이 작품은 국립 필요 프로그램 (P200A100044) 분야의 대학원 지원을 통해 교육부에 의해 지원되었다.

주의 :이 프로토콜은 방사성 물질의 적절한 사용 교육 및 처리가 필요합니다. 베타 방사선 차폐를 포함하여,이 분석을 수행 할 때 필요한 개인 보호 장비를 사용하십시오. 폐기물 대량 실험의 세척 단계에서 생성 된 방사성 폐기물은 조심스럽게 취급되어야한다. 폐기물은 쉽게 이상 기절 또는 유출되지 않습니다 큰 통이나 병으로 수직 용기에 저장되어 있는지 확인합니다. 실험이 체결되면, 신중하게 모든 액체 폐기물을 적절하게 방사성 폐기물 컨테이너를 표시하는 전송합니다. 주의 모든 자료를 처리, 오염에 대한 작업 공간을 모니터링하기 위해 인근 가이거 카운터를 유지합니다. 참고 :이 프로토콜은 우리 그룹에서 이전에보고 된 분석의 수정 된 버전입니다. H 3 PO 4 15 Phosphohistidine 안정성이 방법을 사용하기 전에 모든지지 않은 히스티딘 키나제에 대한 테스트해야합니다. phosphohistidine 일기능 시험은 전술되었다. 키나제를 함유하지 않는 음성 대조군 (15)가 포함되어야한다. 이것은 각 샘플의 배경 신호를 감산하고, [γ- 32 P] -ATP 충분히 막으로부터 세정되는 것을 보장하기 위해 필요하다. 시약 및 재료 1. 준비 <ol><li> 세균 배양의 사전이 분석을 사용하여 히스티딘 키나제를 정화. <ol><li> 이 분석의 개발 비브리오 파라 헤 몰리 티 커스 (EB101, ATCC 17802)에서 히스티딘 키나아제 (유전자 ID 1189383)을 정제. 을 NdeI 및 XhoI 제한 효소를 이용하여 발현 벡터 애완 23aHis-TEV로 키나아제를 복제 및 돌연변이의 D499A Vp1876를 구성 수득 부위 - 지정 돌연변이 유발을 수행한다. </li><li> 대장균 BL21 (DE3) pLysS 균주에 플라스미드를 변환 및 37 ° C에서 TB 배지에서 세포를 성장한다. 암피실린 (100 μg의 / ㎖) 및 클로람페니콜와 보충 문화 (34 μg의 / ㎖), 교반과 함께 성장OD 0.6 600 (250 RPM). </li><li> 25 μM의 최종 농도로 IPTG로 단백질 발현을 유도하고, 16 ℃에서 밤새 배양 하였다. 원심 분리 (5,000 XG), 초음파에 의해를 Lyse, 원심 분리에 의해 수확 세포는 세포 파편 (18,000 XG)를 제거합니다. </li><li> 니켈 NTA 아가 로스를 이용하여 그 표지 된 키나제 정제. SDS-PAGE에 의해 순도를 확인합니다. 각 단백질 정제를 최적화하고,이 분석을 사용하기 전에 순도를 확인합니다. </li></ol></li><li> 25 mM의 H 3 PO 4 씻어 솔루션을 준비합니다. 증류 된 탈 이온수 1 L에 25 mM의 최종 농도 H 3 PO 4를 추가한다. 이 용액의 pH는 약 2.0이다. 얼음에 25 mM의 H 3 PO 4를 놓습니다. </li><li> 325 mM의 H (3)의 13 배 원액 PO 4를 준비하는 키나아제 반응을 해소하는 데 사용할 수 있습니다. 이 용액의 pH는 약 1.5이다. 얼음에 325 mM의 H 3 PO 4를 놓습니다. 참고 : H 3 PO 4 </sub&gt; 25 mM의 최종 농도에서 충분히 니트로 셀룰로오스 막에 결합에서 히스티딘에 결합되지 않은 방사성 표지 된 포스페이트를 차단하는 데 도움이 또한 반응을 소멸하고. </li><li> 4 배 160 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 600 mM의 KCl을 16 밀리미터의 MgCl 2를 포함하는 반응 버퍼 원액, 40 % 글리세롤을 준비합니다. </li><li> 단백질 농도 설정 방법 (브래드 포드, UV-비스 등) 히스티딘 키나아제 농도를 정량화. 16, 17의 4 배 원하는 최종 농도의 농도와 히스티딘 키나아제 용액을 준비한다. 충분한 신호를 얻기 위해 상기 반응의 최종 단백질 농도는 이상적으로 적어도 5 μM이어야한다. </li><li> 4 배 방사성 표지를 준비 레이블이없는 ATP의 적절한 배 농도 표시와 -ATP 솔루션 [32 P γ-] : 실험에 대한 레이블이없는 비. 주 :이 조합에 포함되어야 [γ- 32 P] -ATP의 양은 ^ [양에 의존7 - 32 P] -ATP는 궁극적으로 각 반응에 발견됩니다. 반응 당 5 μCi를 - 우리는 0.1 사이에 이르기까지 최종 농도로 적절한 신호를 얻을 수있다. 레이블이 지정되지 않은 ATP 비율 주어진 실험에서 모든 반응에 대해 일정하게 유지 될 : 표지는 것이 중요합니다. 모든 농도에 걸쳐 표지되지 않은 ATP 비율 전율 : 여러 ATP 농도가 요구되는 경우가 아니라 표식을 지킬 희석액이 만들어 져야한다. 최종 ATP 농도는 일반적으로 10 μM 적어도 1 ㎜의 범위, 각 농도 안정적인 운동 데이터를 얻기 위해 중으로 분석한다. </li><li> 96- 웰 점 오점 장치 <ol><li> 니트로 셀룰로오스 막 (0.2 μm의 기공 크기)의 8cm X 12cm 조각을 잘라. </li><li> 멤브레인 장치는 밀폐되고, 모든 웰을 완전히 막에 의해 커버되도록 적합 보장 도트 블롯 장치에 위치 니트로. 올바르게 조립하면 진공 APPL이면, 공기 누설이 없어야IED. </li><li> 여액을 수집하기 위해, 2 가지 부착 플라스크에 상기 장치를 연결한다. 밸브 스템에서, 상기 장치는 편안 보조 플라스크 팁없이 사용될 수 있도록 적절한 배관을 연결한다. </li><li> 흡인기 / 진공 원에 2 차측 암 플라스크를 연결합니다. </li><li> 상기 장치가 완전히 장치에 진공을인가하여 밀봉되는 것을 테스트한다. 상기 장치가 올바르게 조립되어있는 경우, 강한 진공 웰 모두 존재할 것이다. 모든 튜브 연결은 파라 필름으로 포장 될 수있다 또는 꽉 밀봉을 보장하기 위해 포장 사란. </li><li> 선택적으로, 잘 하나에 반응 버퍼의 진공, 피펫 100 μL를 테스트합니다. 진공이 잘 통해 멤브레인에 모든 액체를 그릴 수있을 정도로 견고해야한다. </li><li> 모든 샘플은 막에서 발견 될 준비가 될 때까지 진공을 해제합니다. </li></ol></li></ol> 2. 반응 개시 및 담금질 <ol><li> 반응 성분의 혼합 <ol><li> 이전 initi에반응 버퍼가 -ATP (1.6) [32 P γ-, 히스티딘 키나제 (1.5), (섹션 1.4 참조), DDH 2 O : ATION, 4 배의 재고 솔루션으로 네 반응 성분을 준비 </li><li> 반응 완충액, 히스티딘 키나아제 같은 부피 섞은 DDH 2 O. 이러한 반응 성분이 단시간 (10 분) 동안 상온에서 평형을 허용. 주 : 최종 반응 부피는 실험 시간에 따라, 효소 - 의존성 또는 기판에 의존하는지 여부에 의존한다. 여러 분취 원하는 시점에서 동일한 반응 취하여 급냉 될 때 시간에 따른 반응은 커야한다. 반응 부피는 원하는 시점의 개수에 의존 할 것이다. 상기 분석은 반응 30 μL를 포함하는 니트로 셀룰로오스 막에 각각의 스폿에 최적화되어있다. 10 시간 지점이 요구되는 경우, 따라서, 상기 반응 부피는 적어도 300 μL이어야 (높은 용적 같은 330 μL 피펫은 에러 발생시 바람직 할 것이다).효소와 기질에 의존하는 실험은 작은 반응 볼륨을 필요로한다. 이 니트로 셀룰로오스 막에서 목격되는 최종 부피는 이들 실험의 반응 부피는 30 μL로 작을 수있다. </li><li> 반응을 개시하기 위해 반응 [32 γ- P] -ATP 용액 1 볼륨을 추가로 pipetting 아래로 섞는다. 타이머로 반응 경과 시간을 추적하고, 반응은 원하는 시간 동안 진행하도록 허용한다. </li><li> 반응을 종결 반응에 얼음처럼 차가운 325 mM의 H (3)의 총 반응 볼륨 PO 4의 1/13을 추가로 pipetting 아래로 혼합합니다. 또한, 325 mM의 H 3에 대한 반응 PO 4의 나누어지는을 추가합니다. 참고 : H 3 PO 4의 최종 농도는 충분히 반응을 해소하기 위해 25 mm 이상이어야한다. 예를 들어, 30 μL 반응에 2.5 μL 325 mM의 H 3 PO 4를 추가 또는 &lt;30 μL 반응 2.5 μL 325 mM의 H 3 PO를 추가서브&gt; 4. 반응의 최종 pH는 약 4.0이다. H 3 PO 4의 이러한 농도는 테스트 phosphohistidine 저하없이 버퍼의 키나아제 반응을 종결 확인되었다. <ol><li> 예를 들어, 7.5 μL [γ- 32 P] -ATP와 반응을 개시 7.5 배 μL 반응 완충액, 7.5 μL 4X 히스티딘 키나아제, 7.5 μL DDH 2 O. 섞는다. 2.5 μL 325 mM의 H 3 PO 4의 반응을 끄다. </li></ol></li><li> 모든 반응이 종료 될 때까지 즉시 얼음에 급냉 반응을 놓습니다. 참고 효율을 최대화하기 위해, 모두 반응 할 때까지 매 15 또는 20 (S)가 개시되어 하나의 반응을 시작하는 것이 바람직하고, 소정의 반응 시간이 경과 한 후에 모든 켄칭 될 때까지, 하나의 반응을 매 15 초 또는 20 초 급랭. 처음 분석을 사용하는 사람들을 위해, 더 긴 간격이 더 관리 할 수있다. </li></ol></li></ol> 3.이 보인다 오니트로 셀룰로오스에 F 담금질 반응 <ol><li> 96 웰 점 오점 장치에 진공을 시작합니다 <ol><li> 보조 용기에 미리 조립 된 96 웰 점 오점 장치 (1.7 절)을 놓습니다. 장치 및 막 사용 후 방사성되는 바와 같이, 상기 장치는 쉽게에서 분해 될 때까지 이러한 용기는 충분히 커야한다. </li><li> 96 웰 점 오점 장치에 진공을 적용합니다. </li><li> 상기 장치는 진공 하에서되면 신중 각 웰에서 니트로 셀룰로오스 막 상으로 직접 켄칭 반응 피펫. 모든 반응이 막에로드 될 때까지 반복합니다. 니트로 셀룰로오스의 결합능 때문에 (75-110 μg의 / cm 2)에 올바르게 장착 할 때 거의 모든 키나제는 세포막에 결합하는 것으로 발견 될 수있다 히스티딘 키나아제의 양보다 크다. 참고 : 사용되는 장치에 따라, 치료는 니트로 셀룰로오스에 구멍을하지 않도록주의해야합니다. 반응 모두 번째와 연락을했음을 관찰전자 니트로 셀룰로오스. 일부 또는 모든 반응이 웰의 벽에 부착하고, 니트로 셀룰로스에 도달하지하는 것이 용이하다. </li><li> 얼음처럼 차가운 25 mM의 H 3 PO 4의 100 μL로 우물을 씻으십시오. 이 모든 반응을 완전히 로딩을 보장 막에 도달하는 웰에 포획되었을 수있는 반응 부피를 허용 할 것이다. 전체 볼륨이 멤브레인을 통과 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 장치를 해체하고 니트로 셀룰로오스 막에 전사 <ol><li> 조심스럽게 진공을 차단하기 전에 장치를 분해. 장치 및 니트로 셀룰로오스 막 모두가이 시간에 방사성 있음을 알려드립니다. 이 시간에 차 컨테이너에서 모든 장치의 구성 요소를 제거하지 마십시오. </li><li> 집게로 조심스럽게 약 200㎖에 25 밀리미터 빙냉 H 3 PO 4 컨테이너에 장치로부터 니트로 셀룰로오스 막 옮긴다. 세척은 라디에이터 수있는 바와 같이,이 용기에 뚜껑을 배치oactive. 이때, 진공이 차단 될 수있다. </li></ol></li></ol> 4. 니트로 셀룰로오스 처리 <ol><li> 니트로 셀룰로오스 세척 <ol><li> 로커의 세척 막과 용기를 놓습니다. 막 부드럽게 20 분 동안 흔들 수 있습니다. </li><li> 20 분 후, 조심스럽게 큰 버킷에 사용할 세척액 임시 폐기물 저장에 사용되는 디 캔트. 막 반복에 얼음처럼 차가운 25 mM의 H 3 PO 4의 200 ㎖를 추가합니다. 참고 : 적어도 세 20 분 세척 배경 막에서 -ATP 신호 [32 P γ-] 제거하는 것이 필요하다. 세 번째 세척 후, 가이거 카운터와 방사선의 사용 세척 솔루션을 테스트합니다. 신호가 세척 용액에 존재하지 않을 때까지 상술 한 바와 같이 상기 멤브레인을 세척 계속. </li></ol></li><li> 니트로 셀룰로오스 건조 <ol><li> 막 충분히 세척 한 후, 간단히 공기 건조를 막을 수 있습니다. 이것은 일반적으로 5 분 이하 소요됩니다.</li></ol></li></ol> 저장 형광체 화면 5. 노출 참고 :이 섹션은 선택 사항입니다. 형광면에 막을 노출시키는 단계는 상기 멤브레인의 각 지점에서의 방사성 표지 된 키나제의 강도의 시각화를 허용하는 것이 유리하다. 이러한 스폿의 상대 강도가 ​​각각의 스폿에서의 인산화 히스티딘 키나아제의 양에 정비례한다. 또한 부 (7)에서 생성되는 행의 강도를 화상 처리 소프트웨어를 정량화 할 수 있고, 이러한 결과를 비교할 수 있으며,이 단계는 품질 관리를 허용한다. 이 검사에서 볼 수 이상이 섬광 계수에서 얻은 불규칙한 결과를 설명 할 수 있습니다. <ol><li> 형광면 준비 <ol><li> 저장 형광면에 막을 노광하기 전에, 5 분 이상 백색광 형광면을 노출. 이것은 스크린에 의해 유지 될 수있는 임의의 잔상이 소거되는 것을 보장한다. </li><li> 화면이 깨끗한 지 확인건조. 필요한 경우, 부드럽게 화면 제조 업체에 의해 승인 형광체 화면 청소 용액으로 화면을 청소, 건조 닦아냅니다. </li></ol></li><li> 니트로 셀룰로오스 막 제제 <ol><li> 조심 형광면 손상으로부터 잔류 수분을 방지하기 위해 얇은 플라스틱 랩 드라이 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 포장. 주름이나 기포가 더 없는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 형광체 화면에 노출 <ol><li> 스토리지 형광체 화면 카세트에 랩 된 니트로 셀룰로오스 막 배치 막 상에 스크린면이 아래를 놓고 카세트를 닫습니다. 카세트를 열거 나 노출시 막 이동은 두 번이나 얼룩 져 이미지를 캡처하는 원인이됩니다대로, 형광체 화면을 스캔하는 시간이 될 때까지 멤브레인을 이동하지 마십시오. </li><li> 한 형광면 제조 있듯이 적어도 4 시간 동안 노출하거나. </li><li> 노광이 완료되면, 형광면을 스캔하여 형광 스캐너로 이미지를 캡처. </li></ol></li></ol> 섬광 계수에 대한 니트로 셀룰로오스 막 준비 (6) <ol><li> 폰소 s 염색과 탈색 <ol><li> 간단히 폰소 s 염색 액에 담가 니트로 셀룰로오스 막 (0.1 % 폰소 s를 (W / v)의 5 % 아세트산) 1 - 2 분. 탈색하기 전에 얼룩 전체 막을 젖은. </li><li> 막에서 초과 폰소 s를 가만히 따르다. </li><li> 히스티딘 키나제 만 반점이 물들 때까지 DDH 2 O와 멤브레인을 씻어. 모든 관광 명소 단백질의 검출 금액을 포함 할 경우이 절차에만 작동합니다. 참고 :이 단계는 키나제는 니트로 셀룰로오스에 결합되어 있는지 확인하는 것이 필요하고, 그 단백질 로딩도 모든 장소에 걸쳐있다. 또한 발견 키나아제 용이 막으로부터 절단 할 수있다. </li></ol></li><li> 관광 명소를 절단 <ol><li> 가위를 사용하여 니트로 셀룰로오스 막에 각각 자리를 잘라. 아론 완벽하게 절단 할 필요가 없습니다g 염색 스폿의 가장자리; 막 충분히 세척 한 경우, 때문에 잘라 관광 명소의 다양한 크기 배경은 무시할 수 있습니다. 각 반응에 대한 전체 자리를 잘라 만 중요합니다. </li><li> 집게를 사용하여 조심스럽게 섬광 유리 병에 각각 자리를 옮긴다. 32 P가 체렌 코프 효과에 의해 쉽게 검출 할 어떠한 섬광 칵테일이 필요하지 않습니다. 참고 : 또는, 그 자리가 날카롭게 코르크 구멍 뚫는을 사용하여 절단 할 수 있습니다. 코르크 구멍 뚫는와 니트로 셀룰로오스에서 각 지점을 제거하고 핀으로 섬광 유리 병에 밀어 넣습니다. 이 방법으로, 상기 멤브레인은 상기 방사선 노출을 최소화 접촉 할 필요가 없다. </li></ol></li><li> [γ- 32 P] -ATP 솔루션의 결정 CPM / pmol의 <ol><li> 의 명소 몇 희석 1cm 니트로 셀룰로오스의 X 1cm 사각형 위에 -ATP 용액 (1.5 절) 32 P γ-]. 간단히 공기 건조. </li><li> 집게를 사용하여 조심스럽게 섬광에 각각의 광장을 전송유리 병. 어떤 섬광 칵테일이 필요하지 않습니다. 이들 샘플은 ATP 용액의 CPM / pmol의을 결정하는 표준 곡선을 생성하는데 사용된다. </li></ol></li></ol> 7. 섬광 계수 <ol><li> 섬광 계수기 카세트에 모든 섬광 튜브를로드합니다. 섬광 계수기로로드 카세트. </li><li> 각각의 병에 대한 CPM을 측정하는 섬광 계수 프로그램을 실행합니다. 이러한 데이터는, (6.3)에서 방사성 표지 된 ATP 믹스 CPM / pmol의 함께 각 스팟에 존재하는 인산화 히스티딘 키나아제의 양, 및 따라서 인산화의 속도를 계산하는 데 사용될 수있다. 18, 19 </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

우리가 설명했다 니트로 셀룰로오스 결합 분석은 히스티딘 키나제의 특성을하기 이전에 사용 된 방법에 비해 많은 장점을 가지고있다. 전통적인 SDS / PAGE 계 오토 라디오와 비교하여, 우리의 방법은 높은 처리량과 더 짧은 시간이 소요된다. 니트로 셀룰로오스 막을 SDS 겔에 비해 취급이 용이하며, 고정 될 필요는 없다. 단백질 명소가 가시화 될 때까지 니트로 셀룰로오스를 염색 개양귀비 빛이 있?...

적응 반응은 박테리아의 생존을 위해 매우 중요하다. 검출 및 환경 변화에 대응하기 위해, 박테리아는 이성 신호라고도 자극 - 반응 시스템을 사용한다. 전형적인 2 성분계 1,2-는 히스티딘 키나아제는 동족 자극 검출의 보존 히스티딘 잔기 autophosphorylates 후 반응 조절 단백질의 수신기 영역에 보존 된 아스파 테이트 잔기에 인산을 전송한다. (3)이 이벤트는 하류 효과를 자극 반응 조절제의 활성의 변화를 트리거한다. 4,5- 따라서, 박테리아 감지 지역 환경의 변화에 적응할 수있다. 어떤 두 개의 구성 요소 경보 시스템이 원형에서 이탈. 어떤 경우에는, 히스티딘 키나아제의 감각 영역 직접 감각 입력을 검출하고 단백질 - 단백질 상호 작용을 통해 키나아제 활성을 수정 독립형 단백질이다. 6 - 그러나 8, 펀드amental 처리 시스템의 전체적인 역할은 동일하다. 이성 시그널링은 박테리아의 생존에 필수적이다 유비쿼터스 - 응답 시스템 및 히스티딘 키나제는 신호 전달에 중요한 역할을한다. 9 세균 생물학 히스티딘 키나제의 중요성에도 불구하고, 그들은 가난 특성화 남아있다. 이것은 phosphohistidine의 고유 한 불안정성과 인산화를 측정하는 실제적인 방법의 결여에 기인한다. Phosphohistidine는 포스 포세린, phosphothreonine 및 포스보다 더 불안정하다. 10 따라서, 일반적으로 빼앗아 /의 Thr / 티르 키나제를 분석하는 데 사용되는 기술은 히스티딘 키나제에 대한 적용되지 않습니다. 히스티딘 키나제을 연구하는 11 체외 분석은 크게 SDS-PAGE의 오토 라디오 그래피로 제한되어있다. 이 방법은 12, 13, [γ- 32 P] -ATP은 키나제와 함께 배양하고, 키나제 인산화 POL로 분석yacrylamide 겔 전기 영동 (PAGE)은 겔의 오토 라디오 그래피 하였다. 이 방법은 반응 조절기 키나아제의 인산화 키나아제뿐만 아니라 phosphotransfer을 모니터링하는데 사용될 수있다. 그러나,이 방법에 띄는 결점이있다. 페이지 기반 분석은 낮은 처리량 및 시간 소모적이다. 이러한 제한은 단백질의 특성과 운동 매개 변수를 확인하는에 도움이되지 않습니다. 최근 발표 된 히스티딘 키나아제를 연구하기위한 다른 방법은 인산화를 검출 phosphohistidine 항체를 이용한다. 이 방법은 1, 3 phosphohistidine phosphohistidine 구별하는 이점을 갖지만 (14)는 검출에 이용되는 장비에 따라서,이 방법은 넓은 동적 범위 또는 검출의 높은 상한을 제공하지 않을 수있다. 따라서, 이러한 중요한 단백질을 연구하는데 사용될 수있는 빠르고 덜 힘든, 더욱 민감한 분석이 필요하다. 여기, 우리가 설명하고 D시험관 내에서 정제 된 박테리아 히스티딘 키나아제의 인산화를 정량화하는데 사용될 수있는 니트로 셀룰로오스 신중 개발 결합 분석을 emonstrate. 이 분석은 높은 처리량과 PAGE 기반 분석법보다 시간이 덜 걸린다. 이 방법은 또한 검출 및 큰 동적 범위의 높은 상한을 구비 phosphohistidine 정량 용 체렌 코프 효과를 이용한다. 상기 분석은 히스티딘 키나아제에 대한 운동 매개 변수를 결정하기 위해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Phosphoric acid</td><td>VWR</td><td>AAAA18067-AP</td><td>For quenching reactions and washing nitrocellulose</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>RPI</td><td>T60040-5000.0</td><td>Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>RPI</td><td>P41000-2500.0</td><td>For kinase reaction buffer</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>RPI</td><td>M24000-500.0</td><td>For kinase reaction buffer</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>RPI</td><td>G22020-4000.0</td><td>For kinase reaction buffer</td></tr><tr><td>5&#039;-ATP</td><td>Promega</td><td>E6011</td><td>Kinase substrate</td></tr><tr><td>[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]-5&#039;-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002Z250UC&amp;nbsp;</td><td>6,000 Ci/mmol</td></tr><tr><td>96-well dot blot apparatus</td><td>Bio-rad</td><td>1706545</td><td>For spotting reactions</td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Whatman</td><td>32-10401396-PK</td><td>For spotting reactions</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma aldrich</td><td>P3504-50G</td><td>For staining nitrocellulose</td></tr></tbody></table>

quantification of bacterial histidine kinase autophosphorylation using a nitrocellulose binding assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

<html> 대표 데이터 집합 형광체 이미 저 (도 1) 니트로 셀룰로오스 막, 폰소 s 염색 (도 2), 및 섬광 계수 데이터 (도 3)로 촬영 한 화상을 갖춘 생성 하였다. 그림 3a는 위버 - 버크 플롯에서 효소 반응 속도 상수를 보여줍니다. 이러한 결과는 그램 음성 종 비브리오 파라 헤 몰리 티 커스 (유전자 ID 1189383)로부터 정제 된 ?...

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Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.5K 조회수.  Stony Brook University. We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

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Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

연구

생화학

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of fungal secondary metabolites. Inhibitor screening, however, requires purified enzyme activities. Since class 1 deacetylases exert their function as multiprotein complexes, they are usually not active when expressed as single polypeptides in bacteria. Therefore, endogenous complexes need to be isolated, which, when conventional techniques like ion exchange and size exclusion chromatography are applied, is laborious and time consuming. Tandem affinity purification has been developed as a tool to enrich multiprotein complexes from cells and thus turned out to be ideal for the isolation of endogenous enzymes. Here we provide a detailed protocol for the single-step enrichment of active RpdA complexes via the first purification step of C-terminally TAP-tagged RpdA from Aspergillus nidulans. The purified complexes may then be used for the subsequent inhibitor screening applying a deacetylase assay. The protein enrichment together with the enzymatic activity assay can be completed within two days.

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets to treat fungal infections. Here we present a protocol for the specific enrichment of TAP-tagged RpdA combined with an HDAC activity assay that allows in vitro efficacy testing of histone deacetylase inhibitors.

효소 활성 분석을 위한 사상 균 류 아 스퍼 질러 스 니 둘 란 스의 탭 태그 Histone de살리실산의 단일 단계 농축

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

생물학

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

HAT1 효소 활성을 스크리닝하기 위한 클릭 기반 분석 개발

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

저자 스포트라이트: HAT1 Inhibitor Screening을 위한 Acetyl-Click Assay 개발

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.

히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량

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방사성 표지 된 ATP로 단백질 키나아제 활성 측정

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

효소 활성 분석을 위한 사상 균 류 아 스퍼 질러 스 니 둘 란 스의 탭 태그 Histone de살리실산의 단일 단계 농축

자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석

히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석

히스톤 아세틸전이효소 1 아세틸화를 측정하기 위한 아세틸 클릭 화학 분석