This work was supported by grant NIH R01 GM097204 (APV and JDH). Funding for JHM was supplied by an HHMI Undergraduate Research Summer Fellowship.

참고 : 개념적 프레임 워크 또는 워크 플로의도는 참조 용으로 그림 1에 설명되어 있습니다. 연산 또는 시퀀스 기반 예측, 단백질 발현과 정제, 생화학 적 특성 및 결정화 : 프로토콜은 네 개의 단계로 나눌 수있다. 도시 된 예는 Shroom SD2 도메인 및 / 또는 Shroom 록 착물을 분석하지만 어떤 단백질과 이용 될 수있다. 1. 코일 코일 도메인 경계의 전산 예측을 생성하는 웹 기반 도구를 설립 <ol><li> 순서 동족체의 진화 다양한 세트를 수집합니다. <ol><li> www.uniprot.org로 이동하여 상단 검색 창에 Shroom를 입력합니다. </li><li> 선택 순서는 옆 가입 번호에 체크 박스를 선택하여 다운로드합니다. 스타와 함께 시퀀스는 Uniprot 검토 시퀀스를 나타내며, 일반적으로 더 신뢰할 수 있습니다. 모든 순서가 완전하고 정확하도록주의하십시오. </li><li> 선택의 절감다운로드 버튼을 클릭하여 equences. </li><li> 그 Clustal-오메가 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)를 사용하여 Shroom 시퀀스의 컬렉션을 맞 춥니 다. 제출 밀어 다음 Shroom의 시퀀스 파일을 선택하려면 &quot;찾아보기&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> 정렬이 완료되면 &quot;정렬 파일 다운로드&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> (파일에서 | | 입력 정렬 파일) Jalview를 사용하여 1.1.5에서 발생하는 여러 서열 정렬을 엽니 다. (| 퍼센트 아이덴티티 컬러) 신분으로 새로운 정렬 창, 색상 내에서. </li></ol></li><li> 이차 구조 예측, 유연한 또는 무질서 시퀀스의 예측을 계산하고, 관심있는 단백질 (들) 내에서 코일 코일 영역을 예측했다. <ol><li> 코일 - 코일 예측을 계산하기 위해, http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi로 이동합니다. 복사 시퀀스 상자에 순서를 붙여 넣기하고 제출을 클릭합니다. 참고 :이 분석은 COMP하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다LETE. Shroom 서열이 상당히 크기 때문에 상기 서열은 웹 서버의 크기 제한에 맞도록 1,000 미만 아미노산의 블록으로 분할 될 필요가있다. Shrm2를 분석 할 때,이 부분은 코일 - 코일 영역을 포함하는 공지 된 SHRM SD2 도메인을 포함 같이 1000 C 말단 아미노산을 사용하는 것이 권장된다. 다른 단백질이 분석을 반복 할 때, 가능한 경우 전장 단백질 서열을 사용하도록 권장한다. 그 옵션을 선택하지 않으면, 공지 된 생화학 적 또는 기능적 데이터에 기초하여 시퀀스를 가능한 가장 큰 단편을 사용하거나 해부. </li><li> 코일 - 코일 예측을 계산하기 위해, http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi로 이동합니다. 복사 시퀀스 상자에 순서를 붙여 넣기하고 제출을 클릭합니다. </li></ol></li><li> Shroom 시퀀스의 하나의 포괄적 인 주석으로 1.2.2에 단계 1.1의 결과를 결합합니다. 참고 : 매우 또한 어떤 및 모든 관련 전을 포함하도록 권장된다nformation이는 문헌 또는이 단계에서 단백질의 기능 또는 정제에 대한 다른 소스에서 얻을 수있다. </li><li> 이 포괄적 인 주석 시퀀스를 이용하여, 보존을 극대화하려는 단백질의 도메인 경계 (또는 가능한 경계가 일련의) 예측 무질서 또는가요 서열의 양을 최소화하면서 구조적 특징을 예측 하였다. 공지 된 경우, 생성 된 단백질은 관심의 기능 특성을 보유한다. </li></ol> 제 1 절에서 확인 된 도메인 경계 2. Express 및 Purify는 단백질 주 :이 구역의 목적은 제 1 항에서 생성 된 가상 도메인 경계를 선별 신속하고 용이하게 정량 분석의 시리즈를 사용하는 것이다. <ol><li> 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 상기 열 그의 -mRuby2-XH2 플라스미드 내의 프레임에 원하는 코딩 서열을 갖는 발현 플라스미드를 생성 (벡터 맵 A의도 3 참조차 추가 세부 사항). </li><li> 18-24 시간 동안 실온에서 autoinduction 매체 1 BL21 (DE3) 대장균 또는 다른 적합한 발현 균주를 사용하여 각각의 발현 플라스미드의 테스트 발현 수준. <ol><li> 예컨대 여기 온 (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial 같은 세포와 함께 또는 강력한 변환 프로토콜을 사용하여 지시 다음 발현 플라스미드뿐만 아니라, BL21 (DE3)에 빈 플라스미드 제어 변환 -변환/). </li><li> 새롭게 변형 플레이트에서 하나의 식민지를 선택하고 34 μg의가 / ㎖ 카나마이신과 하룻밤 원성 국물에서 37 ° C (LB) 미디어에서 5 ml의 스타터 문화를 성장. </li><li> 다음 날, 문화 펠렛 신선한 (LB)와 펠렛을 씻어 </li><li> 34 μg의 / ㎖ 카나마이신과 autoinduction 미디어 50ml로 한 스타터 문화를 추가합니다. 문화가 실내 온도 37 ° C의 하나에 포화로 성장 할 수 있습니다. 일반적으로 18 ~ 24 시간 ~에 대한 성장한다. </li><li> 펠렛의 세포s와 정제에 무기한 전에 -80 ° C에서 생성 된 세포 펠렛을 동결. </li><li> 가장 효율적으로 원하는 융합 단백질을 생산하는 균주를 결정하기 위해 각 식의 변형 및 SDS-PAGE에 의해 빈 벡터 제어에서 전체 세포 추출물을 비교합니다. 그의 열 -mRuby2-Shroom SD2 융합 단백질의 경우, 50 분 ~ 나 염료 프론트 겔 (22)의 하단에 도달 할 때까지 180 V에서 10 % SDS-PAGE 젤을 실행. </li><li> 쿠마 블루와 얼룩 젤은 각 균주 (23) 내 총 세포 단백질을 시각화합니다. </li></ol></li><li> 성공적으로 mRuby2 융합 단백질을 발현 각 변형에 대한 초기 친 화성 크로마토 그래피 단계를 수행합니다. 일반적으로 단백질은 4 ℃에서 정제로 변경된 조건에서 혜택을하지 않는 정제, 실온에서 2.3.2-2.3.7 단계를 수행합니다. <ol><li> 단계 2.2.5에서 해동 세포 펠렛. </li><li> 용해 완충액 (10 % 글리세롤, 500 mM의 염화나트륨, 40 ml의 1.5 각 세포 펠렛을 재현 탁mM의 이미 다졸, 20 mM 트리스 pH8.0, 1 mM의 베타 - 머 캅토 에탄올). 적절한 프로테아제 억제제로 세포 용해 완충액을 보완. </li><li> 10 ㎎ / ㎖의 리소자임 30 μl를 첨가하고 20 분 동안 실온에서 배양한다. 악기에 대한 지침을 다음 초음파 처리가 사용된다. </li><li> 불용성 물질 또는 unlysed 세포를 펠렛 14,000 XG에 30 분 동안 테이블 위에 원심 분리기에서 1.5 ML 튜브와 원심 분리기로 전송합니다. SDS-PAGE를 통해 후속 분석을위한 뜨는 및 펠렛을 모두 저장합니다. </li><li> 니켈 NTA 구슬 100 ㎕와 가용성 분획을 배양, 니켈 친 화성 정제를 수행합니다. 비드 믹스 수회 반전 5-10 분 동안 수용성 분해물과 비드 인큐베이션. </li><li> 구슬을 펠렛 탁상 원심 분리기에서 30 초 동안 800 XG에 원심 분리기. 비 특정 오염 물질을 청소 용해 버퍼와 펠렛을 3-5 회 세척하여이 작업을 수행합니다. </li><li> 용해 완충액으로 비드로부터 용출 루비 융합 단백질 일 보충M 이미 다졸. </li><li> 위의 &quot;신속하고 더러운&quot;정제 그의-mRuby2 - Shroom 단백질의 동작을 비교 SDS-PAGE를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 3. 특성화 단백질 샘플 유리한 속성을 가진 사람들을 식별하는 <ol><li> 루비 융합 단백질의 농도를 측정 한 후, 천연 PAGE 겔 (24) 상에 융합 단백질의 1-5 μg의 로딩하여 샘플의 균질성을 평가하기 위해 280 nm에서 분광 광도계 세트를 사용. 175 V.에서 140 분 동안 4 ° C에서 10 % 기본 PAGE 젤을 실행 <ol><li> 이미지 mRuby - 태그 융합이 분석에서 마이그레이션하는 경우 관찰, 형광 시각화 장착 이미 저를 사용하여 원시 PAGE. 참고 :이 단백질이 가능성이 집계 아니라에 붙어 융합 단백질을 관찰하기 위해주의해야합니다. 형광 화상 카메라를 사용할 수없는 경우, 하나는 종종 시각화 할 수 있습니다 루비의 이미지 농축 샘플은 검은 빛 아래 또는 자외선 상자 단백질 태그. </li></ol></li><li> 안정적으로 접힌 도메인을 식별하기 위해 제한된 단백질 분해를 수행합니다. 0.025 %의 서브 틸리 A의 5 μL와 / ~ 1 밀리그램에서 ml에 루비 SHRM SD2 융합의 95 μl를 품다 <ol><li> 의 시점에서, 반응 샘플을 0, 0.5, 2, 5, 15, 60 및 120 분, 각 시점에 대한 반응을 10 μl를 제거하고, 15 % 아크릴 아미드 겔을 사용하여 SDS-PAGE를 통해 반응의 진행을 시각화 . </li><li> 단계 2.2.7에서와 같이 쿠마 블루로 염색하고, 단백질 분해 효소 저항성 종을 식별 할 수 있는지 여부를 평가합니다. </li></ol></li><li> 용액에서 이들 단백질의 전체적인 동작의 종합 평가로 부분 정제 mRuby2-Shroom 융합 단백질의 정제 효율 동작 천연 PAGE에서 제한된 단백질 분해 데이터를 통합. <ol><li> 적절한 기능 분석을 사용할 수있는 경우 (선택 사항),이 시점에서 활동을 확인합니다. </li></ol></li></ol> 4. 코일 코일 SD2의 높은 품질 크리스탈을 생산Shroom에서 도메인 주 : 단백질이 일반적으로 상이한 온도에서 정제로부터 4 ° C 유익하지 않는 한 4.1 내의 모든 단계가 실온에서 수행된다. <ol><li> 발현 및 정제 잠재력의 대략적인 추정치로 50 ml의 성장을 사용하여 완전히 정제 된 시료의 5 ~ 20 mg의 달성을 목표로 mRuby2 - Shroom SD2의 대규모 식을 수행합니다. 일반적으로 배양이 L은 적절한 출발 물질을 제공한다. 10 분 동안 8,000 XG에 원심 분리하여 성장 펠렛 세포 후. <ol><li> 용해에 대한 리소자임을 사용하는 경우, 고정 된 세포 펠렛 그램 당 분해의 1 ~ 2 mL의 사용 이전 용해 완충액에 2 L의 성장 펠렛을 재현 탁. 또한, ~ 8 ㎖ / g 펠릿에 재현 탁은 균질 또는 프렌치 프레스를 사용하는 경우. 30 분 동안 30,000 XG에서 원심 분리를 통해 세포 파편 펠렛. </li><li> 일괄 니켈 NTA 수지를 사용하여 10 ㎖ 4.1.1에서 가용성 획분을 결합한다. 적절한 중력 컬럼에 부어언 바운드 단백질이 떨어져 배출 할 수 있습니다. </li><li> 워시 1 M의 NaCl로 보충 된 용해 완충 용액으로 세척 한 다음 용해 완충액 40 ㎖, 3-5 회 수지 등을들 수있다. </li><li> 80 mM의 이미 다졸 보충 용해 완충액 40ml를 씻을 수지. </li><li> 1 M 이미 다졸을 첨가 용해 완충액 40 mL로 루비 Shroom 융합 단백질을 용출시켰다. 수동 4-10 ml의 분획으로 용출 된 단백질을 분별. </li><li> 10 % SDS-PAGE를 사용하여 루비 Shroom 융합 단백질을 포함하는 분획을 확인합니다. </li><li> 8 % 글리세롤, 250 mM의 염화나트륨, 15 mM의 이미 다졸, 20 mM 트리스 pH8.0로 (일반적으로 2-4 분수) 적절한 분획을 투석, 1 MM의 β-ME, 6-8 kDa의 MWCO 투석 튜브를 사용하여. 융합 단백질의 모든 25 ~ 50 mg을위한 TEV 단백질 분해 효소의 1 밀리그램을 추가합니다. 천천히 교반하면서 실온에서 밤새 투석. </li><li> 반복 니켈 친 화성 정화는 4.1.2 단계를 반복합니다. 4.1.6합니다. 그분의 10 -mRuby2가 결합 상태로 유지됩니다 동안 Shroom SD2 도메인은 이제 언 바운드 분수에 남아 있어야수지와는 용출 분획에서 발견 될 것이다. 쿠마 파란색이 사용하는 12 % SDS-PAGE의 얼룩을 확인합니다. </li><li> 8 % 글리세롤, 100 mM의 염화나트륨, 5 mM의 베타 - 머 캅토 에탄올 버퍼 밤새 20 mM 트리스 pH를 8.0로 Shroom SD2 도메인을 함유하는 분획을 투석. </li><li> FPLC를 사용하여 음이온 교환 크로마토 그래피 (25)를 수행하고, 0.1 ~ 1.0 M의 NaCl에서의 NaCl 구배로 용출. 12 % SDS-PAGE를 사용하여 분수를 분석합니다. </li><li> 스핀 농축하여 (10 kDa의의 MWCO 또는 더 큰 단백질이 연구되고있다)에 따라, 12 % SDS-PAGE를 통해 피크 분획을 분석 ~ 0 ㎎ / ㎖ 후 크기 배제 크로마토 그래피 (26)을 수행하는 피크 분획을 농축시켰다. </li><li> 풀 피크 분획 및 20 mM 트리스 pH를 8.0의 50 mM의 NaCl, 2 % 글리세롤로 투석 한 MM의 β-ME 및 / ㎖ 종래 결정화는 10 mg의 농축시킨다. 선택 :이 단계의 농도로 5 μl의 샘플을 제거 1, 2, 5 및 10 ㎎ / ㎖ 시료 농축 과정 중에.이 단계에서 샘플의 행동을보고 각 샘플의 기본 페이지 로딩 2-5 μl를 실행합니다. </li></ol></li><li> 결정화 실험을위한 최적의 단백질 농도를 식별하기 위해 12의 조건의 작은 배열을 화면. 이러한 조건의 조성은도 7에 기재되어있다. <ol><li> 기상 확산법, 피펫을 이용하여 결정화 실험을 수행, 24- 웰 앉아 드롭 결정화 트레이를 사용하여 초기에 잘 용액 1 μL와 커버 슬립에 단백질 샘플 1 μl를 포함 방울 이어 별도 웰에 12 조건 각각 500 μL . 이 기술에 대한 추가 정보는 27을 참조하십시오. </li><li> 신속 명확한 테이프로 트레이를 밀봉 및 진동 무료 적당한 온도 제어 된 환경에 트레이를 이동합니다. 다를 수 있습니다 사용 온도,하지만 4 °의 C, 16 ° C, 20 ° C는 매우 일반적이다. </li><li> 다음 3 일 동안 트레이에 방울을 검사100X 배율까지에서 현미경을 사용하여 AYS. 3 일 기간의 말기에, 석출 (투명한) 광 침전, 호우 (브라운), 또는 결정을 포함하지 않는 각 드롭 점수. 적절한 단백질 농도 이하 6 무거운 강수량이 포함되어야합니다. </li><li> 4.2에 명시된 단백질 농도를 사용하여, 시판의 결정화 스크린 다양한 화면. 또한 상품의 에러를 최소화하는 동안, 액체 핸들링 로봇 또는 결정화의 사용은 크게이 프로세스의 속도. 이것은 사용자가 하나의 샘플을 더 조건을 선별 할 수 있도록, 그리고 훨씬 적은 단백질을 필요로한다. </li><li> 체계적으로 이전 24 잘 선별 트레이를 사용하여 결정화 드롭 내에서 각 변수를 변화시킴으로써 넓은 화면에서 확인 된 초기 조건을 개선합니다. </li></ol></li></ol>

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M., Mun, S., Wang, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+analysis+of+the+effects+of+reversible+dimerization+in+size+exclusion+chromatography.">Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography.</a> J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).</li><li>Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+historical+perspective+on+protein+crystallization+from+1840+to+the+present+day.">A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day.</a> FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).</li><li>Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGenTHREADER+and+pDomTHREADER:+new+methods+for+improved+protein+fold+recognition+and+superfamily+discrimination.">pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).</li><li>Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+protein+domain+assignment+from+amino+acid+sequence+using+predicted+secondary+structure.">Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure.</a> Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).</li><li>Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phyre2+web+portal+for+protein+modeling,+prediction+and+analysis.">The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis.</a> Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).</li><li>Elsliger, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JCSG+high-throughput+structural+biology+pipeline.">The JCSG high-throughput structural biology pipeline.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).</li><li>Bach, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+maltose-binding+protein+as+a+molecular+chaperone+for+recombinant+intracellular+cytoplasmic+single-chain+antibodies.">Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies.</a> J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).</li><li>Strong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+structural+genomics+of+complexes:+crystal+structure+of+a+PE/PPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis.">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li><li>Heras, B., Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-crystallization+treatments+for+improving+diffraction+quality+of+protein+crystals.">Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기에 설명 된 프로토콜은 사용자가 자신의 결정을 용이하게하기 위해 큰 꼬인 코일 단백질 내에 도메인 경계를 식별 할 수 있도록 설계된다. 프로토콜은 잠재적 도메인 경계의 시리즈를 생성하는 예측 계산 및 다른 소스로부터의 데이터의 다양한 전체적인 결합에 의존한다. 이러한 신속하고 저렴하고, 또한 이러한 초기 가설을 수정하는 데 사용되는 생화학 실험 세트 다음에 있습니다. 이 방법...

X 선 결정학을 통해 구조 결정은 현대 생물학의 모든 분야에 근본적인 기여를했다; 생활을 지원들이 다양한 상황에서 서로 상호 작용하는 방식 거대 분자의 원자보기를 제공하는 단계; 질병 및 제공하는 기회가 합리적으로 질병을 치료하는 약물을 설계하는 원인이 메커니즘을 이해하기 위해 우리를 허용한다. 결정학 긴 고분자 구조를 결정하는 지배적 인 실험 기술되고, 현재 구조 데이터베이스 (www.rcsb.org)의 89.3 %를 차지 하였다. 이 기술은 매우 높은 해상도의 가능성 등 많은 장점을 가지고하는 크기의 넓은 범위, 상대적으로 쉬운 데이터 수집 및 고분자 용매뿐만 아니라 리간드와 상호 작용하는 방법을 시각화 할 수있는 기회 거대 분자를 시각화 할 수있는 능력. 재조합 단백질 발현 1, 2, 끝까지 마음에있는 수많은 기술 향상에도 불구하고형 치수 (3),이 시스템 (4), 결정 공정에있어서 가장 큰 장애물을 생성하는 데 사용되는 분자 생물학 회절 품질의 결정을 성장할 수있는 능력 남아있다. 이것은 큰 꼬인 코일 도메인을 포함하는 단백질에 대해 특히 사실이었다. 모든 아미노산의 많은 5 % 정도가이 매우 일반적인 구조 기능 칠하고, 코일 - 코일 5,6 내에서 발견되는 것으로 추정, 아직이 단백질은 종종 정화 및 구형 단백질 8-10을보다 구체화하기가 더 어렵되었습니다 . 이는 상기 꼬인 코일 도메인은 종종 따라서 올바르게 종종 결정화 해로운 비정형 또는가요 서열의 포함을 피하기 위하여 중요한 이러한 도메인의 경계를 예측하는 더 큰 단백질의 컨텍스트 내에서 발견 된 사실에 의해 악화된다. 여기에 우리가 결합 개념적 틀을 제시 웹 기반의 계산은 experimenta와 분석구조 연구, 어떻게 준비하고 결정화 시도하기 전에 단백질 시료의 특성을하기위한 단백질 단편 (들)을 선택하는 방법 : 벤치에서 리터 데이터는 결정 과정의 초기 단계를 포함 통해 안내 사용자에게 도움이됩니다. 우리는 큰 코일 코일 도메인을 포함하는 두 단백질에 대한 우리의 분석에 초점을 Shroom (SHRM)과의 Rho 키나제 (바위). 둘은 꼬인 코일 도메인을 포함하고, 생물학적으로 중요한 11-16 착체를 형성하는 것으로 알려진 이러한 단백질을 선택 하였다. Shroom과의 Rho 키나아제 (록)을 각각 권취 코일의 200 ~ 680 잔기를 포함하는 것으로 예상되는 많은 부분이있는 구조적 특징 17-20되었다. 여기에 기재된 방법은 빠르게 결정화 의무가 될 것이다 감긴 코일 함유 단백질의 단편을 확인하는 유선형 흐름을 제공하지만, 기재된 기술은 쉽게 가장 단백질 또는 단백질 복합체하도록 또는 높은 처리량 approa를 통합하도록 변형 될 수있다CHES로 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 이러한 방법은 일반적으로 저렴하고, 거의 모든 환경 레벨에서 사용자에 의해 수행 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="925">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">BL21(DE3) Rosetta</td>
			<td style="width:263px;">Emd Millipore</td>
			<td style="width:136px;">70954-3</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">BL21(DE3) Star</td>
			<td style="width:263px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">C601003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">BL21(DE3) Codon Plus</td>
			<td style="width:263px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:136px;">230245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:263px;">Spectrum Chemical Mfg Corp</td>
			<td style="width:136px;">L3008-5GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">Ni-NTA resin</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:136px;">25216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">SubtilisinA</td>
			<td style="width:263px;">Spectrum Chemical Mfg Corp</td>
			<td style="width:136px;">S1211-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24 well Cryschem Plate</td>
			<td>Hampton research</td>
			<td style="width:136px;">HR3-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INTELLI-PLATE &#160;96:</td>
			<td style="width:263px;">Art Robbins Instruments</td>
			<td style="width:136px;">102-0001-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">PEG 3350</td>
			<td style="width:263px;">Hampton research</td>
			<td>HR2-591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">PEG 8000</td>
			<td style="width:263px;">Hampton research</td>
			<td style="width:136px;">HR2-515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">PEG 400</td>
			<td style="width:263px;">Hampton research</td>
			<td>HR2-603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">PEG 4000</td>
			<td style="width:263px;">Hampton research</td>
			<td>HR2-605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:336px;">pcDNA3.1-Clover-mRuby2</td>
			<td style="width:263px;">Addgene</td>
			<td style="width:136px;">49089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Overnight Express Autoinduction System 1</td>
			<td style="width:263px;">Emd Millipore</td>
			<td>71300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysogeny Broth powder</td>
			<td style="width:263px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12795027&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining wet and dry lab techniques to guide the crystallization of large coiled-coil containing proteins

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are found throughout nature, however, because of their physical properties and tendency to aggregate, they are traditionally viewed as being especially difficult to crystallize. Here, we utilize a variety of quick and simple techniques designed to identify a series of possible domain boundaries for a given coiled-coil protein, and then quickly characterize the behavior of these proteins in solution. With the addition of a strongly fluorescent tag (mRuby2), protein characterization is simple and straightforward. The target protein can be readily visualized under normal lighting and can be quantified with the use of an appropriate imager. The goal is to quickly identify candidates that can be removed from the crystallization pipeline because they are unlikely to succeed, affording more time for the best candidates and fewer funds expended on proteins that do not produce crystals. This process can be iterated to incorporate information gained from initial screening efforts, can be adapted for high-throughput expression and purification procedures, and is augmented by robotic screening for crystallization.

이 시스템에서 이용되는 흐름을 도시 한 도면도 1에 도시 된 세 개의 주요 단계를 포함한다. 시퀀스의 전산 분석은 관심있는 꼬인 코일 단백질의 도메인 경계에 대한 가설을 개발하는데 이용된다. Shrm2 SD2 도메인 주석 분석의 예는도 2에 도시되어있다. 이 도면에서, 목표 Shroom가 SD2라는 골격 레귤레이터의 C 말단에 보존 된 도메인 가능한 도메인 경...

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Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

We describe a framework incorporating straightforward biochemical and computational analysis to guide the characterization and crystallization of large coiled-coil domains. This framework can be adapted for globular proteins or extended to incorporate a variety of high-throughput techniques.

습식 및 건식 연구소의 기술을 결합하면 대형 코일 코일 포함하는 단백질의 결정화를 안내합니다

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.9K 조회수.  University of Pittsburgh. We describe a framework incorporating straightforward biochemical and computational analysis to guide the characterization and crystallization of large coiled-coil domains. This framework can be adapted for globular proteins or extended to incorporate a variety of high-throughput techniques.

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Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드<em&gt; S</em&gt; 시탈 로프 람

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

연구

생화학

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The analysis does not usually require extensive sample preparation; structural and chemical information can be obtained without labeling. However, each Raman image contains thousands of spectra; this raises difficulties when extracting hidden information, especially for components with similar chemical structures. This work introduces a multivariate analysis to address this issue. The protocol establishes a general method to visualize the main components, including lignin, cellulose, and hemicellulose within the plant cell wall. In this protocol, procedures for sample preparation, spectral acquisition, and data processing are described. It is highly dependent upon operator skill at sample preparation and data analysis. By using this approach, a Raman investigation can be performed by a non-specialist user to acquire high-quality data and meaningful results for plant cell wall analysis.

This protocol aims to present a general method to visualize lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls using Raman imaging and multivariate analysis.

라만 이미징과 다변량 분석을 결합하여 식물 세포벽에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로스를 시각화합니다.

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its precursor p100. p52 functions as a homodimer or heterodimer with another NF-&#954;B subunit, RelB. These dimers in turn regulate the expression of hundreds of genes involved in inflammation, cell survival, and cell cycle. IKK1/&#945; primarily remains associated with IKK2/&#946; and NEMO as a ternary complex. However, a small pool of it is also observed as a low molecular weight complex(es). It is unknown if the p100 processing activity is triggered by activation of IKK1/&#945; within the larger or the smaller complex pool. Constitutive activity of IKK1/&#945; has been detected in several cancers and inflammatory diseases. To understand the mechanism of activation of IKK1/&#945;, and enable its use as a drug target, we expressed recombinant IKK1/&#945; in different host systems, such as E. coli, insect, and mammalian cells. We succeeded in expressing soluble IKK1/&#945; in baculovirus infected insect cells, obtaining mg quantities of highly pure protein, crystallizing it in the presence of inhibitors, and determining its X-ray crystal structure. Here, we describe the detailed steps to produce the recombinant protein, its crystallization, and its X-ray crystal structure determination.

I&#954;B Kinase 1/&#945; (IKK1/&#945; CHUK) is a Ser/Thr protein kinase that is involved in a myriad of cellular activities primarily through activation of NF-&#954;B transcription factors. Here, we describe the main steps necessary for the production and crystal structure determination of this protein.

생산, 결정 화, 및 인간 IKK1/α의 구조 결정에 대 한 안내

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

다각형 광 산란에 결합된 크기 배제 크로마토그래피에 의한 단백질의 특성 (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

Fumarylacetotate 하이드로 아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현, 정제, 결정화 및 효소 어세포

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

원형 RNA를 분석하기 위해 미니유전자를 포함하는 Alu 요소 사용

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and IKK&#946;. Upon activation, the IKK complex phosphorylates the I&#954;B molecules leading to NF-&#954;B nuclear translocation and activation of target genes. Inhibition of the NEMO/IKK interaction is an attractive therapeutic paradigm for the modulation of NF-&#954;B pathway activity, making NEMO a target for inhibitors design and discovery. To facilitate the process of discovery and optimization of NEMO inhibitors, we engineered an improved construct of the IKK-binding domain of NEMO that would allow for structure determination of the protein in the apo form and while bound to small molecular weight inhibitors. Here, we present the strategy utilized for the design, expression and structural characterization of the IKK-binding domain of NEMO. The protein is expressed in E. coli cells, solubilized under denaturing conditions and purified through three chromatographic steps. We discuss the protocols for obtaining crystals for structure determination and describe data acquisition and analysis strategies. The protocols will find wide applicability to the structure determination of complexes of NEMO and small molecule inhibitors.

We describe protocols for the structure determination of the IKK-binding domain of NEMO by X-ray crystallography. The methods include protein expression, purification and characterization as well as strategies for successful crystal optimization and structure determination of the protein in its unbound form.

NEMO의 IKK 결합 도메인의 생산, 결정화 및 구조 결정

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm phenotyping can be used to classify genotypes based on SG morphotype using scanning electron microscopic (SEM) analysis. SGs can be visualized using SEM by slicing through the kernel (pericarp, aleurone layers, and endosperm) and exposing the organellar contents. Current methods require the rice kernel to be embedded in plastic resin and sectioned using a microtome or embedded in a truncated pipette tip and sectioned by hand using a razor blade. The former method requires specialized equipment and is time-consuming, while the latter introduces a new host of problems depending on rice genotype. Chalky rice varieties, particularly, pose a problem for this type of sectioning due to the friable nature of their endosperm tissue. Presented here is a technique for preparing translucent and chalky rice kernel sections for microscopy, requiring only pipette tips and a scalpel blade. Preparing the sections within the confines of a pipette tip prevents rice kernel endosperm from shattering (for translucent or &#8216;vitreous&#8217; phenotypes) and crumbling (for chalky phenotypes). Using this technique, endosperm cell patterning and the structure of intact SGs can be observed.

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

This protocol allows for the preparation of transverse sections of cereal seeds (e.g., rice) for the analysis of endosperm and starch granule morphology using scanning electron microscopy.

성숙한 쌀의 횡단 단면(오리자 사티 라 L.) 파이펫 팁을 사용하여 전자 현미경 이미징을 스캐닝하기 위한 커널

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since cryogenic temperatures are non-physiological and may prevent, deter, or even alter protein structural dynamics, a robust method for routine X-ray diffraction experiments at room temperature is highly desirable. The crystal-on-crystal device and its accompanying hardware and software used in this protocol are designed to enable in situ X-ray diffraction at room temperature for protein crystals of different sizes without any sample manipulation. Here we present the protocols for the key steps from device assembly, on-chip crystallization, optical scanning, crystal recognition to X-ray shot planning and automated data collection. Since this platform requires no crystal harvesting nor any other sample manipulation, hundreds to thousands of protein crystals grown on chip can be introduced into an X-ray beam in a programmable and high-throughput manner.

This contribution describes how to set up protein crystallization on crystal-on-crystal devices and how to perform automated serial data collection at room temperature using the on-chip crystallization platform.

온칩 결정화 및 실온에서의 대규모 연속 회절

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different tags, truncations, deletions, fusion partner insertions, and stabilizing mutations to find one that is not aggregated after extraction from the membrane. Furthermore, buffer screening to determine the detergent, additive, ligand, or polymer that provides the most stabilizing condition for the membrane protein is an important practice. The early characterization of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography provides a powerful tool to assess and rank different constructs or conditions without the requirement for protein purification, and this tool also minimizes the sample requirement. The membrane proteins must be fluorescently tagged, commonly by expressing them with a GFP tag or similar. The protein can be solubilized directly from whole cells and then crudely clarified by centrifugation; subsequently, the protein is passed down a size exclusion column, and a fluorescent trace is collected. Here, a method for running FSEC and representative FSEC data on the GPCR targets sphingosine-1-phosphate receptor (S1PR1) and serotonin receptor (5HT2AR) are presented.

The present protocol describes a procedure to perform fluorescent size exclusion chromatography (FSEC) on membrane proteins to assess their quality for downstream functional and structural analysis. Representative FSEC results collected for several G-protein coupled receptors (GPCRs) under detergent-solubilized and detergent-free conditions are presented.

형광 크기 배제 크로마토그래피를 통한 멤브레인 단백질 품질의 신속한 평가

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...