이 방법은 효모 세포의 구조를 몇 분 동안 3차원으로 추적하여 세포 내 세포기관 및 구획의 역학을 연구할 수 있도록 합니다. 4D 이미징은 특히 일시적인 구조 또는 마커에 대해 세포 내 역학에 대한 신뢰할 수 있는 결론을 도출할 수 있도록 합니다. 절차를 시연하는 것은 나탈리 존슨, 내 실험실에서 포스트 독이 될 것입니다.
우선 23°C에서 좋은 식기와 15 밀리리터 당황 플라스크에서 비형광 합성 정의, 또는 NSD, 매체의 5 밀리리터에 관심효모 균주의 하룻밤 문화를 성장시켜 서 시작하십시오. 분석 3~4시간 전에, 신선한 NSD 배지에서 로그산학상 효모 배양을 희석하여 600나노미터 또는 OD600의 최종 광학 밀도가 이미징 시 0.5 내지 0.8이 되도록 한다. 문화가 준비되기 최소 한 시간 전에, 원심 분리는 밀리리터 Concanavalin A 용액당 2 밀리그램의 알리쿼트에게 5분 동안 최대 속도로, 미립자를 펠렛으로 만들고, 250마이크로리터의 미세입자를 깨끗한 35mm 유리 바닥 현미경 접시에 넣습니다.
15분 후, 세척당 증류수 2밀리리터로 2~3회 세척하여 250마이크로리터의 효모 문화를 말린 후 콩카바렌 A 코팅 접시에 추가합니다. 10분 정도 기다려 세포를 부착한 후 신선한 NSD 배지 2밀리리터로 2~3회 더 부드럽게 세척합니다. 그런 다음 신선한 NSD의 두 밀리리터로 세포를 덮습니다.
효모 세포를 이미지화하려면 공초점 광 현미경에서 최소 1.4의 숫자 조리개를 가진 63X 오일 침지 렌즈를 선택합니다. 여기서는 63X 목표 렌즈 대신 100X 대치 렌즈를 사용할 수도 있습니다. 그런 다음, 침지 오일로 발견 된 객관적인 렌즈에 접시를 놓습니다.
획득 모드 탭의 드롭다운 메뉴에서 xyzt를 선택합니다. XY 탭에서 프레임 크기를 128높이로 256폭으로 포맷합니다. 일반적으로 8킬로헤르츠의 순서에 있는 최대 스캔 속도를 사용합니다.
사용 가능한 경우 양방향 X 스캐닝을 켜고 줌 계수를 9개로 조정하여 픽셀 크기가 약 80나노미터가 됩니다. 100X 목표를 사용하는 경우 확대/축소 계수를 조정하여 약 80나노미터의 픽셀 크기를 유지합니다. 그런 다음 줄 누적을 4~6으로 설정합니다.
핀홀을 1.2 에어유닛으로 설정하고 가능한 경우 백색광 레이저를 켭니다. 그런 다음 각 형광 채널에 대한 흥분 파장 및 백분율 레이저 전력을 설정합니다. 사용 가능한 경우 최대 통합 시간을 선택 해제하여 구성 탭에서 광자 계수 모드를 사용하도록 설정합니다.
각 형광 채널에 대해 고감도 검출기를 할당하고, 방출 파장 범위를 설정하고, 사용 가능한 경우 광자 계수 모드를 켭니다. 유리 접시에서 반사된 빛을 포착하지 않도록 각 형광 채널에 대해 시간 게이팅 창을 0.6~ 10나노초로 설정합니다. 다음으로 밝은 필드 이미징을 켜고 데이터 수집을 위한 저감도 검출기를 선택합니다.
라이브 이미징 모드를 켜고 세포가 명확하게 보일 때까지 밝은 필드 채널에서 게인을 켭니다. 광자 계수 모드에서는 회색 값의 범위를 수동에서 자동으로 변경하여 형광 신호를 봅니다. Z-스택을 설정하여 효모 세포의 전체 부피를 이미지화하고 아래체 슬립쪽으로 이동하도록 이미징의 방향성을 지정합니다.
Z 단계 간격을 0.25 내지 0.35 마이크로미터로 설정하여 Z 스택당 약 20~25개의 광학 섹션을 확보하고, 가능한 경우 갈보 흐름을 켭니다. 일반적인 영화의 경우 Z 스택 사이의 시간 간격을 2초로 설정하고 영화 지속 시간을 5~10분으로 설정합니다. 그런 다음 영화를 LIF 파일로 저장합니다.
영화 디온볼루션의 경우 클래식 최대 가능성 추정 알고리즘을 사용하는 적절한 디온볼루션 소프트웨어 프로그램을 시작하고 데이터 계열을 엽니다. 디온볼루션 마법사 및 매개 변수 편집기를 선택하여 이미징 매개 변수가 감지되고 올바르게 표시되는지 확인합니다. 포함 매체 굴절 지수의 값을 1.4로 변경하여 효모 세포질에 근사합니다.
그런 다음 편집기를 사용하여 커버 슬립 위치를 추정합니다. 확인된 모든 설정 을 선택하고 수락을 클릭하고 마법사 입력을 선택합니다. 다음 화살표를 클릭하여 포인트 스프레드 함수 선택 및 자르기 전 처리 단계를 우회하고 각 형광 채널에 대한 데콘볼루션 마법사를 진행합니다.
계산 로그자리믹 수직 매핑 기능을 선택하고 원시 데이터 형광 강도 프로파일을 검사합니다. 수동을 백그라운드 추정을 위한 모드로 설정하고 백그라운드 값을 입력하고 수락을 클릭합니다. 최대 반복 값을 40으로 두고 예상 신호 대 노이즈 비율을 입력합니다.
그런 다음 표백제 보정을 끄고 Deconvolve를 클릭합니다. 희미한 구조에서 정품 형광을 제거하지 않고 노이즈가 충분히 제거되는 경우, deconvolution 결과 창에서 다음 채널로 수락을 선택합니다. 모든 형광 채널이 만족스럽게 감소되면 모든 채널을 클릭하고 먼저 빨간색 채널을 정렬한 다음 Green, blue 및 밝은 필드 채널을 정렬하여 ImageJ에서 후속 편집을 합니다.
그런 다음 이미지 시퀀스를 8비트 TIF 파일로 저장하고 채널당 하나의 파일을 선택하고 콘트라스트 스트레치를 변환 모드로 선택합니다. 표백제 보정을 위해 deconvolved 이미지 시퀀스를 ImageJ로 가져오고 이미지, 하이퍼스택 및 스택을 하이퍼스택으로 클릭하여 이미지를 하이퍼스택으로 변환합니다. 드롭다운 메뉴에서 xyzct를 선택하고 채널 수, Z 스택 슬라이스 및 기간을 입력합니다.
사진 표백을 위한 형광 채널을 수정하려면 이미지, 색상, 분할 채널을 선택하고 형광 채널의 경우 플러그인, EMBLTools, 표백제 보정 및 지수 적합을 선택합니다. 그런 다음 이미지, 색상 및 병합 채널을 선택하여 밝은 필드와 표백제 보정형 형광 채널을 하이퍼 스택으로 병합하고 후속 영화 생성 및 편집을 위한 절충 및 표백제 보정 하이퍼스택을 8비트 TIF 파일로 저장합니다. 수정된 수정된 데이터 세트를 스케일몽타주로 변환하려면 플러그인, IJ_Plugins 및 몽타주 시리즈 만들기를 선택하고 관련 8비트 하이퍼스택을 선택합니다.
열기 및 확인을 클릭하여 모든 슬라이스가 몽타주를 만드는 데 사용된다는 것을 수락하고 확인을 다시 클릭하여 제안된 배율 계수 값을 수락합니다. 원래 몽타주를 8비트 TIF 파일로 저장하고 플러그인, IJ_Plugins, 몽타주 시리즈를 하이퍼스택과 OK로 선택하여 모든 기간을 포함하는 원래 몽타주에서 4D 하이퍼스택을 만듭니다. 원래 평균 투영 된 동영상을 생성하려면 먼저 플러그인, IJ_Plugins, 프로젝트 하이퍼 스택 및 확인을 선택하여 ZProjection 기본 매개 변수를 수락합니다.
평균 투영 된 영화를 8 비트 TIF 파일로 저장하고 동영상을 검사하여 레이블 링 기간 동안 추적 할 수있는 개별 구조를 식별합니다. 동영상 기간 동안 안정적으로 추적할 수 있는 구조를 식별하고 분석을 위해 해당 구조를 격리하는 것이 절차의 가장 중요한 단계입니다. 그런 다음 플러그인 사용자 가이드의 지침을 따라 몽타주를 편집하여 관심있는 구조를 격리하십시오.
관심 구조를 포함하여 기간 동안 편집된 몽타주에서 4D 하이퍼스택을 만들고 편집된 하이퍼스택을 저장합니다. 편집된 4D 하이퍼스택에서 격리된 구조에 대해 시간이 지남에 따라 형광 강도를 정량화하려면 플러그인, IJ_Plugins 및 편집된 동영상을 분석하고 Z 스택 간의 시간 간격을 입력하고 확인을 클릭합니다. 격리된 구조의 최종 동영상을 만들려면 플러그인, IJ_Plugins 및 프로젝트 하이퍼스택을 선택하고 포함해야 하는 Z 스택 조각을 지정하고 평균 강도를 투영 유형으로 선택하고 확인을 클릭합니다. 편집된 데이터를 통해 원본 데이터와 함께 4D 하이퍼스택을 만들려면 플러그인, IJ_Plugins, 병합 2개의 하이퍼스택 병합 및 먼저 두 번째 위에 배치합니다. 편집된 데이터를 통해 원래 데이터로 4D 하이퍼스택에서 동영상을 생성하려면 플러그인, IJ_Plugins 및 프로젝트 하이퍼스택을 선택하고 포함해야 하는 Z 스택 조각을 지정하고 평균 강도를 투영 유형으로 선택하고 확인을 클릭합니다. 여기서 원시 데이터의 Z 스택 프로젝션의 첫 번째 프레임은 동일한 deconvolved 및 표백제 수정 된 데이터와 비교할 수 있습니다.
동일한 deconvolved 및 표백제 교정 된 영화에서 이러한 프레임은 녹색 바나다테 저항 글리코실레이션 단백질 4 또는 Vrg4 마커와 함께 첫 번째 라벨을 분석 한 두 개의 시스테네를 보여주고 나중에 빨간색 Secretory 7 또는 Sec7 유전자 수송 단백질 마커로 분석되었습니다. 이 몽타주, deconvolved 및 표백 수정 하이퍼 스택에서 만든, 선택한 시스테나 중 하나에서 신호의 격리를 허용하기 위해, 편집 전후 단일 시점에서 모든 광학 섹션을 보여줍니다. 이 그림에서는 투영된 Z 스택의 최종 동영상에서 여러 프레임이 그림 상단에 원래 투영과 함께 표시되고 하단에 편집된 프로젝션이 표시됩니다.
선택한 골기 시스테네에서 녹색 및 빨간색 형광 신호의 정량화는 녹색 Vrg4 마커가 도착하고 약 80 초 동안 지속되는 것을 밝혀, 그 후, 빨간색 Sec7 마커도착및 유지 60 초, 두 마커 사이의 짧은 중복. 이 절차를 수행할 때는 수명 내내 명확하게 추적할 수 있는 구조를 식별하는 것이 중요합니다. 동일한 유형의 분석은 돌연변이 또는 특정 섭류의 다른 유형을 만든 후에 수행될 수 있다.
이 기술은 모델 시스템으로 효모를 사용하여 골기 시스테네와 내피 망막 출구 사이트의 동적 행동을 연구하는 방법을 열었습니다.
