다. 자석에 있는 동안 피펫을 통해 배지의 세포를 새 튜브로 옮깁니다. 비드 제거 후 디비드된 조절 T 세포를 RPMI10에 2시간 동안 그대로 둡니다.
그런 다음 조절 T 세포를 500g으로 5분 동안 회전시킵니다. 상층액이 디캔팅되면 예열된 환원 혈청 배지에 세포를 4배의 10배로 밀리리터당 6개의 세포의 힘으로 재현탁합니다. 저단백질 결합 1.5ml 원심분리기 튜브에 있는 100마이크로리터의 분취 세포.
키메라 항원 수용체 아데노 관련 바이러스를 20, 000의 감염 다중으로 각 샘플에 추가하고 재현탁합니다. 그런 다음 조직 배양 인큐베이터에서 반응 튜브를 1시간 동안 배양합니다. 배양 중에 추적 유전자 위치를 표적으로 하는 2.5마이크로리터의 단일 가이드 RNA에 8.3마이크로리터의 Cas9 단백질을 추가하여 CRISPR-Cas9 리보핵단백질 복합체를 준비합니다.
성분을 철저히 혼합한 후 조직 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 15분 동안 리보핵단백질 혼합물을 배양합니다. 다음으로, 새 전기천공관에 3ml의 고삼투압 전기천공법 완충액을 채웁니다. 딸깍 소리가 날 때까지 채워진 전기천공관을 전기천공법 시스템의 피펫 스테이션에 삽입합니다.
electroporation 시스템에서 electroporation 조건을 2, 200볼트, 20밀리초, 하나의 펄스로 설정합니다. 아데노 관련 바이러스를 사용한 1시간 배양이 완료되면 실온에서 300g의 바이러스가 있는 세포를 5분 동안 회전시킵니다. 상등액이 흡인되면 샘플당 전기천공법 시스템에서 제공하는 세포 재현탁 완충액 100마이크로리터에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
그런 다음 샘플당 10.8마이크로리터의 리보핵단백질 복합체를 추가하고 기포를 생성하지 않고 피펫으로 잘 혼합합니다. 이제 피펫을 두 번째 스톱으로 밀어 클램프를 열어 100마이크로리터 전기천공레이션 팁을 삽입합니다. 클램프가 피스톤의 장착 스템과 단단히 맞물릴 때까지 피펫의 상단 헤드를 전기천공 팁에 배치합니다.
팁이 틈 없이 꼭 맞도록 피펫에 대한 아래쪽 압력을 유지하면서 버튼을 서서히 놓습니다. 그런 다음 피펫을 첫 번째 스톱까지 누르고 전기천공법 팁을 세포 리보핵단백질 혼합물에 담그십시오. 기포 없이 샘플을 피펫으로 부드럽게 당겨 넣습니다.
딸깍 소리가 들릴 때까지 샘플이 들어있는 electroporation 팁이 장착된 피펫을 E 튜브에 수직으로 삽입합니다. human regulatory T cell에 대한 최적 설정을 확인한 후 터치스크린에서 Start를 눌러 세포를 전기천공합니다. 터치스크린이 완료로 표시될 때까지 기다립니다.
피펫을 부드럽게 제거하고 웰당 인터루킨-2가 포함된 2.5ml의 예열 무항생제 RPMI10 배지가 들어 있는 준비된 6웰 플레이트로 샘플을 즉시 옮깁니다. 플레이트를 직선 동작으로 부드럽게 흔든 후 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 다음 날, 16-18시간 후에 배지를 항생제가 함유된 배지로 교체합니다.
전기천공된 조절 T 세포를 10으로 계산하고 배양하여 1밀리리터당 6개 세포의 거듭제곱으로 인터루킨-2 밀리리터당 1, 000 국제 단위를 배양합니다.
