이 방법은 조직 재생, 특히 뼈에 약물의 부작용을 연구하기위한 면역 억제 치료 개입 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 제브라피쉬 뼈 재생의 과거 모델과 약물 보충 생선물에 부상당한 제브라피시의 침수로 전신 약물 노출을 결합한다는 것입니다. 절차를 시작하기 전에, 오토클레이브 1 알루미늄 호일은 제브라피시 당 600 밀리리터 비커와 실험을 위한 적절한 수의 물고기 물 병과 실험용 실험 제어 솔루션에서 면역 억제 약물을 준비합니다.
절단 부상의 경우, 무딘 집게를 사용하여 100mm 페트리 접시의 역쪽 뚜껑에 마취 된 얼룩말 피시를 조심스럽게 배치하고 메스를 사용하여 지느러미의 50 %를 절제하십시오. 그런 다음 적절한 실험제로 보충된 300밀리리터의 생선물을 함유한 오토클레이브 비커에 물고기를 넣고 비커를 호일로 덮어 얼룩말피 탈출을 방지합니다. 지느러미 골절 부상을 유도하기 위해, 해부 현미경 아래에 페트리 접시를 코팅 100밀리미터 아가로즈에 마취 된 얼룩말 피시를 배치하고 균열이 나타날 때까지 뼈 지느러미 선 세그먼트에 살두구 바늘을 약간 밀어 넣습니다.
이 크게 안정성을 손상 시킬 수 있기 때문에 지느러미에 너무 많은 골절을 소개 하는 것이 중요 하다. 그런 다음 적절한 실험제로 보충된 300밀리리터의 어수질이 들어 있는 오토클레이브 비커로 물고기를 옮킨다. 칼변종 두개골 부상을 생성하려면 마취된 Zebrafish를 똑바로 세워서 해부 현미경으로 쉽게 볼 수 있습니다.
정면 뼈의 중앙에 500 마이크로미터 드릴 비트가 장착된 회전 마이크로 드릴을 놓고 뼈를 부드럽게 터치하여 마이크로 드릴 버 크기의 구멍을 생성합니다. 부상을 생성하는 동안 측면으로 드릴을 이동하지 않고 조직의 저항이 떨어지면 즉시 중지하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 뇌가 손상됩니다.
그런 다음 적절한 실험제로 보충된 300밀리리터의 어수물이 들어 있는 오토클레이브 비커에 물고기를 넣습니다. 얼룩말물고기와 생선물을 적절한 임시 용기로 옮기고 비커를 신선한 약으로 보충한 생선물로 리필하여 매일 비커의 물을 바꿉니다. 그런 다음 생선 그물을 사용하여 제브라피시를 비커로 되돌려 보입니다.
총 2일까지 지속되는 트리트먼트의 경우 Zebrafish를 먹이지 마십시오. 더 긴 실험 동안, 부화 아르테미아 SSP의 0.5 ~ 1 밀리리터로 얼룩말 피시를 먹이는 것은 매일 마다. 지느러미 부상 분석을 위해, 미세 한 집게를 사용하여 그루터기의 한 가장자리에 지느러미를 잡습니다.
두 번째 포셉을 사용하여 반대 그루터기 가장자리를 잡고 10~20초 동안 차가운 4%PFA가 포함된 접시 바닥에 티슈를 약간 누릅니다. 필요에 따라 핀 평평하게 반복합니다. 지느러미는 이제 컬링없이 평평하게 놓여야합니다.
고정 후 장기 시료 보관을 위해, 3 개의 20 분 PBS 세척 및 상승 메탄올 시리즈로 조직을 세척하십시오. 그런 다음 샘플은 영하 20도에서 100 % 메탄올에 저장할 수 있습니다. Alizarin Red 염색의 경우, 내림차순 메탄올 계열에 저장된 메탄올 저장 샘플을 수분한 다음 PBS에서 20분 세척하고 15분 동안 분해된 물로 세척합니다.
마지막 세척 후, 샘플 조직에 Alizarin 레드 솔루션을 추가하고 적절한 염색 기간 동안 흔들로 실온에서 샘플을 배양합니다. 샘플을 지우려면, 감소 1 % 칼륨 수산화 글리세롤 시리즈로 조직을 치료. 그런 다음 샘플을 1 대 1 0.1 % 글리세롤 용액에 1 ~ 1 %의 글리세롤 용액에 저장하고 상상을위한 80 % 글리세롤로 조직을 장착하십시오.
칼신 염색의 경우 알루미늄 호일로 덮인 유리 비커로 20분 동안 칼신 용액 100mm에서 최대 3마리의 Zebrafish를 동시에 배양합니다. 잠복이 끝나면 Zebrafish를 물고기 물 용기로 옮기고 물고기가 잠깐 수영을 한 후 새로운 물고기 물 용기로 옮기십시오. 두 번째 비커에서 20분 후 지느러미 재생의 라이브 이미지를 획득한 후, 마취된 얼룩말피쉬를 아가로즈 코팅 페트리 접시에 놓고 스테레오 현미경으로 지느러미를 이미지화합니다.
재생 두개골 뼈의 이미지를 수집하려면, 스폰지에 똑바로 얼룩말 물고기를 배치하고 형광 현미경 검사법에 의해 두개골을 이미지. Prednisolone로 치료, 다른 글루코코르티코이드와 유사, 고정 된 caudal 지느러미 조직의 알리자린 레드 염색에 의해 검출된 바와 같이 뼈 형성을 포함 하 여 지느러미 재생의 전반적인 억제에 이르게. 마찬가지로, 약물은 calvarial 두개골 부상 폐쇄에 지연 효과.
면역 억제로 인해, 감소된 대식세포 숫자는 또한 항mCherry 및 항GFP 항체 염색 및 형질전환 MPEG-1 mCherry를 사용하여 입증된 바와 같이 냉동 조직 단면도에 면역조직화학에 의해 검출될 수 있고, 제브라피시 두개골 조직 샘플에 Osterix NGFP 제브라피시와 교차하여 처리된 동물에서. 이러한 절차를 시도하는 동안 매우 재현 가능한 방식으로 부상 에세이를 수행하여 뼈 재생 속도의 가변성을 최소화하는 것이 중요합니다. 또한 미생물 감염을 피하기 위해 오토클레이브 생선물을 함유한 오토클레이브 비커의 제브라피쉬(Zebrafish)를 단독으로 보관하는 것도 중요합니다.
이 프로토콜은 글루코코르티코이드 작용의 기본 메커니즘을 더 해결하는 데 도움이 될 것입니다. 예를 들어, 글루코코르티코이드 유도 골다공증의 맥락에서 다른 약물 및 기타 Zebrafish 뼈의 사용에 맞게 조정될 수도 있다.
