우리는 Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon, Rose Hedreen에게이 방법론과 챔버 디자인을 테스트하고 확립하는 초기 작업에 감사드립니다. 우리는 원고를 읽고 편집 한 Kelly Tellez와 Graham Buchan에게 감사드립니다. 브릴리언트 옐로우 염료 (Sigma)의 사용을 제안함에있어 Andrew Seeds와 Julie Simpson에게 선구자적인 노력과 조언 및 지원에 감사드립니다. 이 연구는 Mary E. Groff 외과 및 의학 연구 및 교육 자선 신탁, Bronfman 과학 센터 및 Hellman 휄로우 프로그램에 의해 부분적으로 지원됩니다.

1. 준비 <ol><li> 배양기 바이 얼에서 손질실로 라이브 Drosophila 를 옮기기위한 흡인기를 준비하십시오. 흡인기는 마취가 후속 행동 관찰에 영향을주지 않도록 의식 동물을 행동 실로 옮길 수 있습니다. <ol><li> 가위를 사용하여 타이 옹 튜빙 ID 1/8 &quot;, OD ¼&quot;1.5 피트를 자릅니다. 1 mL 일회용 마이크로 피펫 팁 끝에서 최소 1 인치 정도 잘라냅니다. 커팅 팁 위에 1cm 정사각형 메쉬 (0.196 인치 열림)를 잡습니다. 참고 : 대부분의 1mL 팁에는 팁이 패키지 상자에있는 그라데이션 선이 있으며 일반적으로 그 선으로 잘라냅니다. </li><li> 메쉬 / 컷 팁 위에 새로운 1 mL 마이크로 피펫 팁을 넣습니다. 두 가지 팁 사이에 메쉬 모양을주의 깊게 관찰하십시오. 새 팁의 내부는 파리를위한 홀딩 챔버를 만듭니다. </li><li> 새 마이크로 피펫 팁의 끝 부분을 잘라내어 싱글 플라이 통과가 가능하도록 구멍을 넓 힙니다. 홀e는 그루밍 챔버 (직경 약 1.5-2 mm)의 개구부와 대략 일치 할 것이다. </li><li> 중첩 된 팁을 타이 간 튜빙의 끝 부분에 꼭 맞게 조심하십시오. 팁을 튜브 안으로 밀어 넣고 진공 압력을 허용하도록 단단히 고정시킵니다. </li><li> 튜빙의 다른 쪽 끝에서 200μL 마이크로 피펫 팁의 팁을 잘라 내고 좁은 컷 엔드를 튜빙에 끼 웁니다. 이것은 흡인기의 &quot;입&quot;쪽입니다. </li></ol></li><li> 먼지 분취 튜브를 준비하십시오. 약량의 계량 종이에 약 5 mg의 Brilliant Yellow 염료를 잰다. 먼지를 0.6mL 미세 원심 분리 관에 부어 넣고 뚜껑을 꼭 닫으십시오. 참고 : 일부 라텍스 장갑은 염료를 투과 할 수 있으므로 분취 준비 중에 니트릴 장갑을 사용할 것을 권장합니다. </li><li> 실험의 모든 샘플에 대해 1.2 단계를 반복합니다 (각 챔버의 모든 파리마다 하나씩). </li><li> 에탄올 (EtOH) 튜브 준비 : 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 100 % EtOH 1 ML을 피펫. 유전자형 또는 조건에 대해 튜브 라벨을 지정하십시오. &lt;/ li&gt; <li> 실험의 모든 샘플에 대해 1.4 단계를 반복합니다 (각 챔버에서 매 비행마다 하나씩). Grooming 분석을 완료하기 위해 EtOH 튜브를 캡핑하고 저장하십시오. 또한 적어도 하나의 &quot;Blank&quot;시료를 포함해야하며,이 시료는 음성 대조군에 대해 파리가없는 1 mL EtOH이어야합니다. </li><li> 슬라이딩 천판 (작은 구멍 포함)을 조이고 바닥 판 (더 큰 구멍이있는)을 떼어내어 먼지를 추가하여 각 그루밍 챔버를 조립하십시오. </li><li> 필요한 각 미용실을 윗면이 아래로 향한 테이블 위에 평평하게 놓습니다. 플라이 입구면이 아래로 향하게합니다. </li><li> 원하는 우물 위에 챔버의 표면에 대해 튜브를 두드려 각 챔버에 5mg Brilliant Yellow 염료 분취 량을 적재합니다. 모든 먼지가 메쉬를 통해 상단 플레이트로 떨어지는 것을 확인하기 위해 테이블을 향해 챔버를 두드립니다. </li><li> 원추형 구멍의 넓은 끝이 바깥 쪽을 향하게 구멍이 우물 위에 놓이지 않도록 각 챔버에 바닥 판을 조이십시오. 봇 보안뚜껑을 단단히 밀착시켜 염료를 미끄러지거나 방출하지 않도록하십시오. </li><li> 챔버를 뒤집어 테이블에 몇 번 평평하게 두드려서 먼지가 메시를 통해 떨어지면서 바닥 판에 놓습니다. </li><li> 작은 구멍이 15 개의 우물과 정렬되도록 챔버의 상단 플레이트를 &quot;열린 위치&quot;로 밀어서 개별 우물에 파리를 도입하십시오. </li></ol> 2. 플라이 더 스팅 및 그루밍 <ol><li> 빨대를 사용하는 것처럼 흡인기의 한쪽 끝을 천천히 빨아 흡입구를 흡입기에 넣으십시오. 가볍게 불어 넣고 구멍을 목표물쪽으로 향하게하여 파리를 넣으십시오. </li><li> 실험을 위해 사용 된 각 우물에 하나의 파리를 대기음. 웰을 로딩 한 후, 플라이가 챔버에 갇히도록 탑 플레이트를 슬라이드시키고, 다른 웰을 로딩하는 동안 플라이의 탈출을 방지하기 위해 전체 챔버를 로딩하는 동안 그 웰의 개구 상에 테이프를 위치시킨다. 여러개의 파리가 한 번에 흡인된다면e 글쎄, 오직 하나의 파리가 남아있을 때까지 그 구멍을 밝혀 둡니다. </li><li> 필요한 모든 우물이 파리로 채워진 후, 바닥 판이 위쪽이되도록 챔버를 뒤집어서 먼지가 메쉬를 통과하여 파리를 덮을 수있는 가능성을 갖도록하십시오. </li><li> 나사를 조여 상단 및 하단 플레이트를 단단히 고정하고 챔버를 와동시켜 파리를 4 초 동안 먼지를 제거하십시오. </li><li> 염료가 반대쪽으로 떨어지도록 두 번 테이블 (상판)을 두 번 문지르십시오. 그런 다음 챔버를 뒤집어 (상단 판을 위로 향하게) 챔버를 두 번 두드려 염료가 맨 위 챔버에있는 파리에서 바닥 챔버의 바닥에 떨어지도록하십시오. </li><li> 손질이 허용되지 않는 컨트롤 파리의 경우 즉시 프로토콜의 3 단계로 진행합니다. 분석을 완료 할 파리의 경우 2.7 단계로 진행합니다. </li><li> 플랩을 신을 수 있도록 30 분 동안 상판을 위로 향하게하여 탁자 또는 수조에 챔버를 평평하게 놓습니다. 샹 브를 놓으십시오.소음 및 진동이없는 공간에서 모든 손질 실험 (조명 수준, 습도 및 온도)에 대해 환경을 일정하게 유지하십시오. 상온 또는 25 ° C에서 습도 조절이 가능한 탁상용 배양기가 이상적입니다. </li></ol> 3. 시료 준비 및 흡광도 분석 <ol><li> 상판을 위로하여 챔버 레벨을 유지하면서 염료를 잃지 않도록 조심스럽게 바닥 판을 풀어서 챔버에서 꺼냅니다. </li><li> 파리가 마취 될 때까지 기류가 적은 플라이 CO 2 패드 위에 챔버를 놓습니다. </li><li> 챔버에서 상단 플레이트를 풉니 다. 조심스럽게 다리를 잡고 각각의 챔버에서 한 방울 파리를 이동하고 EtOH가 포함 된 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 입금 포 셉를 사용합니다. 하나의 플라이를 담고있는 15 개의 챔버에 대한 이송 시간은 약 3-5 분입니다. 실험실은 효율적인 실험 준비를 위해 여러 개의 챔버로 실험을하는 경우 전송 시간을 고려해야합니다. </li&gt; <li> 일단 각 미세 원심 분리 관에 1 개의 날이 있으면 캡을 닫고 3 번 튜브를 뒤집어 염료와 에탄올의 용액을 혼합하고 혼합하십시오. </li><li> 에탄올과 파리가 들어있는 튜브를 RT에서 5 시간 동안 배양하여 파리에서 용액으로 염료가 완전히 제거되도록하십시오. 5 시간 후 각 튜브 (2 초)를 짧게 와동시켜 파리에서 염료가 제거되도록하십시오. </li><li> 가능한 경우 플레이트에 각 샘플의 위치를 ​​적어 96 - 웰 접시의 우물에 실험 1.5 ML 튜브 50 μL 나누어지는. 샘플 5x를 희석하기 위해 EtOH 200 μL를 첨가한다. 이 희석은 먼지가 많은 파리 또는 큰 손질에 의한 결함의 천장 효과를 방지합니다. </li><li> 플레이트 리더를 사용하여 397 nm에서 각 샘플을 분석하십시오. 또는 플레이트 판독기를 사용할 수없는 경우 가시 광선으로 표준 분광 광도계에서 개별 샘플 및 블랭크의 흡광도를 측정하십시오. </li><li> 플레이트 판독기를 통해 샘플을 읽고 기록하고 recorde와 함께 스프레드 시트를 저장하십시오.접시에 샘플 d 개. </li></ol> 4. 결과의 정량화 <ol><li> 모든 샘플에 대한 결과를 컴파일하고 각 유전자형 또는 조건에 대한 분산을 측정합니다. 참고 : 시간 0 분 및 시간 30 분 염색 축적은 일원 분산 분석 (one-way ANOVA) 및 본 페로 니 보정 (Bonferroni correction)에 의한 통계 분석 또는 다중 병렬 비교에 대한 다른 보정을 사용하는 별개의 조건으로 간주됩니다. </li><li> (시간 0 &#39;에서의 염료 축적 평균값 - 시간 30&#39;에서의 염료 축적 평균 값) / 시간 0에서의 염료 축적 평균 값] × 100.을 사용하여 각 유전자형 / 조건에 대한 그루밍 백분율 차이를 계산한다. </li><li> 막대 그래프에서 각 유전자형 및 조건의 백분율을 나타내고 유전자형 및 조건을 비교합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Szebenyi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+Behaviour+in+Drosophila-Melanogaster.">Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster.</a> Animal. Behaviour. 17, (1969).</li><li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+and+dishabituation+of+a+cleaning+reflex+in+normal+and+mutant+Drosophila.">Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila.</a> J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).</li><li>Yanagawa, A., Guigue, A. M. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+characterization+of+a+novel+dopamine+receptor+from+Drosophila+melanogaster.">Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster.</a> Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).</li><li>Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Structure+and+Functional-Characterization+of+a+Drosophila+Dopamine-Receptor+with+High+Homology+to+Human+D(1/5).">Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5).</a> Receptors. Receptors &amp; Channels. 2 (2), 131-141 (1994).</li><li>Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mutations+affecting+neural+circuitry+required+for+grooming+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).</li><li>Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neural+command+circuit+for+grooming+movement+control.">A neural command circuit for grooming movement control.</a> Elife. 4, e08758 (2015).</li><li>Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analysis+of+single+neurons+to+correlate+synaptic+connectivity+with+grooming+behavior.">Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior.</a> Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).</li></ol>

저자는 아무런 이해 상충이 없다고 선언합니다.

미용 분석은 비교적 간단하지만 다음과 같은 문제에 특별한주의를 기울여야합니다. 플라이와 염료를 넣은 후 위쪽과 아래쪽 판에 나사를 조여 단단히 밀폐 된 상태로 유지하는 것은 재현성있는 결과를 위해 필수적입니다. 브릴리언트 옐로우 염료는 매우 미세하며 느슨한 관절은 챔버의 가장자리에서 염료가 손실되는 것을 허용합니다. 각 우물에 대한 염료 함량의 불규칙성으로 인해 불균일 한 ?...

Drosophila melanogaster ( D. melanogaster )의 정리는 여러 독립 모터 프로그램의 조정을 포함하는 견고한 타고난 행동입니다 1 . 과일 파리는 먼지, 미생물 및 시력과 같은 정상적인 생리 기능을 억제하거나 심각한 면역 장애를 일으킬 수있는 다른 병원체를 청소합니다. 기계 2 와 면역 활성화 3 을 감지하고 반응 할 때, 파리는 충분히 깨끗하고 몸의 다른 부위로 갈아 엎기 전까지 다리를 함께 또는 대상 신체 부위에 반복적으로 문지릅니다. 파리는 틀에 박힌 패턴 1 , 4 에서 크게 발생하는 뚜렷한 관찰에서 손질 동작을 수행합니다. 그루밍 신호가 우선시 될 때 행동 계층이 분명해진다. 회로 및 활동 패턴이 지원에서 확인되었습니다.계층의 최상 정리 프로그램이어서 5 단정되는 신체 부위에서 병렬 신호를 발생하고 제 억제 FA 모델. 가장 우선 순위가 머리에 주어진 다음 복부, 날개 및 마지막으로 흉부 5 . D. melanogaster 의 미용 프로그램은 신경 회로, 조절 분자 신호 및 신경 전달 물질을 연구하기위한 이상적인 시스템입니다. 예를 들어 뉴로 파이브 로민 기능 6 의 손상, Drosophila fragile X 정신 지체 단백질 ( dfmr1 ) 7의 손실 및 bisphenol A (BPA) 8 노출은 모두 신경 섬유종증의 개별 인간 증상과 유사한 과도한 손질 및 기타 행동을 일으키고, 연약 X 증후군, 자폐 스펙트럼 장애 및 주의력 결핍 과잉 행동 장애 (ADHD)의 양상을 보였다. 정리 행동은 또한 habitua 수 있습니다테드 차별적 행동 소성의 연구로이 운동 프로그램을 빌려주는 돌연변이 균주 2에서. Drosophila에 의해 모델화 될 수있는 신경 현상의 범위는 파리의 스스로를 손질하는 능력을 측정하기위한 새로운 비교 접근법을 요구합니다. 소포 성 모노 아민 전달체와 도파민 및 기타 생체 아민의 체내에서의 상대적 작용은 과실 파리루 행동을 중재하는 것으로 나타났습니다 9 , 10 . 티라민, 옥토 파민의 전구체는, 또한 적게 7에 정리 트리거 동안 옥토 파민 도파민은 참수 파리에 필적 뒷다리 손질 활성을 자극한다. 4 개의 도파민 수용체가 D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 </sup&gt;. 이 프로토콜에서 설명하는 그루밍 분석 방법을 사용함으로써, 우리는 (15) 동작을 정리 유형 I 군 도파민 수용체 DopR (벙어리 DopR, dDA1) 뒷다리에서의 역할을 결정 하였다. 그루밍은 마커 염료 또는 형광 분진으로 동물 전체를 털어 내고 나서 동물이 완전히 손질 할 수있는 청결 정도를 간접적으로 계량하여 측정 할 수 있습니다 5 , 16 . 신체에 남아있는 먼지의 나머지 부분은 전반적인 행동에 대한 상대적 마커로 사용할 수 있습니다. 신랑에게 충분한 시간을 준 후에 더스티 파리는 몸단결 행동에있어서 특정한 적자를 나타낼 수 있습니다. 손질 조사가 더욱 광범위 해짐에 따라, 프로토콜은 목 결합 신경 ( 10) 에 약리학 적 치료를 추가하기위한 목을 베는 것, 손질에 대한 반응을 이끌어 내기 위해 촉각 자극을주는 것 ( 2 )행동의 비디오 녹화 15 . 미용 관찰의 직접 관찰은 시각적 관찰을 사용하고 특정 미용 이벤트의 빈도 및 기간을 수동으로 기록하여 쉽게 연구 할 수 있습니다 4 . 우리는 3D 프린터 또는 레이저 커터로 제작할 수있는 15 개의 그루밍 챔버를 설계했으며, 청사진 디자인은 복제를 위해 사용할 수 있습니다 15 . 이 디자인은 두 개의 합쳐진 중심 판을 사용하여 매쉬로 매칭되고 분리 된 구멍과 2 개의 추가 슬라이딩 상단 및 하단 판을 사용하여 파리 및 / 또는 염료가 각각 적재됩니다. 분진이 날아 오르는 것을 허용 한 후에는 에탄올에 넣어서 염료를 용해시키고 염료의 파장에서이 용액의 흡광도를 측정합니다. 플레이트 판독기는 여러 개의 병렬 샘플에 사용할 수 있으며 단일 판독 분광 광도계는 개별 샘플에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 핸들링으로 인한 오류를 최소화하고더 작고 비용 효율적인 규모로 시험 분석을 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 줄리 심슨 (Julie Simpson)과 앤드류 시드 (Andrew Seeds)가 개척 한 방법으로 온도에 민감한 회로 조작을위한 가열 요소가있는 더 큰 그루밍 챔버를 사용하여 파생 및 수정되었습니다 5 . 다음 프로토콜은 전신의 몸단장을 정량화하고 개별 신체 부위에 염료 축적을 정량화하는 대체 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 WT와 DopR 돌연변이 사이의 표본 비교 데이터와 그루밍 행동에 대한 간단한 성과 지표를 계산하는 방법을 제시합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High-Flex Tygon PVC Clear Tubing</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5229K54</td>
			<td>ID 1/8&#34;, OD 1/4&#34;, used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips (1ml and 200ul)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-165, 24-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh Screen, 2&#34; x 2.6&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9318T44</td>
			<td>Used to construct grooming chamber and mouth aspirators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Yellow Dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201375-25G</td>
			<td>we recommend use of nitrile gloves while handling this product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td>set to &#34;touch&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>86-1282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10025-726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>20170-293</td>
			<td>tubes can be reused with successive assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV 96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>26014017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy HTX Platereader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>need to download catalog to access product number</td>
			<td>http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Microplate Reader and Imager Software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)()</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Incubator</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>DT2-CIRC-TK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; acrylic plastic</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8473K341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 nuts</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>90257A009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 x 1&#34; hex cap screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92185A199</td>
			<td>the bottom plate needs to be tapped for this size screw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-32 x 1/2&#34; hex cap screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92185A194</td>
			<td>the second plate from the top needs to be tapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-56 3/8&#34; flat head phillips machine screws</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91500A088</td>
			<td>these hold the two middle plates together</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.175&#34; ID, 1/4&#34; OD, 0.34&#34; aluminum pipe</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>92510A044</td>
			<td>Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws.&#160; These act as sheaths for the 1&#34; screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of drosophila grooming behavior

Drosophila 손질 행동은 앞다리와 뒷다리의 조율 된 움직임을 필요로하는 복잡한 다단계 이동 모터 프로그램입니다. 여기에 우리는 Drosophila 그루밍의 작거나 큰 규모의 연구를 위해 비용 효율적이고 확장 가능한 미용 분석 프로토콜과 새로운 챔버 디자인을 제시합니다. 파리는 브릴리언트 옐로우 (Brilliant Yellow) 염료를 사용하여 몸 전체에 뿌려지며 챔버 내에서 몸에서 염료를 제거 할 시간이 주어집니다. 파리는 염료를 용해시키기 위해 일정량의 에탄올에 침전됩니다. 손질되지 않은 동물에 대한 염료 - 에탄올 샘플의 상대 분광 흡광도가 측정되고 기록됩니다. 이 프로토콜은 개개의 파리에 대한 염료 축적의 정량적 데이터를 산출하며, 이는 샘플을 통해 쉽게 평균화되고 비교 될 수 있습니다. 이를 통해 실험 설계가 돌연변이 동물 연구 또는 회로 조작을위한 손질 능력을 쉽게 평가할 수 있습니다. 이 효율적인 절차는 다양하고 확장 가능합니다. 우리는 w를 보여준다.Drosophila type I Dopamine Receptor ( DopR )에 대한 WT 동물과 돌연변이 동물 사이의 프로토콜 및 비교 데이터의 ork-flow.

그루밍 분석은 정리를위한 정해진 측정 시간 (30 분) 후에 파리의 몸에 남은 염료의 상대적 잔여량을 바탕으로 행동 수행 능력을 평가하기위한 정량적 데이터를 산출합니다. 슬라이딩 그루밍 챔버 디자인의 샘플 이미지와 분석의 주요 단계가 그림 1에 강조 표시되어 있습니다. 파리는 염료 존재 하에서 vortexing에 의해 즉각적으로 분진으로부터 많은 양의 염료?...

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Quantification of Drosophila Grooming Behavior

이 프로토콜은 미용 행동을 측정하기위한 견고하고 정량적 인 데이터를 산출하는 Drosophila 의 확장 가능한 개별 그루밍 분석 기술을 설명합니다. 이 방법은 일정 기간 동안 비 - 손질 된 동물의 몸에 염료 축적의 차이를 비교하는 것에 기초합니다.

Drosophila 그루밍 행동의 부량

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

quantification-of-drosophila-grooming-behavior

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.0K 조회수.  Williams College.  이 프로토콜은 미용 행동을 측정하기위한 견고하고 정량적 인 데이터를 산출하는 Drosophila 의 확장 가능한 개별 그루밍 분석 기술을 설명합니다. 이 방법은 일정 기간 동안 비 - 손질 된 동물의 몸에 염료 축적의 차이를 비교하는 것에 기초합니다. 

비디오: Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

곤충의 단일 Sensillum 레코딩 Drosophila melanogaster과 아노 펠 레스 gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

연구

신경과학

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

분석의 방법 Drosophila 행동

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

의 이스케이프 문제의 Optogenetic의 자극<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

먹이 찾아 돌아다 행동에 대한 단일 비행 분석에<em&gt; 초파리</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

사회 회피의 정량화에 대한 간단한 분석<em&gt; 초파리</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy and cheap methods to distinguish between individuals in a trial. A standard technique for this is CO2 anaesthesia and then labelling or wing clipping each fly. However, this is invasive and has been shown to affect behavior. Other techniques have used coloration to identify flies. This article presents a simple and non-invasive method for labelling Drosophila that allows them to be individually identified within experiments, using food coloring. This method is used in trials where two males compete to mate with a female. Dyeing allowed quick and easy identification. There was, however, some difference in the strength of the coloration across the three species tested. Data is presented showing the dye has a lower impact on mating behavior than CO2 in Drosophila melanogaster. The impact of CO2 anaesthesia is shown to depend on the species of Drosophila, with D. pseudoobscura and D. subobscura showing no impact, whereas D. melanogaster males had reduced mating success. The dye method presented is applicable to a wide range of experimental designs.

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

행동 분석 실험에 대한 염색 곤충 : 마취의 짝짓기 행동<em&gt; 초파리</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

에서 냄새 유도 행동의 고해상도 정량화<em&gt; 초파리</em사용&gt;<em&gt; Flywalk</em&gt; 패러다임

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

상기 표현형의 특성을 : 정량이 중요한 이유<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 신경 근육 학 분기점

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

선형 아가로 오스 채널을 사용하여 공부하기<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 크롤링 동작

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Drosophila 그루밍 행동의 부량

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곤충의 단일 Sensillum 레코딩 Drosophila melanogaster과 아노 펠 레스 gambiae

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster

분석의 방법 Drosophila 행동

의 이스케이프 문제의 Optogenetic의 자극

먹이 찾아 돌아다 행동에 대한 단일 비행 분석에

사회 회피의 정량화에 대한 간단한 분석

행동 분석 실험에 대한 염색 곤충 : 마취의 짝짓기 행동

에서 냄새 유도 행동의 고해상도 정량화

상기 표현형의 특성을 : 정량이 중요한 이유

선형 아가로 오스 채널을 사용하여 공부하기