이 작품은 엘리슨 의료 재단에서 MK와 BKK에 부여에 의해 지원되었다. MK는 노화에 엘리슨 의료 재단 신규 장학생입니다. 우리는 촬영하는 동안 도움을 Soumya Kotireddy 감사하고 싶습니다.

파트 1 : replicative 수명 분석을위한 종자 및 플레이트 준비 이 섹션은 replicative 수명 실험 및 수명 분석을위한 효모 세포의 준비에 사용하기 위해 고체 YEPD 접시의 준비에 대해 설명합니다. <ol><li> 적절한 무균 기술을 사용하여 culturing 효모 세포 및 replicative 수명 분석에 사용됩니다 YEPD 한천 플레이트를 (1 % 효모 추출물, 2퍼센트 bacto - 펩톤, 2 %의 한천, 2 % 포도당) 준비합니다. 당신은 수명 실험에서 분석하기 위해 모든 4-5 종자에 대한 최소한 2 접시를 준비한다. 접시는 수명 실험하기 전에 적어도 이일 준비 및 수명 분석을 시작하기 전에 건조 수 있어야합니다. 실험이 번호판을 털어놓지 않는 편입니다 4~5일 이내에 시작하지 않는 경우, 그들은 냉장 배양기에 위치하고 parafilm에 싸여 또는 dessication을 막기 위해 플라스틱해야합니다. </li><li> 냉동 주식 및 YEPD 한천 플레이트에 하나의 식민지에 대한 승리의 효모 종자를 제거합니다. 최대 6 계통에 쉽게 동일 크기의 파이 모양의 웨지로 번호판을 분할하여 동일한 YEPD 접시 줄무늬 수 있습니다. </li><li> 2 일 30 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 신선한 YEPD 접시에 보육 및 단일 식민지에서 패치 세포에서 세포를 제거합니다. 두 개의 다른 식민지에서 두 패치는 각 변형 생성해야합니다. 이때, 분석하는 변종은 dissectors 개별 종자의 신원을 모르는 어디 replicative 수명 실험은, &quot;눈먼&quot;을 수행할 수 있도록 코딩해야합니다. </li><li> 다음날 저녁까지 30 패치, 코딩 세포 ° C를 품어. </li><li> replicative 수명 분석에 사용되는 실험 접시 될 것입니다 신선한 YEPD 접시 각 코딩 변형율에서 세포와 가볍게 패치 세포를 제거합니다. 세포 YEPD 플레이트 (그림 1)의 왼쪽에 세로 라인을 따라 패치가 있어야합니다. 플레이트 약 3-5 패치는 각 패치에서 20 세포의 replicative 수명 분석을 가정, 최적입니다. 이것이 세포가 자신의 후속 replicative 수명을 제한할 수있는 야간 부화 동안 두껍게 성장의 원인이되므로, 신선한 YEPD 접시에 세포의 큰 숫자를 전송할 수 (않으며 바람직하지) 필요하지 않습니다. </li><li> 벤치 위에 밤새 신선한 패치 접시를 품어. </li></ol> 2 부 : replicative 수명 분석을위한 위치 세포. 이 섹션에서 우리는 효모 접시에 세포 및 replicative 수명 분석을위한 처녀 딸 세포를 얻기 위해 위치를하는 방법에 대해 설명합니다. 이 시점에서, 모든 접시가 dessication을 방지하기 위해 절개를받은 경우를 제외하고, parafilmed해야합니다. <ol><li> 효모에 적합한 microdissection 기기 장착된 현미경을 사용하여 패치가 세포로 말초 번호판의 위치에 첫 번째 패치 변형에서 약 50 세포를 전송합니다. 당신의 현미경 스테이지 평점 경우, 이러한 순서는 세포가 이후 반복하는 동안 쉽게 찾을 수 있도록하는 데 사용할 수 있습니다. 자이스 혈구 Axioscope 40, 첫 번째 패치 변형 세포는 좌표 90 X 10에 배치하고 거기에서 수직 못하였 느니라. </li><li> 반복 한천 표면을 만져 세포의 바늘을 청소 후 한천 표면을 통해 바늘을 강제하여 한천에 구멍을 만듭니다. 이 구멍은 절개와 딸 세포 제거의 후속 반복하는 동안 접시 동양 당신에게 마커 역할을합니다. 구멍에있는 효모 세포를하거나 그들이 성장하고 식민지를 형성하지 않도록주의하십시오. </li><li> 직접 구멍 위에 수직으로 각 셀에 위치 (그림 1) 사이 1-3 바늘 지름 (~ 100 μm의)와 20 균등하게 게재 위치로 각각의 효모 세포를 맞춥니다. 모든 세포 몇 아니라보다 라인에 동일한 위치에 서로 인접 두 개는 배치하십시오. 양도 세포 중 하나가 분열하지 않을 경우 이것은 처녀 딸 셀 선택하는 동안 중복을 허용합니다. </li><li> 10 일 및 라인에서 11 일 위치 사이에 한천에 7-8 구멍의 수평 시리즈를 만들 수 있습니다. 이것은 절개와 딸 세포 제거의 후속 반복하는 동안 접시 동양 당신에게 마커 역할을합니다. 구멍에있는 효모 세포를하거나 그들이 성장하고 식민지를 형성하지 않도록주의하십시오. </li><li> 반복은 동일한 축을 따라 세로로 배열 세포 계속, 접시의 각 패치에 대한 2.1-2.4 단계를 반복합니다. 단계 2.2의 경우, 만들어진 구멍의 숫자는 패치 번호 (최초의 패치를 한 구멍, 두 번째 두 구멍 등)에 해당한다. </li><li> 일단 세포 parafilm는 30 접시와 부화는 ° C 약 2 시간 동안 각 패치 못하였 느니라되었습니다. </li><li> 반복 실험의 각 접시 2.1-2.6 단계를 반복합니다. </li></ol> 파트 3 : 수명 분석을위한 구합니다 처녀 딸 세포 이 섹션에서는 각 세포가 처녀 딸로 시작함으로써 수명 분석을 시작셀. <ol><li> 인큐베이터에서 접시를 제거하고 못하였 느니라 세포의 대부분은 세포 분열을받은 것을 확인하십시오. 추가 시간이 세포 분열이 완료 될 수 있도록 필요한 경우에는 보육에 접시를 반환합니다. </li><li> 첫 번째 못하였 느니라 세포부터, 부드럽게 부착 세포의 상단에있는 바늘을 배치하여 어머니 세포의 딸 세포를 분리하기 위해 바늘을 사용합니다. 이것은 바늘이 세포에서 쉬고있는 동안 현미경 기지의 측면을 도청하기 위해 때로는 도움이됩니다. </li><li> 어머니의 셀을 클릭하고 추가 딸 세포를 대체하고 일시적으로 별도로 그들을 움직이는 수직선에서 분리 딸 세포를 놓으십시오. </li><li> 못하였 느니라 세포 각각에 대해 3.2 3.3 단계를 반복합니다. 세포는 분열로 실패하는 경우 단계 2.3의 위치에 중복 세포 중 하나에서 딸 세포 가져가라. 완료되면, 당신은 수명 판에 수직으로 정렬 각 패치 20 딸 세포가 있어야합니다. </li><li> 더미로 어머니 세포와 별도의 딸 세포를 모두 수집하고 패치 근처 지역 (이하 &quot;묘지&quot;)에 다시 전송합니다. 멀리 microcolonies 및 지방 영양소 고갈의 형성을 방지하기 위해 수명 분석을받은 세포에서 원치 않는 세포를 유지하는 것이 중요합니다. </li><li> Parafilm 30 판과 부화 ° C 약 2 시간. </li><li> 반복 실험의 각 접시 3.2-3.6 단계를 반복합니다. </li></ol> 4 부 : 개별 세포의 replicative 용량을 측정 <ol><li> 수명 데이터 시트를 준비합니다. 수명 데이터 시트는 각 행은 개별 어머니 세포에 해당하는 각 열에 세 점 (그림 2)에 해당하는 간단한 격자 수 있습니다. 분석하는 종자의 수를에 따라 각 데이터 시트를 라벨. </li><li> 인큐베이터에서 접시를 제거하고 못하였 느니라 세포의 대부분은 적어도 하나의 세포 분열을받은 것을 확인하십시오. 추가 시간이 세포 분열이 완료 될 수 있도록 필요한 경우에는 보육에 접시를 반환합니다. </li><li> 첫 번째 접시 첫 번째 못하였 느니라 세포부터, 시각 엄마와 딸 세포 (S)을 관찰하고 발생했을 세포 분열의 수를 결정합니다. 어머니가 세포 계약의 특성 패턴을 기반으로 제작했습니다 얼마나 많은 딸 세포 결정하기 위해 일반적으로 쉽지입니다. 수명 점수 시트의 해당 상자에 어머니 세포에 의해 만들어진 딸 세포의 수를 기록합니다. </li><li> 로 단계 3.2에서 설명한 어머니 세포의 딸 세포를 분리하기 위해 바늘을 사용합니다. </li><li> 수직선의 위치에있는 엄마 세포를 유지하고 별도로 일시적으로 딸 세포 (들)을 이동합니다. </li><li> 반복 못하였 느니라 세포의 각 4.3-4.5 단계를 반복합니다. </li><li> 폐기 딸 세포를 모두 모아서 원래의 패치 근처에있는 &#39;묘지&#39;로 이동합니다. </li><li> 30 Parafilm 접시와 부화 ° 2-3시간를위한 C. </li><li> 반복 실험의 각 접시 4.3-4.8 단계를 반복합니다. </li><li> 모든 엄마는 세포가 분열 정지 때까지 반복 4.2-4.9 단계를 반복합니다. 어머니 세포 연령으로서, 세포주기의 진행이 느린되고 그것은 나이 지점 사이의 시간 긴 기간 동안 접시를 부화 바람직한 것입니다. 접시는 4 ° C 하룻밤에 배치될 수 있습니다. </li></ol> 제 5 부 : 대표 결과. replicative 수명 실험에 의해 만들어진 원시 데이터는 각 연령 점 (그림 2) 각 어머니 세포에 의해 만들어진 딸 세포에 해당하는 목록 숫자입니다. 점수 시트의 각 행을 합산하여, 각 어머니 세포에 대한 replicative 수명이 얻어진다. 같은 실험 그룹에서 어머니 세포에 대한 데이터는 생존 곡선 (그림 3A)를 생성하고 같은 의미 수명, 평균 수명, 그리고 표준 편차와 같은 통계 계산을 수행하기 위해 풀링 수 있습니다. 같은 윌콕슨이 순위 - 합계 테스트와 같은 비 파라메 트릭 시험, 수명에 큰 차이가 실험 집단 간의 발견되었습니다 여부를 확인을 수행할 수 있습니다. 실험이 제대로 작동하면, 생존 곡선은 생존에 상대적으로 급속한 하락과 곡선의 평평화 밖으로 나중에 나이를 따라 낮은 초기 사망률과 sigmoidal 샤프를 보여주는 Gompertz - 메이크햄 속도론과 약 일관되어야합니다. 이 범위의 유사 외부가보고되었습니다 있지만 대부분의 야생 형 변종은 20-30 세대의 범위에서 replicative 수명 값을있다. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig1.jpg" alt="그림 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1209/fig1.2.jpg" alt="그림 1.5" /> 그림 1. 전형적인 replicative 수명 판의 다이어그램. 효모 세포의 microdissection를 시작하기 전에 저녁은 3-5 종자는 가볍게 접시의 한쪽을 따라 수직선에 YEPD 접시 (빨간색 박스)의 표면에 패치입니다. 하룻밤 성장에 따라, 각 변형에서 약 30 개인 세포는 20 자리를 포함하는 라인에 수직 못하였 느니라입니다. 수명 analysiS는이 초기 세포에서 얻은 V 처녀 딸 세포에서 수행됩니다. 실험 (예 : 원치 않는 딸 세포) 중 microdissection에서 얻은 여분 전지는 식민지가 형성 등 영양 지역 고갈을 방지하기 위해 멀리 실험 세포의 위치는 &quot;묘지&quot;(회색 원형)에 배치됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig3.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. replicative 수명 실험에서 replicative 수명의 집계 시트. 원시 데이터가 표시됩니다. 각 행은 단일 효모 어머니 세포에 해당하며 각 컬럼은 연령 포인트에 해당합니다. 각 상자에 입력된 번호는 연령 지점에서 그 어머니 세포에 의해 만들어진 딸 세포의 숫자입니다. 각 변형이 효모 세포를 해부 개인이 분석되는 변종의 정체성에 대한 지식이없는 것과 같은 코드 번호와 함께 표시됩니다. 스물 세포는 각 변형에 대한 assayed 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig2.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. replicative 수명 실험에서 대표 생존과 성장 곡선. (A) 생존 곡선은 (B) 성장 곡선은을하려하여 얻을 수 있습니다 (휴대폰 부문의 번호입니다. replicative 시대의 함수로 살아있는 어머니 세포의 분율을하려하여 얻을 수 있습니다 나이 지점의 함수로 주어진 변형에 의해 만들어진 딸 세포의 평균 개수.이 예제에서, 스트레인 # 2 오래 살았지만 느린로 성장 음모를 감소 초기 기울기에 의해 입증, 성장하고 있습니다.

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	<li>Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+yeast+aging.">Recent developments in yeast aging.</a> PLoS Genet. 3, (2007).</li><li>Kaeberlein, M., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of models for human aging. , 109-120 (2006).</li><li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evidence+for+conserved+longevity+pathways+between+divergent+eukaryotic+species.">Quantitative evidence for conserved longevity pathways between divergent eukaryotic species.</a> Genome Res. 18, 564-570 (2008).</li><li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+aging+in+yeast:+the+means+to+the+end.">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29-54 (2008).</li><li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span.">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 113-121 (2008).</li><li>Jiang, J. C., Jaruga, E., Repnevskaya, M. V., Jazwinski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intervention+resembling+caloric+restriction+prolongs+life+span+and+retards+aging+in+yeast.">An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast.</a> Faseb J. 14, 2135-2137 (2000).</li><li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sir2-independent+life+span+extension+by+calorie+restriction+in+yeast.">Sir2-independent life span extension by calorie restriction in yeast.</a> PLoS Biol. 2, E296-E296 (2004).</li><li>Lin, S. J., Defossez, P. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+NAD+and+SIR2+for+life-span+extension+by+calorie+restriction+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 289, 2126-2128 (2000).</li><li>Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+in+yeast+of+conserved+ageing+genes.">Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes.</a> Mech Ageing Dev. 126, 17-21 (2005).</li><li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+yeast+replicative+life+span+by+TOR+and+Sch9+in+response+to+nutrients.">Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients.</a> Science. 310, 1193-1196 (2005).</li></ol>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0145-17-0 (214530)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto-Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0118-17-0 (211677)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems)</td>
<td>DF0886-17-0 (288620)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring replicative life span in the budding yeast

노화는 세포의 구성 요소와 사망률의 결과 organelles의 점진적 저하 특징 퇴행성 과정이다. 신진 효모<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; 노화의 생물학을 연구하기 위해 널리 사용되고 있으며, 효모 장수의 여러 determinants는 벌레를 포함한 다세포 eukaryotes에 보존하는 표시, 파리, 생쥐되었습니다<sup&gt; 1</sup&gt;. 효모에서 노화 쉽게 계량 연령 관련 phenotypes의 부족으로 인해 일반적인 사용에서 두 개의 서로 다른 수명의 패러다임과 다른 상황에서 세포의 수명을 측정하여 거의 독점적으로 assayed되었습니다<sup&gt; 2</sup&gt;. 연대순 수명은 어머니 세포가 아닌 나누어, 정지 같은 상태에서 살아남을 수있는 시간의 길이를 말합니다, 그리고 다세포 eukaryotes의 포스트 mitotic 세포의 노화에 대한 모델 역할을 제안합니다. Replicative 수명은 반대로, 노화하기 전에 엄마가 세포에 의해 만들어진 딸 세포의 수를 의미하고, mitotically 활성 세포의 노화의 모델을 제공하는 것으로 생각됩니다. 여기 신진 효모 어머니 세포의 replicative의 수명을 측정하는 일반적인 프로토콜을 제시한다. replicative 수명 분석의 목적은 몇 번이나 각각의 어머니 세포 꽃봉오리를 결정하는 것입니다. 엄마와 딸 세포는 쉽게에는 자이스 혈구 Axioscope 40 또는 다른 유사한 모델로 표준 가벼운 현미경 (총 배율 160X)를 사용하여 숙련된 연구원으로 구분하실 수 있습니다. 어머니 세포의 딸 세포의 물리적 분리는 광섬유 바늘이 장착된 수동 micromanipulator를 사용하여 이루어진다. 일반 실험실 효모 종자는 어머니 당 20-30 딸 세포를 생산 하나의 수명 실험은 2~3주 필요합니다.

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Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

이 문서에서 우리는 효모 어머니 세포의 replicative의 수명을 측정하는 일반적인 프로토콜을 제시한다.

버딩 효모에 Replicative 수명 측정

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.5K 조회수.  University of Washington. 이 문서에서 우리는 효모 어머니 세포의 replicative의 수명을 측정하는 일반적인 프로토콜을 제시한다.

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Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em솔리드 미디어> 수명

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

연구

생물학

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

지드 셀의 파생물로 효모 연대기의 수명 Quantifying

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

의 정화 M. magneticum 스트레인 AMB - 1 Magnetosome 관련 단백질 MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em96 웰 플레이트에 Microtiter> 수명

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

싱글 생활 세포에서 mRNA의 전사의 속도론을 측정

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

삼투 물 투수 계수 (P 측정<sub&gt; F</sub&gt;) 구형 세포 : 예를 들어 식물 절연 원형질체

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.