The authors thank Drs. Jeffrey Bloomquist and Daniel Swale for their technical comments and suggestions. This project was partially funded by the Department of Entomology and the College of Agriculture and Life Sciences at Virginia Tech.

1. 수집 및 시험 과목의 준비 <ol><li> 식민지에서 꿀벌의 해당 번호를 수집합니다. 주 : 필요한 수의 크기와 실험의 범위뿐만 아니라, 조사원의 기술뿐만 의존한다. 두 치료 그룹은 그룹 당 10 벌의 원하는 샘플 크기가있는 경우 예를 들어, 합리적으로 숙련 된 연구자가 실패 해부을 설명하고 득점 20 유용한 동영상을 끝내고 적어도 30 벌을 수집 할 수 있습니다. </li><li> 수집 및 절개 사이를 통과하는 시간을 최소화한다. 주 : 꿀벌이 일전 박리에 대해 실험에 수납 할 수 있지만, 해부의 성공률 (해부 등쪽 용기 안정적인 심박수를 유지할 가능성이 IE) 시간에 대하여 감소하는 것으로 관찰되었음을 꿀벌은 멀리 식민지에서 수용된다. <ol><li> 실험실에 보관하면서 물과 음식의 소스와 꿀벌을 제공합니다. 엑사에 대한mple 최소한 (이보다 6 시간의 기간에 충분하다) 물 수크로오스 용액 (V / w) 50 %에 대한 액세스를 제공한다. 오랜 기간 동안, 꿀벌은 꿀에 대한 액세스를 제공합니다. </li><li> 약 32 ° C 60-80 %의 상대 습도의 온도에서 랩 하룻밤 하우스 꿀벌은 스트레스를 감소시키고 탈수를 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 이전 해부에, 처리에 도움을 간략하게 벌을 마취. 주 :이 해부의 성공률을 감소시키고 처리량을 감소시킬 수있다. <ol><li> 얼음에 그들을 배치하거나 그냥 충분히 처리에 도움이하기 위해 이동을 감소하기위한 냉장고에 하나 꿀벌을 진정. </li><li> 또는 간단히 처리에 도움이하기 위해 CO 2에 꿀벌을 노출. 참고 : 감기에 확장 노출 해부의 성공률을 감소시킬 수있다. 특별 또는도 해부의 성공 확률을 줄일 수 CO 2 노출을 반복했다. </li></ol></li></ol> 2. 해부지느러미 복부 벽의 참고 : 꿀벌 해부의 시간에 살아 있어야한다. <ol><li> 집게 및 / 또는 미세 절제 위, 제거 다리와 날개를 사용하여 복부의 절개를 용이하게한다. 작은 비커 또는 해부 사이에 악기를 세척하기위한 목적으로 인근 증류수로 채워진 유사한 용기를 보관하십시오. </li><li> 집게로 꿀벌을 억제하면서, 제 1 및 제 2 tergites의 등쪽 복벽을 따라 횡 방향으로 절단하기 위해 미세 절제 가위를 이용 (도 1 참조). </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55029/55029fig1.jpg" /> 그림 1 : 꿀벌의 복부 지느러미 볼 수 있습니다. 빨간 선으로 표시된 바와 같이 초기 절개, 제 1 및 제 2 tergites 사이에해야한다. 스케일 바 = 1mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig1large.jpg" target="_blank">그녀를 클릭하세요</a>전자는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <ol start="3"><li> 가볍게 집게 제 tergite의 후방 모서리를 파지하는 동안 바늘의 초기 절개에서 벌의 각각의 측면을 따라 길이 방향으로 절단 (도 2 참조). 위장관 천공 방지하기 위해 절단시주의하십시오. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55029/55029fig2.jpg" /> 그림 2 : 꿀벌의 복부의 측면보기. 적색 선으로 나타낸 바와 같이 두번째와 세번째 절개는 복부 쪽 함께 이루어져야한다. 스케일 바 = 1mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="4"><li> 미세 집게의 두 번째 세트 가위를 교환하고주의 깊게 나머지 오에서 지느러미 복부 벽을 분리하도록 활용복부 바. 조심스럽게 바늘과 지느러미 복부 벽에 부착 된 상태로 유지 위장관의 일부를 제거합니다. 내용이 지느러미 용기의 시각화를 방해 코트 복벽을하고 같이 장을 파열하지 마십시오. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55029/55029fig3.jpg" /> 그림 3 : 지느러미 용기의보기. 창자와 바늘이 제거되고 나면, 지느러미 용기는 해부 등의 복부 벽의 중간 선을 따라 볼 수 있습니다. 스케일 바 = 1mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55029/55029fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="5"><li> 지느러미 용기 볼 수 있도록 카메라 밑의 원하는 방향으로 지느러미 복벽을 배열 (도 3 참조). 초과 AB를 멀리 트림하는 미세 절제 가위 활용지느러미 용기의 시각화를 방해 dominal 벽. 제대로 자리 잡고 때 지느러미 복부 벽의 형태는 얕은 컵이나 그릇과 유사합니다. <ol><li> 지느러미 선박이 꿀벌의 후퇴 한계 복부 세그먼트로 확장되지 않기 때문에, 지느러미 용기의 시각화를 개선하기 위해 최종 tergite를 제거합니다. </li></ol></li><li> 조정 볼륨 마이크로 피펫을 활용, 생리적 조건을 유지하고 지속적으로 심장 박동을 촉진하기위한 등장 성 용액 10 μL와 지느러미 선박을 커버합니다. 주 : 권장 해결책이 분기 강도 링거 용액 (0.120 g / 리터, 칼슘 클로라이드, 0.105 g / L 염화칼륨, 0.050 g / L 중탄산 나트륨, 및 2.250 g / L 염화나트륨) 안정을 촉진하는 것으로 밝혀졌다, 연속 하트 비트. </li></ol> 3. 관측 및 심박수의 변조 <ol><li> 안정적이고 지속적인 심장 박동이 달성 될 때까지 등의 용기는 그대로 앉아 허용(일반적으로 300 초 이내). 참고 : 하트 비트는 등의 용기의 리듬 수축으로 가시화된다. 처음에는 꿀벌이 마취 된 특히, 하트 비트 수없는 것으로 나타날 수 있지만, 마음은 보통 몇 분 동안 등장 성 용액에 휴식 후 박동을 다시 시작하고 시간 동안 구타를 계속할 수 있습니다,이 용액에 목욕을 유지 제공. </li><li> 분 (BPM) 당 비트 수의 측면에서 심장 박동수를 측정한다. <ol><li> 60 초의 시간 동안 관찰 수축의 수를 기록한다. 이 과정을 촉진하기 위해 손 집계 카운터 및 타이머를 사용합니다. </li></ol></li><li> 전과 cardiomodulatory 화합물로 처리 한 후에 관찰 BPM을 기록하여 심박수의 변화를 측정한다. 주 : 시간은 시험되는 화합물에 따라 달라질 수 심장 박동수에 영향을 관찰하기 위해 필요하지만, 심박수의 변화는 일반적으로 분 이내에 관찰 할 수있다. <ol><li> 직전 기준 심박수를 결정어떠한 시험 화합물의 첨가. 주 : 치료 후 심박수는 일반적으로 90 내지 120 초 후에 결정될 수있다. </li><li> 지느러미 용기를 목욕하는 데 사용되는 같은 등장 성 용액에 화합물을 용해하여 잠재적 cardiomodulators (예를 들면, 옥토 파민)을 준비합니다. </li><li> micropipetter를 이용하여 지느러미 용기 주변의 용액에 시험 화합물을 추가한다. </li></ol></li><li> 높은 정확도 및 높은 처리량의 경우, 각 시험 대상의 비디오 녹화를 만든 다음 나중에 심장 박동의 점수에 동영상을 사용합니다. 참고 :이 동영상의 거의 연속 생산을 촉진하기 위해 해부를 비틀 수있는 단일 조사를 할 수 있습니다. 비디오를 녹화 할 경우, 최소 권장 길이는 시험 화합물과 약 240 초 60 초 마크에서 추가되는 것입니다. 이 조사는베이스 라인 심박수 다음 후 처리 심박수 120 초를 기록하는 또 다른 60 초 창을 처치 60 초 창이 있는지 확인합니다치료 후. </li></ol>

<ol>
	<li>Klowden, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulatory+Systems.">Circulatory Systems.</a> Physiological Systems in Insects, 3rd Edition. , 365-413 (2013).</li><li>League, G. P., Onuh, O. C., Hillyer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+structural+and+functional+analysis+of+the+larval+and+adult+dorsal+vessel+and+its+role+in+hemolymph+circulation+in+the+mosquito+Anopheles+gambiae.">Comparative structural and functional analysis of the larval and adult dorsal vessel and its role in hemolymph circulation in the mosquito Anopheles gambiae.</a> J Exp Biol. 218 (Pt 3), 370-380 (2015).</li><li>Wasserthal, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillating+Hemolymph+Circulation+in+the+Butterfly+Papilio-Machaon+L+Revealed+by+Contact+Thermography+and+Photocell+Measurements.">Oscillating Hemolymph Circulation in the Butterfly Papilio-Machaon L Revealed by Contact Thermography and Photocell Measurements.</a> J Comp Physiol. 139 (2), 145-163 (1980).</li><li>Wasserthal, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+circulation+and+tracheal+ventilation+in+holometabolous+insects.">Interaction of circulation and tracheal ventilation in holometabolous insects.</a> Adv Insect Physiol. 26, 297-351 (1996).</li><li>Schwab, E. R., Chilson, R. A., Eddleman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heartbeat+Rate+Modulation+Mediated+by+the+Ventral+Nerve+Cord+in+the+Honey-Bee,+Apis-Mellifera.">Heartbeat Rate Modulation Mediated by the Ventral Nerve Cord in the Honey-Bee, Apis-Mellifera.</a> J Comp Physiol B-Biochem Syst Environ Physiol. 161 (6), 602-610 (1991).</li><li>Kaiser, W., Weber, T., Otto, D., Miroschnikow, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+supply+of+the+heart+and+electrocardiogram+potentials+with+reversed+polarity+in+sleeping+and+resting+honey+bees.">Oxygen supply of the heart and electrocardiogram potentials with reversed polarity in sleeping and resting honey bees.</a> Apidologie. 45 (1), 73-87 (2014).</li><li>Papaefthimiou, C., Theophilidis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octopamine--a+single+modulator+with+double+action+on+the+heart+of+two+insect+species+(Apis+mellifera+macedonica+and+Bactrocera+oleae):+Acceleration+vs.+inhibition.">Octopamine--a single modulator with double action on the heart of two insect species (Apis mellifera macedonica and Bactrocera oleae): Acceleration vs. inhibition.</a> J Insect Physiol. 57 (2), 316-325 (2011).</li><li>Castro, C. A., Hogan, J. B., Benson, K. A., Shehata, C. W., Landauer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral-Effects+of+Vehicles+-+Dmso,+Ethanol,+Tween-20,+Tween-80,+and+Emulphor-620.">Behavioral-Effects of Vehicles - Dmso, Ethanol, Tween-20, Tween-80, and Emulphor-620.</a> Pharmacol Biochem Behav. 50 (4), 521-526 (1995).</li><li>Papaefthimiou, C., Papachristoforou, A., Theophilidis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biphasic+responses+of+the+honeybee+heart+to+nanomolar+concentrations+of+amitraz.">Biphasic responses of the honeybee heart to nanomolar concentrations of amitraz.</a> Pestic Biochem Phys. 107 (1), 132-137 (2013).</li><li>Roeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Octopamine+in+invertebrates.">Octopamine in invertebrates.</a> Prog Neurobiol. 59 (5), 533-561 (1999).</li><li>Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Drosophila+heartbeat+by+neurotransmitters.">Modulation of Drosophila heartbeat by neurotransmitters.</a> J Comp Physiol B. 167 (2), 89-97 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect5 or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel7, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin...

이 방법의 전반적인 목표는 연구자 빠르고 쉽게 관찰 및 약리 에이전트가 꿀벌의 심박수에 미치는 영향을 정량화 할 수 있도록하는 것입니다. 꿀벌은 다른 곤충처럼 hemocoel로 알려진 체강, 전반에 걸쳐, 체액, 혈액의 곤충 해당하는 발신 개방 순환 시스템을 가지고있다. 체액의 순환 영양분 면역 인자 폐기물뿐만 아니라 신경 호르몬 및 다른 시그널링 분자 (1)의 전송을 위해 필수적이다. 순환은 곤충의 지느러미 중간 선뿐만 아니라 액세서리 타악기 기관을 따라 연장 등의 용기에 의해 촉진된다. 지느러미 용기,이 기능적으로 별개의 섹션으로 나누어 복부에 심장 및 흉부와 머리에 대동맥 지정됩니다. 흉부와 머리를 향해 심장 펌프 체액에 전파 수축, 액세서리 박동 기관 사지에 체액의 흐름을 보장하면서. <p클래스 = &quot;jove_content는&quot;&gt; 곤충 심장 기능은 곤충의 크기 생리학 또는 생명 단계에 따라, 다양한 방법을 이용하여 관찰 될 수있다. 유충 이하 곤충의 심장 박동을 관찰하기위한 일반적인 방법은 생체 내에 촬상이 사용된다. 그것은 명확히 복벽을 통해 척수 용기를 확인하기 어려울 수 그러나,이 방법은 성인 꿀벌 덜 유용하다. 곤충 포함 꿀벌 다양한 심박수를 기록하는 방법은 확립 심장 맥동 3,4 검출하는 곤충의 외부에인가 서미스터를 이용한 온도 측정 접점의 사용이다. 성인 꿀벌 심박수 또한 온 저항 신호 4,5-를 측정하는 전기 생리 학적 기술을 사용하여 기록되었다. 이 방법은 심장 다음 동물에 전극의 삽입 및 하트 비트 (4)를 기록하는 임피던스 변환기의 사용을 필요로한다. 마찬가지로, 심전도은 detec하는데 사용되어왔다심장에 의해 생성과 심장 활동 (6)의 변화를 관찰하기 위해 꿀벌의 비디오 녹화와 결합 된 전기 신호에서 t. 이러한 접근 방식에 대한 뚜렷한 장점은 심장 박동이 아니라 주제에 생리적 반응의 전체 범위의 가용성을 보장하는 데 도움이 해부 표본,보다, 손상되지 않은, 살아있는 꿀벌에서 평가된다는 점이다. 이러한 방식의 문제점은 피사체 심박수를 변경할뿐만 아니라 약학 제제를 테스트 할 때, 적절한 전송 방법을 결정하는 수 밖에 변수 및 자극을 제한 할 필요가 고정화 또는 마취 회계를 포함한다. 꿀벌 심장 활동을 연구에 사용 된 또 다른 접근은 부분적으로 강제 변위 센서 (7)를 사용 등쪽 혈관 수축이어서, 심장을 노출 측정하기 위해 곤충 해부한다. 이 프로토콜에서, 마음은 계속 실행 생리 식염수 및 테스트 공동으로 목욕mpounds 피사체 7 응용 프로그램이 용액에 용해 될 수있다. 이 방법은 이들 전술 사이에 상당한 차이가 복부 신경 코드는 중추 신경계는 심장 박동 조절 5에서 재생되었음을 나타내는 역할을 제거하는 제거된다는 것이다. 그 결과, 일반적으로 매우 불안정하다 기준선 하트 비트가 훨씬 낮은 주파수에서 안정 및 진폭보다 전형적으로 살아있는 곤충 5,7-에서 관찰된다는 것이다. 어떻게 이들 모든 방법은 공통점을 실시하기 위하여, 전문이 일정 수준에 더하여, 고도의 전문 종종 고가의 장비를 필요로한다는 것이다. 아마도 가장 큰 단점은 이들 접근법 중 어느 것도 특히 이러한 잠재적 cardiomodulatory 화합물의 라이브러리를 스크리닝 피험자 다수시키는 테스트 실험에 적합하지된다는 것이다. 여기에 설명 된 접근 방법의 가장 큰 장점단순이다. 프로토콜은 작은 설치 공간을 필요로 마스터 비교적 용이하고, 단지 최소한의 금융 입력이 필요하다. 상기 방법은 몇몇 꿀벌 몇몇 수술 도구, 등장액보다 조금 더 필요로하고, 디지털 현미경, 디지털 카메라 전통적인 현미경 하나. 꿀벌 지느러미 용기를 시각화하는 해부하고, 디지털 비디오는 이전과 약리 에이전트와 치료 후 심장 박동을 기록하는 데 사용됩니다. 비디오 기록은 심박수의 변화를 관찰하기 위해 실제로 필요한 것은 아니지만 크게 처리량을 증가 (즉, 주어진 시간에 처리 할 수있는 환자 수). 조사관은 한 번에 동영상의 큰 숫자를 기록하고 나중에 더 편리한 시간에이 동영상을 득점하여 효율성을 극대화 할 수 있습니다. 이 방법의 또 다른 장점은 비디오 연구자가 득점 프로세스가 중단되어야한다, 시작 및 V에 대한보다 쉽게 ​​할 수 있다는 것입니다iewer은 바이어스를 감소시키기 위해 처리를 멀게한다.

<table><tbody><tr><td>Dino-Lite Edge digital USB microscope</td><td>Dino-Lite</td><td>AM4815ZT</td><td>Any digital microscope or similar setup will suffice</td></tr><tr><td>Microscope stand</td><td>Dino-Lite</td><td>RK-10</td><td>Any stand appropriate for the digital microscope</td></tr><tr><td>Laptop or PC</td><td></td><td></td><td>Necessary for digital microscope</td></tr><tr><td>Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades)</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td>Any similar scissors suitable for microdissection will suffice</td></tr><tr><td>Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair)</td><td>World Precision Instruments</td><td>504482</td><td>Any similar forceps suitable for microdissection will suffice</td></tr><tr><td>Ringers solution 1/4 strength tablets&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>96724-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting tray</td><td></td><td></td><td>Any surface suitable for microdissection</td></tr><tr><td>Single channel 10 &amp;micro;l pipette</td><td></td><td></td><td>Any device capable of accurately delivering 10 &amp;micro;l volume</td></tr><tr><td>Pipette tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small beaker or container of water</td><td></td><td></td><td>Used to rinse instruments between subjects</td></tr><tr><td>Hand tally counter</td><td>Office Depot</td><td>295033</td><td>Any similar product will suffice</td></tr><tr><td>Timer</td><td>Office Depot</td><td>644219</td><td>Any similar product will suffice</td></tr><tr><td>Deionized water</td><td></td><td></td><td>Preparation of Ringers solution and rinsing instruments</td></tr></tbody></table>

dissection and observation of honey bee dorsal vessel for studies of cardiac function

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

이 프로토콜을 이용하여 테스트 될 수있는 약리학 적 활성 성분의 대부분은 물에 용해되지 않기 때문에, 이는 시험 화합물이 등쪽 용기 목욕 사용 등장액을 통해 전달 될 수 있도록 신뢰성있는 용매를 가질 필요가있다. 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)는 일반적으로 동물 8 실험 약물 및 다른 화합물을 전달하기위한 수단으로 사용되는 용매이며, 꿀벌 심장 활동 9...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function at JoVE.com

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

심장 기능의 연구에 대한 해부와 벌 꿀 지느러미 선박의 관측

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

dissection-observation-honey-bee-dorsal-vessel-for-studies-cardiac

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K 조회수.  Virginia Tech. The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

비디오: Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

해제 배아 마음에 관상 동맥 혈관의 분석

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

연구

발생학

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

출생 후 심근 세포의 세포주기 변화의 시각화 및 핵의 결정

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

에 잔 심장을 떠올리 Drosophila</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

생물학

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

애벌레의 모니터링 심장​​ 기능 Drosophila melanogaster 생리 연구

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Novel And Efficient Method for Drosophila Heart Fluorescence Staining with Cryosectioning

Drosophila heart models are widely employed in studying cardiac aging and modeling&#160;human cardiac diseases. However, the dissection of Drosophila hearts before imaging is a meticulous time-intensive process that requires advanced training and motor skills. To address these challenges, we present an innovative protocol that utilizes cryosectioning for the fluorescence imaging of Drosophila heart tissue. The protocol has been demonstrated in imaging the adult Drosophila heart but could be adapted for developmental stages. The method enhances both the efficiency and accessibility of fluorescence staining while preserving the integrity of the tissue. This protocol simplifies the process without compromising the quality of imaging, thereby reducing the dependency on technicians with highly developed training and motor skills. Specifically, we replace complex techniques, such as capillary vacuum suction, with more straightforward methods like tissue embedding. This approach allows for the visualization of cardiac structures with greater ease and reproducibility. We demonstrate the utility of this protocol by effectively detecting key cardiac markers and&#160;achieving high-resolution fluorescence and immunostaining imaging that unveils intricate details of heart morphology and cellular organization. This method provides a robust and accessible tool for researchers exploring Drosophila cardiac biology, facilitating detailed analyses of heart development, function, and disease models.

The Drosophila heart sectioning and fluorescence imaging protocol simplifies studying heart structure and pathologies. This approach involves straightforward sectioning, staining, and imaging, bypassing the technical expertise needed for traditional dissection. It enhances accessibility, making Drosophila a more widely usable model for cardiac-related research within the broader scientific community.

Drosophila Heart Fluorescence Staining with Cryosectioning을 위한 새롭고 효율적인 방법

Drosophila heart models are widely employed in studying cardiac aging and modeling&#160;human cardiac diseases. However, the dissection of Drosophila ...

유전학

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

애벌레의 심장 해부, 소년과 성인 Zebrafish, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

심근 성능 및 산소 소비의 연구에 대한 설치류 작업 심장 모델

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Dissection Techniques and Histological Sampling of the Heart in Large Animal Models for Cardiovascular Diseases

The standard gross examination and sampling are key elements in the reproducibility and success of experimental studies of cardiovascular diseases carried out in large animals. Considering the complex anatomy of the heart, interspecies differences, and the types of compensatory and pathological reactions, consistent protocols are challenging to implement. The utilization of multiple dissection protocols is usually adapted to suit the prosector's experience, and personal preference continues to be a source of experimental and interobserver variability. Here, the aim is to present the main anatomical features and landmarks, dissection protocols, and histological sampling standards of the heart in some commonly used species (including dogs, pigs, ruminants, and cats) as models of cardiovascular diseases.
Two standard gross examination protocols are presented here. First, the inflow-outflow method, which follows the physiological blood flow direction through the heart and large vessels (frequently used in dogs, ruminants, and pigs), and second, the four-chamber dissection technique (exemplified in cats). Both techniques can be adapted to any species in certain experimental circumstances. The sampling protocols include all the areas of interest (sinoatrial node, ventricles, interventricular septum, atria, valves, and aorta), and if properly carried out, improve both the reproducibility and reliability of experimental studies.

Due to the complex anatomy, a consistently reproducible dissection and harvesting protocol for cardiac samples can be challenging to implement. This manuscript presents the key elements of some standard cardiac dissection protocols, highlighting both the gross examination approaches and the sampling sites commonly used for histopathologic examination.

심혈관 질환에 대한 대형 동물 모델에서 심장의 해부 기술 및 조직 학적 샘플링

The standard gross examination and sampling are key elements in the reproducibility and success of experimental studies of cardiovascular diseases carried ...

의학

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

Heart Dissection: A Method to Observe Zebrafish Cardiac Development

Source: Singleman C. et. al., <a href="https://www.jove.com/v/3165/" target="_blank">Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio</a>. J. Vis. Exp. (2011).
This video describes a technique of isolating the heart from a zebrafish at multiple developmental stages to study cardiac development, maturation, and ageing.

심장 박리: 제브라피시 심장 발달을 관찰하는 방법

Source: Singleman C. et. al., Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. J. Vis. Exp. (2011).
This video describes a technique ...

심장 기능의 연구에 대한 해부와 벌 꿀 지느러미 선박의 관측

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

해제 배아 마음에 관상 동맥 혈관의 분석

출생 후 심근 세포의 세포주기 변화의 시각화 및 핵의 결정

에 잔 심장을 떠올리 Drosophila

애벌레의 모니터링 심장 기능 Drosophila melanogaster 생리 연구

Drosophila Heart Fluorescence Staining with Cryosectioning을 위한 새롭고 효율적인 방법

애벌레의 심장 해부, 소년과 성인 Zebrafish, Danio rerio

심근 성능 및 산소 소비의 연구에 대한 설치류 작업 심장 모델

심혈관 질환에 대한 대형 동물 모델에서 심장의 해부 기술 및 조직 학적 샘플링

초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (OCM)

심장 박리: 제브라피시 심장 발달을 관찰하는 방법

심장 기능의 연구에 대한 해부와 벌 꿀 지느러미 선박의 관측

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

해제 배아 마음에 관상 동맥 혈관의 분석

출생 후 심근 세포의 세포주기 변화의 시각화 및 핵의 결정

에 잔 심장을 떠올리 Drosophila

애벌레의 모니터링 심장​​ 기능 Drosophila melanogaster 생리 연구

Drosophila Heart Fluorescence Staining with Cryosectioning을 위한 새롭고 효율적인 방법

애벌레의 심장 해부, 소년과 성인 Zebrafish, Danio rerio

심근 성능 및 산소 소비의 연구에 대한 설치류 작업 심장 모델

심혈관 질환에 대한 대형 동물 모델에서 심장의 해부 기술 및 조직 학적 샘플링

초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (OCM)

심장 박리: 제브라피시 심장 발달을 관찰하는 방법

애벌레의 모니터링 심장 기능 Drosophila melanogaster 생리 연구