Diese Arbeit wurde durch das Department of Education durch die Graduate Unterstützung in Bereichen der nationalen Not-Programm (P200A100044) unterstützt.

Vorsicht: Dieses Protokoll erfordert eine entsprechende Ausbildung in der Verwendung und Umgang mit radioaktiven Stoffen. Bitte verwenden Sie die erforderliche persönliche Schutzausrüstung bei der Durchführung dieses Tests, einschließlich der Beta-Strahlung Abschirmung. Radioaktive Abfälle müssen sorgfältig behandelt werden, da große Mengen an Abfall während der Waschphase des Experiments erzeugt werden. Stellen Sie sicher, dass die Abfälle in einem aufrechten Behälter wie einem großen Eimer oder Flasche aufbewahrt wird, die nicht leicht umkippen wird oder verschüttet. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, übertragen sorgfältig alle flüssigen Abfall radioaktive Abfallbehälter in geeigneter Weise zu kennzeichnen. Behandeln Sie alle Materialien mit Sorgfalt und halten in der Nähe einen Geigerzähler auf den Arbeitsbereich für die Verschmutzung zu überwachen. Hinweis: Dieses Protokoll ist eine überarbeitete Version eines zuvor berichteten Assay aus unserer Gruppe. 15 Phosphohistidin Stabilität in H 3 PO 4 sollte vor der Verwendung dieses Verfahrens für jede uncharacterized Histidinkinase getestet werden. Die Phosphohistidindomäne stFähigkeitstest wurde zuvor beschrieben. 15 Eine negative Kontrolle , die nicht - Kinase enthält muss enthalten sein. Dies ist notwendig, um das Hintergrundsignal von jeder Probe zu subtrahieren, und sicherzustellen , dass [γ- 32 P] -ATP ausreichend von der Membran gewaschen wird. 1. Vorbereitung der Reagenzien und Materialien <ol><li> Reinige Histidinkinasen aus Bakterienkultur vor diesen Test zu verwenden. <ol><li> Reinige eine Histidinkinase (Gen ID 1.189.383) von Vibrio parahaemolyticus (EB101, ATCC 17802) für die Entwicklung dieses Assays. Klonen Sie die Kinase in den Expressionsvektor pET-23aHis-TEV mit NdeI und XhoI-Restriktionsstellen und führen zielgerichtete Mutagenese das mutierte Konstrukt Vp1876 D499A zu ergeben. </li><li> Transformation des Plasmids in E. coli BL21 (DE3) pLysS, und wachsen in Zellen TB Medium bei 37 ° C. Supplement Kulturen mit Ampicillin (100 ug / ml) und Chloramphenicol (34 ug / ml), und wachsen unter Rühren(250 rpm) auf eine OD 600 von 0,6. </li><li> Induzieren Proteinexpression mit IPTG bis zu einer Endkonzentration von 25 uM und wachsen Kulturen über Nacht bei 16 ° C. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation (5000 × g), lyse durch Beschallung und Zentrifuge zu entfernen, Zelltrümmer (18.000 xg). </li><li> Reinige den His-Tag-Kinase-Ni-NTA-Agarose verwendet wird. Bestätigen die Reinheit durch SDS-PAGE. Optimieren Reinigung für jedes Protein und bestätigen Reinheit vor diesen Test zu verwenden. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die 25 mM H 3 PO 4 Waschlösung. Auf 1 l entionisiertes Wasser destilliert, addieren H 3 PO 4 zu einer Endkonzentration von 25 mM. Der pH-Wert dieser Lösung beträgt etwa 2,0. Legen Sie 25 mM H 3 PO 4 auf dem Eis. </li><li> Bereiten Sie eine 13x Stammlösung von 325 mM H 3 PO 4, verwendet werden Kinase - Reaktion abzuschrecken. Der pH-Wert dieser Lösung beträgt etwa 1,5. Platzieren 325 mM H 3 PO 4 auf dem Eis. HINWEIS: H 3 PO 4 </sub&gt; In einer Endkonzentration von 25 mM quencht die Reaktion ausreichend, und hilft auch radioaktiv markiertes Phosphat zu blockieren, die nicht an der Bindung an die Nitrozellulosemembran zu Histidin gebunden ist. </li><li> Bereiten Sie eine 4 - fach Reaktionspuffer Stammlösung , die 160 mM Tris-HCl pH 8,0, 600 mM KCl, 16 mM MgCl 2 und 40% Glycerin. </li><li> Quantifizierung Histidinkinase Konzentration von etablierten Proteinkonzentration Verfahren (Bradford, UV-Vis, etc.). 16,17 Vorbereiten einer Histidinkinase Lösung mit einer Konzentration , die 4 - fache der gewünschten Endkonzentration. Um eine angemessene Signal zu erhalten sollte die endgültige Proteinkonzentration in der Reaktionsidealerweise mindestens 5 &amp; mgr; M sein. </li><li> Bereiten Sie eine 4x radiomarkierte [γ- 32 P] -ATP Lösung mit dem entsprechenden 4 - fach - Konzentration von unmarkiertem ATP und beschriftet: unmarkierten Verhältnis für das Experiment. HINWEIS: Die Menge von [γ- 32 P] -ATP , die in dieser Mischung enthalten sein sollte , ist davon abhängig , wie viel [^7; - 32 P] -ATP wird letztlich für jede Reaktion beobachtet werden. Wir haben angemessene Signal erhalten mit Endkonzentrationen im Bereich zwischen 0,1 bis 5 &amp; mgr; Ci pro Reaktion. Es ist wichtig, daß das markierte: unmarkiertem ATP-Verhältnis für alle Reaktionen in einem gegebenen Experiment konstant gehalten werden. Reihenverdünnungen sollte gemacht werden, wenn mehrere Konzentrationen ATP gewünscht werden, wie dies auch das markierte halten: unbenannt ATP-Verhältnis konstant in allen Konzentrationen. Endgültige ATP-Konzentrationen liegen typischerweise im Bereich von 10 um bis mindestens 1 mM, und jede Konzentration sollte in dreifacher Ausführung untersucht werden, um zuverlässige kinetische Daten zu erhalten. </li><li> 96- und Dot-Blot-Vorrichtung <ol><li> Cut eine 8 cm x 12 cm Stück Nitrocellulosemembran (0,2 &amp; mgr; m Porengröße). </li><li> Position Nitrocellulose in einem Dot-Blot-Vorrichtung, so dass die Membran passt, so dass die Vorrichtung abgedichtet ist, und alle Vertiefungen werden vollständig von der Membran bedeckt. Wenn es richtig zusammengebaut haben, sollte kein Luftverlust, wenn das Vakuum Appl istied. </li><li> So sammeln Filtrat, schließen Sie das Gerät an einen sekundären Seitearm Kolben. Von dem Ventilschaft, schließen ausreichende Schlauch, so daß die Vorrichtung bequem ohne Kippen der Sekundärkolben verwendet werden kann. </li><li> Schließen Sie den sekundären Seitearm Kolben Absauger / Vakuumquelle. </li><li> Prüfen Sie, daß das Gerät vollständig durch Anlegen eines Vakuums an die Vorrichtung abgedichtet ist. Wenn die Vorrichtung korrekt montiert wird, wird ein starkes Vakuum in allen Vertiefungen vorhanden sein. Alle Schlauchverbindungen können in Parafilm umwickelt werden oder Saran Wrap eine gute Abdichtung zu gewährleisten. </li><li> das Vakuum, zu testen Pipette 100 ul Reaktionspuffer in einem gut Optional. Das Vakuum sollte stark genug sein, um die gesamte Flüssigkeit durch die gut und auf die Membran zu ziehen. </li><li> Schalten Sie Vakuum, bis alle Proben bereit sind, auf der Membran entdeckt werden. </li></ol></li></ol> 2. Reaktion Initiation und Abschreckungs <ol><li> Das Mischen von Reaktionskomponenten <ol><li> Vor initiation, bereiten alle vier Reaktionskomponenten als 4x - Stammlösungen: Reaktionspuffer, Histidin - Kinase (1,5), [γ- 32 P] -ATP (1,6) und ddH 2 O (siehe Abschnitt 1.4) </li><li> Mischungs gleichen Volumina von Reaktionspuffer, Histidinkinase und ddH 2 O. erlauben diese Reaktionskomponenten bei Raumtemperatur für eine kurze Zeit (10 min) zu äquilibrieren. HINWEIS: Das endgültige Reaktionsvolumen in Abhängigkeit davon ist, ob das Experiment ist zeitabhängig, enzymabhängige oder substratabhängig. Zeitabhängige Reaktionen muss größer sein, als mehrere Aliquots aus der gleichen Reaktion entnommen und an der gewünschten Zeitpunkt abgeschreckt. Das Reaktionsvolumen wird von der Anzahl von Zeitpunkten abhängen, erwünscht. Der Test wird für jeden Punkt auf der Nitrocellulosemembran optimierte 30 &amp; mgr; l der Reaktion enthält. Somit werden, wenn 10 Zeitpunkten gewünscht, kann das Reaktionsvolumen mindestens 300 &amp; mgr; l sein muß (ein höheres Volumen, wie beispielsweise 330 &amp; mgr; l würde im Falle von Pipettierfehler bevorzugt sein).Enzym und Substrat abhängige Experimente erfordern kleinere Reaktionsvolumina. Das Reaktionsvolumen für diese Experimente als 30 &amp; mgr; L klein sein, da dies das Endvolumen, das auf der Nitrocellulosemembran getüpfelt wird. </li><li> Um die Reaktion zu initiieren, fügen Sie ein Volumen von [γ- 32 P] -ATP Lösung für die Reaktion und mischen durch Pipettieren von oben und unten. Spur verstrichene Reaktionszeit mit einem Zeitgeber und damit die Reaktion für die gewünschte Zeit fortschreiten. </li><li> Um abzuschrecken , die Reaktion, fügen 1/13 des gesamten Reaktionsvolumen von eiskaltem 325 mM H 3 PO 4 zur Reaktion und mischen durch Pipettieren von oben und unten. Alternativ kann ein Aliquot der Reaktion auf 325 mM H 3 PO 4 hinzuzufügen. HINWEIS: Die Endkonzentration an H 3 PO 4 sollte 25 mm betragen, ausreichend um die Reaktion abzuschrecken. Fügen Sie zum Beispiel 2,5 &amp; mgr; l 325 mM H 3 PO 4 bis 30 &amp; mgr; l - Reaktion, oder fügen Sie 30 ul Reaktion auf 2,5 &amp; mgr; l 325 mM H 3 PO &lt;sub&gt; 4. Der endgültige pH-Wert der Reaktion beträgt etwa 4,0. Diese Konzentration von H 3 PO 4 wurde getestet und bestätigt die Kinasereaktion in diesem Puffer zu löschen , ohne Phosphohistidin verschlechtern. <ol><li> Zum Beispiel, 7,5 ul 4x Reaktionspuffer, 7,5 ul 4x Histidinkinaseregion und 7,5 &amp; mgr; l ddH 2 O Initiate Reaktion mit 7,5 &amp; mgr; l [γ- 32 P] -ATP mischen. Quenche die Umsetzung mit 2,5 &amp; mgr; l 325 mM H 3 PO 4. </li></ol></li><li> Ab sofort abgeschreckt Reaktionen auf Eis legen, bis alle Reaktionen wurden beendet. HINWEIS: die Effizienz zu maximieren, ist es ratsam, alle 15 oder 20 s, bis alle Reaktionen initiiert eine Reaktion zu initiieren, und sobald die gewünschte Reaktionszeit alle 15 oder 20 s eine Reaktions passiert hat, zu löschen, bis alle abgeschreckt werden. Für diejenigen, die den Test zum ersten Mal verwenden, ein längeres Intervall kann besser handhabbar sein. </li></ol></li></ol> 3. Spek of Abgeschreckte Reaktionen auf Nitrocellulose <ol><li> Starten Sie Vakuum auf 96-Well-Dot-Blot-Vorrichtung <ol><li> Legen Sie die vormontierten 96-Well-Dot-Blot-Vorrichtung (Abschnitt 1.7) in einen zweiten Behälter. Dieser Behälter sollte groß genug sein, um die Vorrichtung leicht demontiert in werden, da die Vorrichtung und die Membran nach der Verwendung radioaktiv sein. </li><li> Bewerben Vakuum auf den 96-Loch-Dot-Blot-Apparatur. </li><li> Sobald das Gerät unter Vakuum ist, sorgfältig pipettieren die gestoppten Reaktion direkt auf die Nitrocellulosemembran in jeder Vertiefung. Wiederholen, bis alle Reaktionen auf die Membran geladen werden. Da die Bindungskapazität der Nitrocellulose (75-110 &amp; mgr; g / cm 2) größer als die Menge an Histidin - Kinase , die getupft wird, kann angenommen werden , dass fast alle der Kinase an die Membran bindet , wenn es richtig geladen. HINWEIS: Je nach Gerät verwendet, muss darauf geachtet werden, nicht die Nitrocellulose zu durchstechen. Man beachte, daß das gesamte Reaktions Kontakt mit th gemachte Nitrocellulose. Es ist einfach für einige oder alle der Reaktion auf die Wände des Bohrlochs zu bleiben, und nicht die Nitrocellulose erreichen. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen mit 100 &amp; mgr; l eiskaltem 25 mM H 3 PO 4. Dadurch werden alle Reaktionsvolumen ermöglichen, die in der gut gefangen worden sein, die Membran und stellt die komplette Beladung aller Reaktionen zu erreichen. Lassen Sie das gesamte Volumen durch die Membran zu fließen. </li></ol></li><li> Vorrichtung Demontage und Nitrocellulosemembran übertragen <ol><li> Vorsichtig zerlegen das Gerät , bevor Sie das Vakuum abgeschaltet wird. Darauf hingewiesen, dass sowohl die Vorrichtung und Nitrocellulosemembran in dieser Zeit radioaktiv sind. Sie zu diesem Zeitpunkt nicht alle Gerätekomponenten aus dem Sekundärbehälter zu entfernen. </li><li> Mit einer Pinzette, übertragen sorgfältig die Nitrocellulosemembran aus der Vorrichtung in einen Behälter mit ungefähr 200 ml 25 mM eiskaltem H 3 PO 4. Legen Sie einen Deckel auf diesem Behälter, wie die Wasch radi seinoactive. Zu diesem Zeitpunkt kann der Unterdruck abgeschaltet. </li></ol></li></ol> 4. Die Verarbeitung Nitrocellulose <ol><li> Nitrowasch <ol><li> Stellen Sie den Behälter mit der Wasch Membran auf einer Wippe. Lassen Sie die Membran sanft für 20 Minuten zu rocken. </li><li> Nach 20 Minuten dekantieren sorgfältig die verwendete Waschlösung in einen großen Eimer für die vorübergehende Lagerung von Abfällen genutzt werden. In 200 ml eiskaltem 25 mM H 3 PO 4 an die Membran und wiederholen. HINWEIS: Mindestens drei 20 min Waschungen sind notwendig Hintergrund zu entfernen [γ- 32 P] -ATP Signal von der Membran. Nach dem dritten Waschen, testen Sie die verwendeten Waschlösung für Strahlung mit einem Geigerzähler. Weiterhin das Waschen der Membran wie oben beschrieben, bis kein Signal in der Waschlösung vorhanden ist. </li></ol></li><li> Nitrocellulose Trocknen <ol><li> Nachdem die Membran ausreichend gewaschen wird, damit die Membran zu kurz an der Luft trocknen lassen. Dies dauert typischerweise 5 min oder weniger.</li></ol></li></ol> 5. Die Exposition gegenüber Storage Phosphor Screen Hinweis: Dieser Abschnitt ist optional. Aussetzen der Membran einem Leuchtstoffschirm ist in vorteilhaft, dass es ermöglicht die Sichtbarmachung der Intensität von radiomarkiertem kinase in jedem Punkt auf der Membran. Die relative Intensität dieser Punkte ist der Menge an phosphoryliertem Histidinkinase in jedem Punkt direkt proportional. Die Intensität kann mit Bildverarbeitungs-Software quantifiziert werden, und diese Ergebnisse können mit denen aus dem Abschnitt 7. Weiterhin erzeugt verglichen werden, wird dieser Schritt ermöglicht eine Qualitätskontrolle. Abnormalitäten in diesem Scan gesehen könnte unregelmäßige Ergebnisse aus Szintillationszählung erhalten erklären. <ol><li> Phosphor-Bildschirm Vorbereitung <ol><li> Vor der Membran an der Speicherleuchtstofffolie zu Belichten belichten den Leuchtstoffschirm mit weißem Licht für mindestens 5 min. Dadurch wird sichergestellt, dass jede Restbild, das von dem Bildschirm gehalten werden kann, wird gelöscht. </li><li> Stellen Sie sicher, dass der Bildschirm ist sauberund trocken. Falls notwendig, reinigen sanft den Bildschirm mit einer Lösung Phosphorschirm Reinigung durch den Bildschirm-Hersteller zugelassen und trocken wischen. </li></ol></li><li> Nitrocellulosemembran-Zubereitung <ol><li> wickeln Sie vorsichtig die trockene Nitrocellulosemembran in einer dünnen Plastikfolie Restfeuchtigkeit zu verhindern, dass der Phosphorschirm zu beschädigen. Stellen Sie sicher, dass es keine Falten oder Blasen sind. </li></ol></li><li> Die Exposition gegenüber Phosphorschirm <ol><li> Legen Sie die eingewickelt Nitrocellulosemembran in dem Speicherleuchtschirm-Kassette, legen Sie die Bildschirmseite nach unten auf die Membran, und schließen Sie die Kassette. Die Kassette nicht öffnen oder die Membran zu bewegen, bis es Zeit ist, den Phosphorschirm zu scannen, als Membranverschiebung während der Belichtung ein Doppel- oder verschmiert verursacht Bild erfasst werden. </li><li> Expose für mindestens 4 h oder so lange, wie der Phosphorschirm Hersteller empfiehlt. </li><li> Sobald Belichtung abgeschlossen ist, scannen Sie den Phosphorschirm und nehmen Sie das Bild mit einem Phosphor Scanner. </li></ol></li></ol> 6. Vorbereitung Nitrocellulose-Membran für Szintillationszählung <ol><li> Ponceau S-Färbung und Entfärbung <ol><li> Die Nitrocellulosemembran in Ponceau S-Färbelösung (0,1% Ponceau S (w / v) in 5% Essigsäure) für 1 kurz eintauchen - 2 min. Befeuchten Sie die gesamte Membran mit den Fleck vor der Entfärbung. </li><li> Dekantieren überschüssige Ponceau S von der Membran. </li><li> Spülen Sie die Membran mit ddH 2 O , bis nur noch die Punkte aus der Histidinkinaseregion gefärbt sind. Man beachte, dass dieses Verfahren funktioniert nur, wenn alle Spots nachweisbaren Mengen an Protein enthalten. HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, um zu bestätigen, dass die Kinase an die Nitrocellulose gebunden ist, und das Proteinbeladung ist auch in allen Flecken. Es ermöglicht auch die gepunktete Kinase leicht aus der Membran herausgeschnitten werden. </li></ol></li><li> Ausschneiden Flecken <ol><li> Mit einer Schere ausschneiden jeden Fleck auf der Nitrocellulosemembran. Es ist nicht notwendig zu schneiden perfekt Along die Kante des gefärbten Fleck; wenn die Membran ausreichend gewaschen, Hintergrund aufgrund unterschiedlicher Größe von Flecken ausgeschnitten unerheblich. Es ist nur wichtig, dass der gesamte Punkt für jede Reaktion auszuschneiden. </li><li> Mit einer Pinzette, übertragen sorgfältig jeden Fleck in Szintillationsgefäße. Kein Szintillationscocktail ist notwendig , da die 32 P leicht nachweisbar durch Cherenkov - Strahlung ist. HINWEIS: Alternativ kann die Stelle mit einem geschärften Korkbohrer ausgeschnitten werden. Entfernen Sie jede Stelle aus der Nitrocellulose mit dem Korken Borer, und schieben Sie es in ein Szintillationsphiole mit einem Stift. Bei diesem Verfahren wird die Membran muss nicht berührt werden, weitere Strahlenbelastung zu minimieren. </li></ol></li><li> Die Bestimmung CPM / pmol [γ- 32 P] -ATP Lösung <ol><li> Punkt mehrere Verdünnungen von [γ- 32 P] -ATP - Lösung (Abschnitt 1.5) auf 1 cm x 1 cm große Quadrate aus Nitrocellulose. Kurz Luft trocknen lassen. </li><li> Mit einer Pinzette, übertragen sorgfältig jedes Quadrat in ScintillationsFläschchen. Kein Szintillationscocktail notwendig. Diese Proben werden verwendet, um eine Standardkurve zu erzeugen, um die CPM / pmol der ATP-Lösung zu bestimmen. </li></ol></li></ol> 7. Szintillationszählung <ol><li> Laden Sie alle Szintillationsgefäße in Szintillationszähler Kassetten. Legen Sie Kassetten in Szintillationszähler. </li><li> Führen Sie Szintillationszählung Programm CPM für jedes Fläschchen messen. Diese Daten, zusammen mit dem CPM / pmol des radioaktiv markierten ATP-Mix (aus dem Abschnitt 6.3) kann verwendet werden, um die Menge an phosphoryliertem Histidinkinase, die in jedem Punkt zu berechnen, und somit die Rate der Autophosphorylierung. 18,19 </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Nitrocellulose-Bindungstest wir beschrieben haben, hat viele Vorteile gegenüber bisher verwendeten Verfahren Histidin-Kinasen zu charakterisieren. Im Vergleich zu herkömmlichen SDS / PAGE-basierten Autoradiographie, ist unser Verfahren einen höheren Durchsatz und weniger zeitraubend. Die Nitrocellulosemembran ist leichter zu handhaben als SDS-Gelen, und braucht nicht befestigt zu werden. Ponceau-Färbung der Nitrocellulose ermöglicht die Proteinspots visualisiert werden. Dies bietet eine einfache Möglichkeit, j...

Adaptive Reaktion ist von entscheidender Bedeutung für die bakterielle Überlebenszeit. Um Umweltveränderungen zu erfassen und zu reagieren, können Bakterien, die eine Stimulus-Antwort-System als Zweikomponenten-Signalisierung bekannt. 1,2 In einem typischen Zweikomponentensystem wird die Histidinkinase detektiert einen kognaten Stimulus, autophosphoryliert seinen konservierten Histidinrest, überträgt dann Phosphat zu einem konservierten Aspartatrest auf dem Empfänger - Domäne eines Response - Regulator - Protein. 3 Dieses Ereignis löst eine Veränderung in der Aktivität des Antwortregulator, der ein stromabwärtiges Effekt anregt. 4,5 Daher Bakterien können zu Veränderungen in der lokalen Umgebung zu erfassen und anzupassen. Einige Zwei-Komponenten-Signalanlagen weichen von diesem Urbild. In einigen Fällen ist die sensorische Domäne der Histidinkinase eine Stand-alone-Protein, das direkt die Sinnes erkennt und modifiziert Kinase-Aktivität durch eine Protein-Protein-Interaktion. 6 - 8 jedoch der Fondsamental Verfahren und allgemeine Rolle des Systems bleibt gleich. Zweikomponenten-Signalisierung ist ein allgegenwärtiges Stimulus-Antwort-System, das essentiell für das Überleben bakterieller ist und Histidin-Kinasen spielen eine wichtige Rolle bei der Transduktion des Signals. 9 Trotz der Bedeutung von Histidin-Kinasen bakterielle biology, bleiben sie schlecht charakterisiert. Dies ist aufgrund der inhärenten Instabilität von Phosphohistidin, und das Fehlen eines praktischen Verfahrens zur Messung Autophosphorylierung. Phosphohistidin ist labiler als Phosphoserin, Phosphothreonin und Phosphotyrosin. 10 So Techniken , die häufig verwendet werden , Ser / Thr / Tyr - Kinasen sind nicht anwendbar für Histidinkinasen zu analysieren. 11 In - vitro - Assays Histidin - Kinasen zu untersuchen wurden weitgehend auf SDS-PAGE - Autoradiographie beschränkt. 12,13 In diesem Verfahren [γ- 32 P] -ATP ist mit der Kinase inkubiert, und die Phosphorylierung der Kinase wird durch pol analysiertyacrylamide Gelelektrophorese (PAGE), gefolgt von Autoradiographie des Gels. Dieses Verfahren kann verwendet werden kinase Autophosphorylierung zu überwachen sowie Phosphotransfer aus der Kinase zu einem Antwortregulator. Jedoch hat dieses Verfahren bemerkenswerte Mängel. PAGE-basierten Assays sind niedrigen Durchsatz und zeitraubend. Solche Einschränkungen sind nicht förderlich für ein Protein zu charakterisieren, und seine kinetischen Parameter ermitteln. Eine alternative Methode Histidinkinasen für die Untersuchung, die vor kurzem nutzt Phosphohistidindomäne Antikörper veröffentlicht wurde Autophosphorylierung zu erkennen. 14 Während dieses Verfahren den Vorteil des Unterscheidens zwischen 1-und 3-Phosphohistidin Phosphohistidin hat, abhängig von der Instrumentierung zur Detektion verwendet, ist diese Methode nicht einen großen Dynamikbereich und hohe obere Nachweisgrenze anbieten. Somit besteht ein Bedarf für eine schnellere, weniger arbeitsaufwendig und empfindlicher Assay, der verwendet werden kann, diese wichtigen Proteine ​​zu untersuchen. Hier beschreiben wir und demonstrate eine sorgfältig entwickelte Nitrocellulose - Bindungsassay, der verwendet werden kann , die Autophosphorylierung des gereinigten bakteriellen Histidin - Kinasen in vitro zu quantifizieren. Dieser Assay ist ein höherer Durchsatz und weniger zeitraubend als PAGE-basierten Assays. Das Verfahren verwendet auch Cherenkov-Strahlung für Phosphohistidin Quantifizierung, die eine hohe obere Grenze der Detektion und einen großen Dynamikbereich bietet. Der Assay kann verwendet werden, um die kinetischen Parameter für Histidin-Kinasen bestimmen.

<table><tbody><tr><td>Phosphoric acid</td><td>VWR</td><td>AAAA18067-AP</td><td>For quenching reactions and washing nitrocellulose</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>RPI</td><td>T60040-5000.0</td><td>Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>RPI</td><td>P41000-2500.0</td><td>For kinase reaction buffer</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>RPI</td><td>M24000-500.0</td><td>For kinase reaction buffer</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>RPI</td><td>G22020-4000.0</td><td>For kinase reaction buffer</td></tr><tr><td>5&#039;-ATP</td><td>Promega</td><td>E6011</td><td>Kinase substrate</td></tr><tr><td>[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]-5&#039;-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002Z250UC&amp;nbsp;</td><td>6,000 Ci/mmol</td></tr><tr><td>96-well dot blot apparatus</td><td>Bio-rad</td><td>1706545</td><td>For spotting reactions</td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Whatman</td><td>32-10401396-PK</td><td>For spotting reactions</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma aldrich</td><td>P3504-50G</td><td>For staining nitrocellulose</td></tr></tbody></table>

quantification of bacterial histidine kinase autophosphorylation using a nitrocellulose binding assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

<html> Eine repräsentative Datensatz wurde ein Bild mit eingefangen mit einer Phosphor - Imager (Abbildung 1), Ponceau S - Färbung der Nitrocellulosemembran (Abbildung 2), und Szintillationszählung Daten (Abbildung 3) erzeugt. 3A zeigt die enzymkinetischen Konstanten in einem Lineweaver-Burk-Diagramm. Diese Ergebnisse wurden unter Verwendung eines gereinigten Histidinkinaseregion aus dem gramnegativen Spezies Vibri...

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Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

Quantifizierung der Bakterien Histidinkinase Autophosphorylierung eine Nitrocellulose-Bindungsassay unter Verwendung

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.5K Aufrufe.  Stony Brook University. We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

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Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Forschung

Biochemie

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of fungal secondary metabolites. Inhibitor screening, however, requires purified enzyme activities. Since class 1 deacetylases exert their function as multiprotein complexes, they are usually not active when expressed as single polypeptides in bacteria. Therefore, endogenous complexes need to be isolated, which, when conventional techniques like ion exchange and size exclusion chromatography are applied, is laborious and time consuming. Tandem affinity purification has been developed as a tool to enrich multiprotein complexes from cells and thus turned out to be ideal for the isolation of endogenous enzymes. Here we provide a detailed protocol for the single-step enrichment of active RpdA complexes via the first purification step of C-terminally TAP-tagged RpdA from Aspergillus nidulans. The purified complexes may then be used for the subsequent inhibitor screening applying a deacetylase assay. The protein enrichment together with the enzymatic activity assay can be completed within two days.

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets to treat fungal infections. Here we present a protocol for the specific enrichment of TAP-tagged RpdA combined with an HDAC activity assay that allows in vitro efficacy testing of histone deacetylase inhibitors.

Einschaltstige Bereicherung einer TAP-Tagged-Histon-Deacetylase des Filamentous Fungus Aspergillus nidulans für Enzymatische Aktivität Assay

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

Kinase-Inhibitor-Screening in selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Biologie

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

Entwicklung eines Click-basierten Assays zum Screening der HAT1-Enzymaktivität

An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome assembly. It is required for tumor growth in various systems, making it a potential target for cancer treatment. To facilitate the identification of compounds that can inhibit HAT1 enzymatic activity, we have devised an acetyl-click assay for rapid screening. In this simple assay, we employ recombinant HAT1/Rbap46, which is purified from activated human cells. The method utilizes the acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) in a click-chemistry approach. This involves the enzymatic transfer of an alkyne handle through a HAT1-dependent acylation reaction to a biotinylated H4 N-terminal peptide. The captured peptide is then immobilized on neutravidin plates, followed by click-chemistry functionalization with biotin-azide. Subsequently, streptavidin-peroxidase recruitment is employed to oxidize amplex red, resulting in a quantitative fluorescent output. By introducing chemical inhibitors during the acylation reaction, we can quantify enzymatic inhibition based on a reduction of the fluorescence signal. Importantly, this reaction is scalable, allowing for high throughput screening of potential inhibitors for HAT1 enzymatic activity.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung eines Acetyl-Click-Assays für das HAT1-Inhibitor-Screening

Quick and accurate chemical assays to screen for specific inhibitors are an important tool in the drug development arsenal. Here, we present a scalable acetyl-click chemistry assay to measure the inhibition of HAT1 acetylation activity.

Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung

HAT1, also known as Histone acetyltransferase 1, plays a crucial role in chromatin synthesis by stabilizing and acetylating nascent H4 before nucleosome ...

Quantifizierung der Bakterien Histidinkinase Autophosphorylierung eine Nitrocellulose-Bindungsassay unter Verwendung

Zusammenfassung

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Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Einschaltstige Bereicherung einer TAP-Tagged-Histon-Deacetylase des Filamentous Fungus Aspergillus nidulans für Enzymatische Aktivität Assay

Kinase-Inhibitor-Screening in selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung

Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung

Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung

Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung