이 작품은 YM에 버로우즈 웰컴의 인베스티게이터 수상과 MD로 예일 대학에서 브라운 - 콕스 박사 과정 이수 원정대에 의해 지원되었다.

자료 : <ul><li> 단백질 샘플 - 라이 소 자임 (50 MG / ML) </li><li> 드롭 24 잘 트레이를 달아 </li><li> 드롭 24 잘 트레이 앉아 </li><li> Microbatch의 결정 96 잘 트레이 </li><li> 결정화 솔루션 (중 사용 가능한 상업적 또는 집에​​서 만든) </li><li> 실리콘 그리스 </li><li> Luer - 잠금없이 5 ML 주사기 </li><li> Siliconized 커버 슬라이드 </li><li> 광학 씰링 테이프 </li><li> 파라핀 </li><li> 낮은 유지 팁을 0.1-2 μL micropipette </li><li> 족집게 </li><li> 프로 페셔널 쳐줍니다 </li></ul> 1. 한깅 / 드롭 절차를 돌보기 : <ol><li> 초기 화면 하나는 시험 조건의 스파스 행렬 불완전한 요소 방법을 이용 상용 화면을 사용할 수 있습니다. 스파스 매트릭스 불완전 요소 방법으로 편견과 macromolecules 알려져 결정화 조건 (카터와 카터, 1979; Cudney 외, 1994;. Jancarik과 김, 1991;. Jancarik 외, 1991)에서 선택됩니다. 결정화 조건이 이미 알려져있는 경우, 좁은 화면이 원래 공격 주변 침전제 농도와 산도 변화, 조립하실 수 있습니다. 가장 일반적으로 성공적인 침전제는 암모늄 황산 다음 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)입니다. 함께 결정 (길리 랜드 외, 1994.; 킴버 외, 2003;.. 페이지 외, 2003)에 사용되는 모든 기록 macromolecular의 precipitants의 약 60 %를 두 precipitants 계정. </li><li> 당신의 결정 솔루션을 준비합니다. 보통 이러한 조건은 precipitating 대리인, 일종의 소금과 산도를 설정하는 버퍼에서 결합됩니다. 어떤 경우에는 첨가제가 관심의 단백질을 위해 특별히 추가할 수 있습니다. 모든 주식 솔루션은 0.22 μm의 필터를 사용하여 필터링해야합니다. 주식 솔루션의 일부 (50 % 펙스, 글리세롤, PEG - MME 등) 매우 점성 수 있습니다. <ul><li> 0.6 1.5 ML, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 0.1 M NaOAc 산도 4.0, 4.3, 4.6 및 4.9에서 1.6 M NaCl을 각각 (24 솔루션 총) 준비 </li></ul></li><li> 귀하의 단백질 샘플을 녹여 얼음 계속. 관심의 단백질 (그렇다면, 4 저장 ° C) / 해동 사이클을 멈추고 민감한되지 않는 단백질 주식은 -80 ° C에서 저장해야합니다. 일반적인 단백질 농도가 높은 농도는 일반적으로 더 나은 결과를 제공과 함께, 50-50 MG / ML의 범위에 있습니다. </li><li> 어떤 단백질은 해동 단계 이후 부분적으로 집계하고 침전하는 경향 - 15min/18이 000xg / 4 ° C 샘플을 스핀. 이러한 집합체 따라서 철저한 스핀은 아래로 당신의 예제에서만 용해 분자를 보증합니다 단백질 분자의 나머지 비정질 강수​​를 홍보할 수 있습니다. 트레이를 설정까지 얼음에 단백질 보관하십시오. </li><li> UV 분광 광도계를 사용하여 280 nm의 흡광도에서 자사의 단백질 농도를 결정합니다. 단백질 농도는 흡광도 읽고 단백질의 흡광 계수로부터 계산하실 수 있습니다. : 흡광 계수는 Expasy 웹사이트에 ProtParam 도구를 사용하여 계산할 수 <a href="http://ca.expasy.org/tools/protparam.html">http://ca.expasy.org/tools/protparam.html</a> </li><li> 24 잘 매달려 / 트레이 설치 방식 (그림 2B)에 따라 침전제 솔루션을 500 μL와 드롭 트레이를 돌보기의 우물을 입력합니다. 우물의 가장자리 주위에 실리콘 그리스 반지를 만듭니다. 반지는 잘가 봉쇄로 공기 압력 상승을 방지하기 위해 작은 간격이 있어야합니다. 앉아 방울에서, 잘가 (그림 2A) 테이프로 밀봉되어 있기 때문에 그리스에 대한 필요가 없습니다. </li><li> 커버 슬라이드를 타고 압축된 공기 스프레이, 또는 닦아 전문으로 청소 - 피하 먼지가 결정화 드롭의 해석을 쉽게하고 contaminations을 제거합니다. 방울을 앉아 들어, 표지 슬라이드가 사용되지 않습니다. 대신, 잘은 단백질과 침전제가 혼합되는 선반이 포함되어 있습니다. </li><li> 표지 슬라이드에서 단백질 샘플 및 저수지 솔루션의 동일한 볼륨을 넣어. 단백질과 침전제 서로 다른 볼륨이 최적화 프로세스의 일부로 재판을받을 수 있습니다. 희석 단백질 샘플 바람직 수 있으며, 결정 핵이나 성장을 늦추기 위해 평균 후 드롭에 단백질의 그물 농도 침전제 결과보다 더 많은 단백질을 사용합니다. 드롭 솔루션의 다른 비휘발성 물질도 같은 요소를 기준으로 집중됩니다. 표지 슬라이드에 단백질과 저수지 솔루션을 pipetting 때, 거품 형성을 피하기 위해 매우주의하십시오. 이것은 종종 공기가 피펫의 터져 경우에 발생합니다. <ul><li> 표지 슬라이드의 중심에 0.02 M NaOAc의 산도 4.9 50 MG / ML 라이 소 자임의 부하 2 μL하고 그것에 저수지 솔루션 2 μL를 추가 드롭 한깅. </li><li> 드롭 시팅 : 하중 선반의 중앙에 50 MG / ML 라이 소 자임 솔루션 2 μL하고 그것에 저수지 솔루션 2 μL를 추가합니다. </li></ul></li><li> 부드럽게 커버 슬라이드를 전환하고 잘 위에 기름 링에 누워. PR에 기름에 부드럽게 이렇게 공기가 노치를 통해 우물에서 탈출 수 눌러이벤트 공기 압력 우물에 상승과 유지는 잘 밀봉. 물론 공기 압력 상승은 잘 밀봉을 손상, 커버 슬라이드를 올릴 수 있습니다. 앉아서 드롭 방식에서 광학 맑은 투명 테이프는 우물을 커버하는 데 사용됩니다. 따라서이 방법 씰링의 모든 행 / 열 배치됩니다. </li><li> 트레이가 완료될 때까지 다음 잘로 이동합니다. </li><li> 설치시 트레이를 확인 - 먼지 입자와 기타 contaminations을 제거하는 단백질 결정의 거짓 긍정적인 인식을 줄일 수 있습니다. </li><li> 실험을 문서에 점수 시트를 사용합니다. </li><li> 일반적으로 4 ° C 룸 온도 사이에 원하는 부화 온도에 트레이를 놓습니다. 20 ° C는 가장 일반적으로 성공합니다. 부드럽게 트레이를 처리하고 떨고 않도록 조심해. 개방과 보육의 문을 닫는 동안주의하십시오. 양도하거나 배양 중에 진동이나 온도 변화가 크리스탈 성장을 예방하거나 부정적인 수정 품질에 영향을 줄 수 있습니다. 재료 (예 : 포장 거품)을 흡수하는 충격은 크리스탈 쟁반에 따라 패딩으로 사용할 수 있습니다. </li><li> 결정에 대한 트레이 다음날을 확인 후 수일마다 항상주의 트레이를 취급. 트레이 특정 점수 시트에 결과와 드롭 morphologies를 문서. 크리스탈 가끔 훨씬 빨리 (즉시) 또는 그 이상 (최대 몇 개월까지!) 표시하지만 크리스탈은 일반적으로, 표시 2~5일 가져가라. 결정화 조건이 확인된과 결정의 성장 속도가 알려져 있습니다 일단 결정이 등장하고 그들의 최종 크기의 적어도 절반 성장 때까지, 그것은 쟁반은 그대로두고하는 것이 좋습니다. 트레이가 그대로두면 따라서 큰 결정의 작은 숫자를 생산, 크리스탈 핵 이벤트의 수를 줄일 수 있습니다. </li></ol> 2. 절차 Microbatch : <ol><li> 단백질 샘플과 침전제 준비는 위에서 설명한 것처럼됩니다. </li><li> 에어 스프레이 새로운 microbatch 트레이는 먼지와 다른 큰 입자를 피할 수 있습니다. </li><li> microbatch 트레이에 높은 3mm (우물을 충당하기 위해 충분)에 파라핀 오일을 채우십시오. 오일의 액세스를 제거합니다. </li><li> 물론 미리 채워진 오일에 단백질 용액 (50 MG / ML 라이 소 자임) 1 μL를 로드할 - 잘 하단 (그림 2A)에 직접 솔루션을 피펫에 있는지 확인하십시오. </li><li> 드롭은 단백질 비말로 잘와 퓨즈의 바닥에 가라앉아 있는지 확인 - 잘 트레이 설치 방식 (그림 2B)에 따라로 침전제 솔루션 1 μL를로드합니다. </li><li> 트레이가 완료될 때까지 다음 잘 이동합니다. </li><li> 따라가 매달려 / 드롭 절차를 돌보기의 11-14 단계를 반복합니다. </li></ol> 3. 대표 결과 : 결정은 일반적으로 X - 레이 crystallography의 병목 현상이라고합니다. precipitating 조건의 스파스 행렬 불완전한 요소 화면은 일반적으로 큰 단일 결정 중에서 단백질 집합과 석출 다양한 종류를 생산하고 있습니다. 단백질이나 침전제 농도가 너무 높은 경우 하나는 불분명하다 모양과 크기 (비정질 강수​​량)와 갈색 문제를 볼 수 있습니다. 솔루션 undersaturated 때, 드롭은 종종 침전의 모든 종류의 완전히 명확하고 찾아볼 것입니다. 그림 3은 석출 현상과 결정 (데싸우 외., 2006)에 대한 몇 가지 예제를 보여줍니다. 자세한 해석과 함께 더 많은 강수량 현상은에서 찾을 수 있습니다 <a href="http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html">http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html</a> . <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 단백질 결정의 원칙. 단백질 결정의 원칙. 증기 확산 실험 (A) 침전제과 단백질 같은 볼륨 드롭에 존재한다. 물 밖으로 확산되며 평형은 드롭과 저수지 솔루션 사이의 달성 때까지 침전제 및 단백질 농도가 모두 두 배로됩니다. 배치 결정에 (B) 침전제 및 단백질 농도는 실험 기간 동안 변경되지 않습니다. 포인트 - 단백질은 더 크리스탈은, 포인트 B를 형성 수 없습니다 undersaturated 유지 - 단백질 핵이 발생, 수정은 양식에 시작 및 솔루션에서 단백질의 농도는 포화에 방울. 포인트 C는 - 단백질 precipitates하지만 결정은 여전히​​ 성장 수 있습니다. 사용 (C) 투석 결정 모세관 젤은 - 연결. 소금이 젤 플러그에 걸쳐 (및 / 또는 침전제 diffuses 단백질 샘플에) 단백질 샘플 밖 diffuses로 수정이 나타납니다. <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 전형적인 단백질 결정화 실험의 개요. 드롭 증기 확산을 매달려 드롭 증기 확산을 앉아하고, microbatch 단백질 결정화에 대한 (A) 절차. 각각의 경우에, 집중 단백질 샘플의 작은 볼륨 precipitan의 같거나 작은 볼륨 혼합t 솔루션과 평형 수있었습니다. (B) 닭고기 라이 소 자임, 2​​4 잘 트레이의 결정에 대한 나트륨 염화물의 다양한 농도 (침전제)과 다양한 PHS에서 버퍼로 0.1 M의 아세트산 나트륨 (- 4.9 4.0)로 설정됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 단백질 결정화 실험의 일반적인 결과. (A) 아몰퍼스 강수량은. 단백질 또는 침전제 (또는 둘 모두) 고농도에 때. (B) 단계 분리. 고농도에서 특정 precipitants과 혼합하면 단백질이나 세제는 다른 단계로 분리 수 있습니다. (C) AtCSN7의로드 모양의 단백질 결정은 폴리에틸렌 글리콜 8000 년 및 마그네슘 아세테이트를 (데싸우 외., 2006) 획득. (D) 라이 소 자임의 결정 1.0 M NaCl과 아세트산 나트륨의 산도 4.9에서 얻어진. (E) 포화 방울에서 일반적으로 분명 남아 있습니다. 모세 데싸우의 사진.

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	<li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , (1999).</li><li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+using+incomplete+factorial+experiments.">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li><li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth.">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li><li>Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression,+purification+and+crystallization+of+a+PCI+domain+from+the+COP9+signalosome+subunit+7+(CSN7).">Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7).</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).</li><li>Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Macromolecule+Crystallization+Database,+Version+3.0:+new+features,+data+and+the+NASA+archive+for+protein+crystal+growth+data.">Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).</li><li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparse+matrix+sampling:+a+screening+method+for+crystallization+of+proteins.">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).</li><li>Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+study+of+the+ligand-binding+domain+of+the+bacterial+chemotaxis-mediating+aspartate+receptor+of+Salmonella+typhimurium.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium.</a> J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).</li><li>Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+mining+crystallization+databases:+knowledge-based+approaches+to+optimize+protein+crystal+screens.">Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens.</a> Proteins. 51, 562-568 (2003).</li><li>Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+growth+of+proteins,+nucleic+acids,+and+viruses+in+gels.">Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels.</a> Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Crystallization of biological macromolecules. , (1999).</li><li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li><li>Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+crystallization+strategy+for+structural+genomics:+an+optimized+two-tiered+crystallization+screen+against+the+Thermotoga+maritima+proteome.">Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 문서에서 우리는 단백질 결정화에 대한 일반적인 현재의 프로토콜을 설명하고 보여줍니다. 그 다단계 절차부터 몇 가지 고려 사항에 대해 알고 있어야 한 필요가있다. 증발로 인해 드롭의 건조 아주 작은 볼륨 (0.5-2 μL)과 함께 작업할 때하는 것은 중요한 관심사입니다. 따라서 그것은 잘 통제된 환경에서 작동하는 (낮은 공기 흐름, 높은 습도와 꽉 온도 제어)와 야외에있는 드롭의 노출을 최소?...

<table border="1">
		<tbody>
<tr>
<td>New Item</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>L6876-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well VDX Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-142</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well Cryschem Plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-158</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Dow Corning Vacuum Grease</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-510</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>Siliconized glass circle coverslides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-231</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>100% paraffin oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-411</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-511</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr>
<tr>
<td>96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton research</td>
<td>HR3-098</td>
<td>&nbsp;</td>	</tr>	</tbody>
		</table>

protein crystallization for x-ray crystallography

그들이 작동하는 방법 추론하기 위해 생물 학적 macromolecules의 3 차원 구조를 사용하는 것은 현대 생물학의 가장 중요한 분야 중 하나입니다. 원자 해상도 구조의 가용성 단백질 기능의 깊이와 독특한 이해를 제공하고, 살아있는 세포의 내부 동작을 해명하는 데 도움이됩니다. 날짜하려면, 단백질 데이터 은행 (rcsb - PDB) 항목의 86 %가 X - 레이 crystallography를 사용하여 결정 macromolecular 구조입니다. crystallographic 연구에 적합한 결정을 얻으려면,이 macromolecule (예 : 단백질, 핵산, 단백질 - 단백질 복합 단백질이나 핵산 복합) 균질성을 정화해야하며, 가까이 가능한 균등 수 있습니다. 준비의 균질성는 (; 맥퍼슨 1999 Bergfors, 1999) 높은 해상도로 분해하다 결정을 얻기에있는 중요한 요인이다. 결정은 과포화에 macromolecule을 가져 필요합니다. 샘플 따라서 집합 또는 macromolecule (보통 20-50 MG / ML)의 강수량을 유발하지 않고 가능한 가장 높은 농도로 집중해야합니다. precipitating 대리인에게 샘플을 소개하는 솔루션에서 성장하는 대형 입체적인 결정이 발생할 수 있습니다 솔루션에 단백질 결정의 핵을 홍보할 수 있습니다. 수증기 확산 및 배치 결정 : 결정을 얻는 두 가지 주요 기술이 있습니다. 수증기 확산, 침전제 및 단백질 솔루션의 혼합물을 포함하는 드롭 순수한 침전제있는 챔버에 봉인합니다. 드롭과 침전제의 osmolarity가 (그림 1A) 동일 때까지 수증기 그 다음 드롭 아웃 diffuses. 평형이 달성 때까지 드롭의 탈수는 이상적인 위상 다이어그램의 결정 핵의 영역에, 단백질과 침전제 모두 느린 농도가 발생합니다. 배치 방법은 침전제의 해당 금액을 (그림 1B)와 혼합 단백질에 의해 직접 핵 영역에 단백질을 가져에 의존합니다. 이 방법은 일반적으로 드롭 밖으로 물의 확산을 방지하기 위해 파라핀 / 미네랄 오일 혼합에 따라 수행됩니다. 우리가 기름을 아래에 배치 결정 이외에 드롭하고 앉아 드롭 매달려, 증기 확산을위한 실험 설정의 두 종류를 보여줄 것입니다.

Crystallization is usually referred to as the bottleneck of X-ray crystallography. A sparse matrix incomplete factorial screen of precipitating conditions typically produces many different types of protein aggregation and precipitation, among them large single crystals. If the protein or precipitant concentrations are too high one can see brown matter with no distinct shape and size (amorphous precipitation). When the solution is undersaturated, the drop will often be completely clear and devoid of any kind of precipitat...

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Protein Crystallization for X-ray Crystallography

분자의 3 차원 구조는 어떻게 분자 기능의 독특한 이해를 제공합니다. 가까운 원자 해상도 구조 결정을위한 주요 방법은 X - 레이 crystallography입니다. 여기서는 X - 레이 crystallography에 의해 구조 결정에 적합 특정 macromolecule의 세 차원 결정을 얻기위한 현재의 방법을 보여줍니다.

X - 선 Crystallography에 대한 단백질 결정화

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

protein-crystallization-for-x-ray-crystallography

Research

JoVE Journal

Biology

62.8K 조회수.  Yale University. 분자의 3 차원 구조는 어떻게 분자 기능의 독특한 이해를 제공합니다. 가까운 원자 해상도 구조 결정을위한 주요 방법은 X - 레이 crystallography입니다. 여기서는 X - 레이 crystallography에 의해 구조 결정에 적합 특정 macromolecule의 세 차원 결정을 얻기위한 현재의 방법을 보여줍니다.

비디오: Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

싱크로 트론 - X - 레이 - tomography를 사용하여 서브 마이크론 해상도로 비침습 3D - 시각화

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

연구

생물학

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

전자 Crystallography에 의해 구조 생물학 연구에 대한 작은 막 단백질의 2 차원 결정화 평가판을 평가

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Lipidic Bicelle 방법을 사용하여 막 단백질의 높은 처리량 결정

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

3D Printing of Preclinical X-ray Computed Tomographic Data Sets

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing. Traditional, mold-injection methods to create models or parts have several limitations, the most important of which is a difficulty in making highly complex products in a timely, cost-effective manner.1 However, gradual improvements in three-dimensional printing technology have resulted in both high-end and economy instruments that are now available for the facile production of customized models.2 These printers have the ability to extrude high-resolution objects with enough detail to accurately represent in vivo images generated from a preclinical X-ray CT scanner. With proper data collection, surface rendering, and stereolithographic editing, it is now possible and inexpensive to rapidly produce detailed skeletal and soft tissue structures from X-ray CT data. Even in the early stages of development, the anatomical models produced by three-dimensional printing appeal to both educators and researchers who can utilize the technology to improve visualization proficiency. 3, 4 The real benefits of this method result from the tangible experience a researcher can have with data that cannot be adequately conveyed through a computer screen. The translation of pre-clinical 3D data to a physical object that is an exact copy of the test subject is a powerful tool for visualization and communication, especially for relating imaging research to students, or those in other fields. Here, we provide a detailed method for printing plastic models of bone and organ structures derived from X-ray CT scans utilizing an Albira X-ray CT system in conjunction with PMOD, ImageJ, Meshlab, Netfabb, and ReplicatorG software packages.

Using modern plastic extrusion and printing technologies, it is now possible to quickly and inexpensively produce physical models of X-ray CT data taken in a laboratory. The three -dimensional printing of tomographic data is a powerful visualization, research, and educational tool that may now be accessed by the preclinical imaging community.

잠복기 X-선 계산 된 단층 데이터의 3D 인쇄 설정

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing.  Traditional, ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

임의 Microseed 매트릭스 심사에 의해 단백질 결정화의 성공률을 향상

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...