Name: quantification of drosophila grooming behavior
Uploaded: 2017-07-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
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우리는 Brian Shepherd, Tat Udomritthiruj, Aaron Willey, Ruby Froom, Elise Pitmon, Rose Hedreen에게이 방법론과 챔버 디자인을 테스트하고 확립하는 초기 작업에 감사드립니다. 우리는 원고를 읽고 편집 한 Kelly Tellez와 Graham Buchan에게 감사드립니다. 브릴리언트 옐로우 염료 (Sigma)의 사용을 제안함에있어 Andrew Seeds와 Julie Simpson에게 선구자적인 노력과 조언 및 지원에 감사드립니다. 이 연구는 Mary E. Groff 외과 및 의학 연구 및 교육 자선 신탁, Bronfman 과학 센터 및 Hellman 휄로우 프로그램에 의해 부분적으로 지원됩니다.

1. 준비 <ol><li> 배양기 바이 얼에서 손질실로 라이브 Drosophila 를 옮기기위한 흡인기를 준비하십시오. 흡인기는 마취가 후속 행동 관찰에 영향을주지 않도록 의식 동물을 행동 실로 옮길 수 있습니다. <ol><li> 가위를 사용하여 타이 옹 튜빙 ID 1/8 &quot;, OD ¼&quot;1.5 피트를 자릅니다. 1 mL 일회용 마이크로 피펫 팁 끝에서 최소 1 인치 정도 잘라냅니다. 커팅 팁 위에 1cm 정사각형 메쉬 (0.196 인치 열림)를 잡습니다. 참고 : 대부분의 1mL 팁에는 팁이 패키지 상자에있는 그라데이션 선이 있으며 일반적으로 그 선으로 잘라냅니다. </li><li> 메쉬 / 컷 팁 위에 새로운 1 mL 마이크로 피펫 팁을 넣습니다. 두 가지 팁 사이에 메쉬 모양을주의 깊게 관찰하십시오. 새 팁의 내부는 파리를위한 홀딩 챔버를 만듭니다. </li><li> 새 마이크로 피펫 팁의 끝 부분을 잘라내어 싱글 플라이 통과가 가능하도록 구멍을 넓 힙니다. 홀e는 그루밍 챔버 (직경 약 1.5-2 mm)의 개구부와 대략 일치 할 것이다. </li><li> 중첩 된 팁을 타이 간 튜빙의 끝 부분에 꼭 맞게 조심하십시오. 팁을 튜브 안으로 밀어 넣고 진공 압력을 허용하도록 단단히 고정시킵니다. </li><li> 튜빙의 다른 쪽 끝에서 200μL 마이크로 피펫 팁의 팁을 잘라 내고 좁은 컷 엔드를 튜빙에 끼 웁니다. 이것은 흡인기의 &quot;입&quot;쪽입니다. </li></ol></li><li> 먼지 분취 튜브를 준비하십시오. 약량의 계량 종이에 약 5 mg의 Brilliant Yellow 염료를 잰다. 먼지를 0.6mL 미세 원심 분리 관에 부어 넣고 뚜껑을 꼭 닫으십시오. 참고 : 일부 라텍스 장갑은 염료를 투과 할 수 있으므로 분취 준비 중에 니트릴 장갑을 사용할 것을 권장합니다. </li><li> 실험의 모든 샘플에 대해 1.2 단계를 반복합니다 (각 챔버의 모든 파리마다 하나씩). </li><li> 에탄올 (EtOH) 튜브 준비 : 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 100 % EtOH 1 ML을 피펫. 유전자형 또는 조건에 대해 튜브 라벨을 지정하십시오. &lt;/ li&gt; <li> 실험의 모든 샘플에 대해 1.4 단계를 반복합니다 (각 챔버에서 매 비행마다 하나씩). Grooming 분석을 완료하기 위해 EtOH 튜브를 캡핑하고 저장하십시오. 또한 적어도 하나의 &quot;Blank&quot;시료를 포함해야하며,이 시료는 음성 대조군에 대해 파리가없는 1 mL EtOH이어야합니다. </li><li> 슬라이딩 천판 (작은 구멍 포함)을 조이고 바닥 판 (더 큰 구멍이있는)을 떼어내어 먼지를 추가하여 각 그루밍 챔버를 조립하십시오. </li><li> 필요한 각 미용실을 윗면이 아래로 향한 테이블 위에 평평하게 놓습니다. 플라이 입구면이 아래로 향하게합니다. </li><li> 원하는 우물 위에 챔버의 표면에 대해 튜브를 두드려 각 챔버에 5mg Brilliant Yellow 염료 분취 량을 적재합니다. 모든 먼지가 메쉬를 통해 상단 플레이트로 떨어지는 것을 확인하기 위해 테이블을 향해 챔버를 두드립니다. </li><li> 원추형 구멍의 넓은 끝이 바깥 쪽을 향하게 구멍이 우물 위에 놓이지 않도록 각 챔버에 바닥 판을 조이십시오. 봇 보안뚜껑을 단단히 밀착시켜 염료를 미끄러지거나 방출하지 않도록하십시오. </li><li> 챔버를 뒤집어 테이블에 몇 번 평평하게 두드려서 먼지가 메시를 통해 떨어지면서 바닥 판에 놓습니다. </li><li> 작은 구멍이 15 개의 우물과 정렬되도록 챔버의 상단 플레이트를 &quot;열린 위치&quot;로 밀어서 개별 우물에 파리를 도입하십시오. </li></ol> 2. 플라이 더 스팅 및 그루밍 <ol><li> 빨대를 사용하는 것처럼 흡인기의 한쪽 끝을 천천히 빨아 흡입구를 흡입기에 넣으십시오. 가볍게 불어 넣고 구멍을 목표물쪽으로 향하게하여 파리를 넣으십시오. </li><li> 실험을 위해 사용 된 각 우물에 하나의 파리를 대기음. 웰을 로딩 한 후, 플라이가 챔버에 갇히도록 탑 플레이트를 슬라이드시키고, 다른 웰을 로딩하는 동안 플라이의 탈출을 방지하기 위해 전체 챔버를 로딩하는 동안 그 웰의 개구 상에 테이프를 위치시킨다. 여러개의 파리가 한 번에 흡인된다면e 글쎄, 오직 하나의 파리가 남아있을 때까지 그 구멍을 밝혀 둡니다. </li><li> 필요한 모든 우물이 파리로 채워진 후, 바닥 판이 위쪽이되도록 챔버를 뒤집어서 먼지가 메쉬를 통과하여 파리를 덮을 수있는 가능성을 갖도록하십시오. </li><li> 나사를 조여 상단 및 하단 플레이트를 단단히 고정하고 챔버를 와동시켜 파리를 4 초 동안 먼지를 제거하십시오. </li><li> 염료가 반대쪽으로 떨어지도록 두 번 테이블 (상판)을 두 번 문지르십시오. 그런 다음 챔버를 뒤집어 (상단 판을 위로 향하게) 챔버를 두 번 두드려 염료가 맨 위 챔버에있는 파리에서 바닥 챔버의 바닥에 떨어지도록하십시오. </li><li> 손질이 허용되지 않는 컨트롤 파리의 경우 즉시 프로토콜의 3 단계로 진행합니다. 분석을 완료 할 파리의 경우 2.7 단계로 진행합니다. </li><li> 플랩을 신을 수 있도록 30 분 동안 상판을 위로 향하게하여 탁자 또는 수조에 챔버를 평평하게 놓습니다. 샹 브를 놓으십시오.소음 및 진동이없는 공간에서 모든 손질 실험 (조명 수준, 습도 및 온도)에 대해 환경을 일정하게 유지하십시오. 상온 또는 25 ° C에서 습도 조절이 가능한 탁상용 배양기가 이상적입니다. </li></ol> 3. 시료 준비 및 흡광도 분석 <ol><li> 상판을 위로하여 챔버 레벨을 유지하면서 염료를 잃지 않도록 조심스럽게 바닥 판을 풀어서 챔버에서 꺼냅니다. </li><li> 파리가 마취 될 때까지 기류가 적은 플라이 CO 2 패드 위에 챔버를 놓습니다. </li><li> 챔버에서 상단 플레이트를 풉니 다. 조심스럽게 다리를 잡고 각각의 챔버에서 한 방울 파리를 이동하고 EtOH가 포함 된 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 입금 포 셉를 사용합니다. 하나의 플라이를 담고있는 15 개의 챔버에 대한 이송 시간은 약 3-5 분입니다. 실험실은 효율적인 실험 준비를 위해 여러 개의 챔버로 실험을하는 경우 전송 시간을 고려해야합니다. </li&gt; <li> 일단 각 미세 원심 분리 관에 1 개의 날이 있으면 캡을 닫고 3 번 튜브를 뒤집어 염료와 에탄올의 용액을 혼합하고 혼합하십시오. </li><li> 에탄올과 파리가 들어있는 튜브를 RT에서 5 시간 동안 배양하여 파리에서 용액으로 염료가 완전히 제거되도록하십시오. 5 시간 후 각 튜브 (2 초)를 짧게 와동시켜 파리에서 염료가 제거되도록하십시오. </li><li> 가능한 경우 플레이트에 각 샘플의 위치를 ​​적어 96 - 웰 접시의 우물에 실험 1.5 ML 튜브 50 μL 나누어지는. 샘플 5x를 희석하기 위해 EtOH 200 μL를 첨가한다. 이 희석은 먼지가 많은 파리 또는 큰 손질에 의한 결함의 천장 효과를 방지합니다. </li><li> 플레이트 리더를 사용하여 397 nm에서 각 샘플을 분석하십시오. 또는 플레이트 판독기를 사용할 수없는 경우 가시 광선으로 표준 분광 광도계에서 개별 샘플 및 블랭크의 흡광도를 측정하십시오. </li><li> 플레이트 판독기를 통해 샘플을 읽고 기록하고 recorde와 함께 스프레드 시트를 저장하십시오.접시에 샘플 d 개. </li></ol> 4. 결과의 정량화 <ol><li> 모든 샘플에 대한 결과를 컴파일하고 각 유전자형 또는 조건에 대한 분산을 측정합니다. 참고 : 시간 0 분 및 시간 30 분 염색 축적은 일원 분산 분석 (one-way ANOVA) 및 본 페로 니 보정 (Bonferroni correction)에 의한 통계 분석 또는 다중 병렬 비교에 대한 다른 보정을 사용하는 별개의 조건으로 간주됩니다. </li><li> (시간 0 &#39;에서의 염료 축적 평균값 - 시간 30&#39;에서의 염료 축적 평균 값) / 시간 0에서의 염료 축적 평균 값] × 100.을 사용하여 각 유전자형 / 조건에 대한 그루밍 백분율 차이를 계산한다. </li><li> 막대 그래프에서 각 유전자형 및 조건의 백분율을 나타내고 유전자형 및 조건을 비교합니다. </li></ol>

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	<li>Szebenyi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+Behaviour+in+Drosophila-Melanogaster.">Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster.</a> Animal. Behaviour. 17, (1969).</li><li>Corfas, G., Dudai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+and+dishabituation+of+a+cleaning+reflex+in+normal+and+mutant+Drosophila.">Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila.</a> J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).</li><li>Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hygienic+grooming+is+induced+by+contact+chemicals+in+Drosophila+melanogaster.">Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).</li><li>Dawkins, R., Dawkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+Organization+and+Postural+Facilitation+-+Rules+for+Grooming+in+Flies.">Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies.</a> Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).</li><li>Seeds, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suppression+hierarchy+among+competing+motor+programs+drives+sequential+grooming+in+Drosophila.">A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila.</a> Elife. 3, e02951 (2014).</li><li>King, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+Loss+of+Function+Drives+Excessive+Grooming+in+Drosophila.">Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila.</a> G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).</li><li>Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Levels+of+the+Vesicular+Monoamine+Transporter+and+a+Novel+Repetitive+Behavior+in+the+Drosophila+Model+of+Fragile+X+Syndrome.">Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome.</a> Plos One. 6 (11), e27100 (2011).</li><li>Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bisphenol+A+on+Drosophila+melanogaster+behavior--a+new+model+for+the+studies+on+neurodevelopmental+disorders.">Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders.</a> Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).</li><li>Chang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+Drosophila+vesicular+monoamine+transporter+increases+motor+activity+and+courtship+but+decreases+the+behavioral+response+to+cocaine.">Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine.</a> Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).</li><li>Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+sexually+dimorphic+behavioral+responses+to+biogenic+amines+in+decapitated+Drosophila.">Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).</li><li>Feng, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+functional+characterization+of+a+novel+dopamine+receptor+from+Drosophila+melanogaster.">Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster.</a> Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).</li><li>Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Structure+and+Functional-Characterization+of+a+Drosophila+Dopamine-Receptor+with+High+Homology+to+Human+D(1/5).">Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5).</a> Receptors. Receptors &amp; Channels. 2 (2), 131-141 (1994).</li><li>Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAMB,+a+novel+dopamine+receptor+expressed+specifically+in+Drosophila+mushroom+bodies.">DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies.</a> Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).</li><li>Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Primordial+Dopamine+D1-Like+Adenylyl+Cyclase-Linked+Receptor+from+Drosophila-Melanogaster+Displaying+Poor+Affinity+for+Benzazepines.">A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines.</a> Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).</li><li>Pitmon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+D1+family+dopamine+receptor,+DopR,+potentiates+hind+leg+grooming+behavior+in+Drosophila.">The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila.</a> Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).</li><li>Phillis, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mutations+affecting+neural+circuitry+required+for+grooming+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).</li><li>Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neural+command+circuit+for+grooming+movement+control.">A neural command circuit for grooming movement control.</a> Elife. 4, e08758 (2015).</li><li>Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analysis+of+single+neurons+to+correlate+synaptic+connectivity+with+grooming+behavior.">Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior.</a> Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).</li></ol>

저자는 아무런 이해 상충이 없다고 선언합니다.

미용 분석은 비교적 간단하지만 다음과 같은 문제에 특별한주의를 기울여야합니다. 플라이와 염료를 넣은 후 위쪽과 아래쪽 판에 나사를 조여 단단히 밀폐 된 상태로 유지하는 것은 재현성있는 결과를 위해 필수적입니다. 브릴리언트 옐로우 염료는 매우 미세하며 느슨한 관절은 챔버의 가장자리에서 염료가 손실되는 것을 허용합니다. 각 우물에 대한 염료 함량의 불규칙성으로 인해 불균일 한 ?...

Drosophila melanogaster ( D. melanogaster )의 정리는 여러 독립 모터 프로그램의 조정을 포함하는 견고한 타고난 행동입니다 1 . 과일 파리는 먼지, 미생물 및 시력과 같은 정상적인 생리 기능을 억제하거나 심각한 면역 장애를 일으킬 수있는 다른 병원체를 청소합니다. 기계 2 와 면역 활성화 3 을 감지하고 반응 할 때, 파리는 충분히 깨끗하고 몸의 다른 부위로 갈아 엎기 전까지 다리를 함께 또는 대상 신체 부위에 반복적으로 문지릅니다. 파리는 틀에 박힌 패턴 1 , 4 에서 크게 발생하는 뚜렷한 관찰에서 손질 동작을 수행합니다. 그루밍 신호가 우선시 될 때 행동 계층이 분명해진다. 회로 및 활동 패턴이 지원에서 확인되었습니다.계층의 최상 정리 프로그램이어서 5 단정되는 신체 부위에서 병렬 신호를 발생하고 제 억제 FA 모델. 가장 우선 순위가 머리에 주어진 다음 복부, 날개 및 마지막으로 흉부 5 . D. melanogaster 의 미용 프로그램은 신경 회로, 조절 분자 신호 및 신경 전달 물질을 연구하기위한 이상적인 시스템입니다. 예를 들어 뉴로 파이브 로민 기능 6 의 손상, Drosophila fragile X 정신 지체 단백질 ( dfmr1 ) 7의 손실 및 bisphenol A (BPA) 8 노출은 모두 신경 섬유종증의 개별 인간 증상과 유사한 과도한 손질 및 기타 행동을 일으키고, 연약 X 증후군, 자폐 스펙트럼 장애 및 주의력 결핍 과잉 행동 장애 (ADHD)의 양상을 보였다. 정리 행동은 또한 habitua 수 있습니다테드 차별적 행동 소성의 연구로이 운동 프로그램을 빌려주는 돌연변이 균주 2에서. Drosophila에 의해 모델화 될 수있는 신경 현상의 범위는 파리의 스스로를 손질하는 능력을 측정하기위한 새로운 비교 접근법을 요구합니다. 소포 성 모노 아민 전달체와 도파민 및 기타 생체 아민의 체내에서의 상대적 작용은 과실 파리루 행동을 중재하는 것으로 나타났습니다 9 , 10 . 티라민, 옥토 파민의 전구체는, 또한 적게 7에 정리 트리거 동안 옥토 파민 도파민은 참수 파리에 필적 뒷다리 손질 활성을 자극한다. 4 개의 도파민 수용체가 D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 </sup&gt;. 이 프로토콜에서 설명하는 그루밍 분석 방법을 사용함으로써, 우리는 (15) 동작을 정리 유형 I 군 도파민 수용체 DopR (벙어리 DopR, dDA1) 뒷다리에서의 역할을 결정 하였다. 그루밍은 마커 염료 또는 형광 분진으로 동물 전체를 털어 내고 나서 동물이 완전히 손질 할 수있는 청결 정도를 간접적으로 계량하여 측정 할 수 있습니다 5 , 16 . 신체에 남아있는 먼지의 나머지 부분은 전반적인 행동에 대한 상대적 마커로 사용할 수 있습니다. 신랑에게 충분한 시간을 준 후에 더스티 파리는 몸단결 행동에있어서 특정한 적자를 나타낼 수 있습니다. 손질 조사가 더욱 광범위 해짐에 따라, 프로토콜은 목 결합 신경 ( 10) 에 약리학 적 치료를 추가하기위한 목을 베는 것, 손질에 대한 반응을 이끌어 내기 위해 촉각 자극을주는 것 ( 2 )행동의 비디오 녹화 15 . 미용 관찰의 직접 관찰은 시각적 관찰을 사용하고 특정 미용 이벤트의 빈도 및 기간을 수동으로 기록하여 쉽게 연구 할 수 있습니다 4 . 우리는 3D 프린터 또는 레이저 커터로 제작할 수있는 15 개의 그루밍 챔버를 설계했으며, 청사진 디자인은 복제를 위해 사용할 수 있습니다 15 . 이 디자인은 두 개의 합쳐진 중심 판을 사용하여 매쉬로 매칭되고 분리 된 구멍과 2 개의 추가 슬라이딩 상단 및 하단 판을 사용하여 파리 및 / 또는 염료가 각각 적재됩니다. 분진이 날아 오르는 것을 허용 한 후에는 에탄올에 넣어서 염료를 용해시키고 염료의 파장에서이 용액의 흡광도를 측정합니다. 플레이트 판독기는 여러 개의 병렬 샘플에 사용할 수 있으며 단일 판독 분광 광도계는 개별 샘플에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 핸들링으로 인한 오류를 최소화하고더 작고 비용 효율적인 규모로 시험 분석을 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 줄리 심슨 (Julie Simpson)과 앤드류 시드 (Andrew Seeds)가 개척 한 방법으로 온도에 민감한 회로 조작을위한 가열 요소가있는 더 큰 그루밍 챔버를 사용하여 파생 및 수정되었습니다 5 . 다음 프로토콜은 전신의 몸단장을 정량화하고 개별 신체 부위에 염료 축적을 정량화하는 대체 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 WT와 DopR 돌연변이 사이의 표본 비교 데이터와 그루밍 행동에 대한 간단한 성과 지표를 계산하는 방법을 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>High-Flex Tygon PVC Clear Tubing</td><td>McMaster-Carr</td><td>5229K54</td><td>ID 1/8&quot;, OD 1/4&quot;, used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators</td></tr><tr><td>Micropipette tips (1 mL and 200 &amp;#956;L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-165, 24-150R</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6&quot;</td><td>McMaster-Carr</td><td>9318T44</td><td>Used to construct grooming chamber and mouth aspirators</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5050</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Yellow Dye</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201375-25G</td><td>we recommend use of nitrile gloves while handling this product</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td>set to &quot;touch&quot;</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>86-1282</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>VWR International</td><td>10025-726</td><td></td></tr><tr><td>0.65 mL microcentrifuge tubes</td><td>VWR International</td><td>20170-293</td><td>tubes can be reused with successive assays</td></tr><tr><td>UV 96-well plate</td><td>Corning</td><td>26014017</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy HTX Platereader</td><td>BioTek</td><td>need to download catalog to access product number</td><td>http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview</td></tr><tr><td>Gen5 Microplate Reader and Imager Software</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)()</td></tr><tr><td>Drosophila Incubator</td><td>Tritech</td><td>DT2-CIRC-TK</td><td></td></tr><tr><td>1/4&quot; acrylic plastic</td><td>McMaster-Carr</td><td>8473K341</td><td></td></tr><tr><td>8 - 32 nuts</td><td>McMaster-Carr</td><td>90257A009</td><td></td></tr><tr><td>8 - 32 x 1&quot; hex cap screws</td><td>McMaster-Carr</td><td>92185A199</td><td>the bottom plate needs to be tapped for this size screw</td></tr><tr><td>8 - 32 x 1/2&quot; hex cap screws</td><td>McMaster-Carr</td><td>92185A194</td><td>the second plate from the top needs to be tapped</td></tr><tr><td>2 - 56 3/8&quot; flat head phillips machine screws</td><td>McMaster-Carr</td><td>91500A088</td><td>these hold the two middle plates together</td></tr><tr><td>0.175&quot; ID, 1/4&quot; OD, 0.34&quot; aluminum pipe</td><td>McMaster-Carr</td><td>92510A044</td><td>Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws.&amp;nbsp; These act as sheaths for the 1&quot; screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate</td></tr></tbody></table>

quantification of drosophila grooming behavior

Drosophila 손질 행동은 앞다리와 뒷다리의 조율 된 움직임을 필요로하는 복잡한 다단계 이동 모터 프로그램입니다. 여기에 우리는 Drosophila 그루밍의 작거나 큰 규모의 연구를 위해 비용 효율적이고 확장 가능한 미용 분석 프로토콜과 새로운 챔버 디자인을 제시합니다. 파리는 브릴리언트 옐로우 (Brilliant Yellow) 염료를 사용하여 몸 전체에 뿌려지며 챔버 내에서 몸에서 염료를 제거 할 시간이 주어집니다. 파리는 염료를 용해시키기 위해 일정량의 에탄올에 침전됩니다. 손질되지 않은 동물에 대한 염료 - 에탄올 샘플의 상대 분광 흡광도가 측정되고 기록됩니다. 이 프로토콜은 개개의 파리에 대한 염료 축적의 정량적 데이터를 산출하며, 이는 샘플을 통해 쉽게 평균화되고 비교 될 수 있습니다. 이를 통해 실험 설계가 돌연변이 동물 연구 또는 회로 조작을위한 손질 능력을 쉽게 평가할 수 있습니다. 이 효율적인 절차는 다양하고 확장 가능합니다. 우리는 w를 보여준다.Drosophila type I Dopamine Receptor ( DopR )에 대한 WT 동물과 돌연변이 동물 사이의 프로토콜 및 비교 데이터의 ork-flow.

그루밍 분석은 정리를위한 정해진 측정 시간 (30 분) 후에 파리의 몸에 남은 염료의 상대적 잔여량을 바탕으로 행동 수행 능력을 평가하기위한 정량적 데이터를 산출합니다. 슬라이딩 그루밍 챔버 디자인의 샘플 이미지와 분석의 주요 단계가 그림 1에 강조 표시되어 있습니다. 파리는 염료 존재 하에서 vortexing에 의해 즉각적으로 분진으로부터 많은 양의 염료?...

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Quantification of Drosophila Grooming Behavior

이 프로토콜은 미용 행동을 측정하기위한 견고하고 정량적 인 데이터를 산출하는 Drosophila 의 확장 가능한 개별 그루밍 분석 기술을 설명합니다. 이 방법은 일정 기간 동안 비 - 손질 된 동물의 몸에 염료 축적의 차이를 비교하는 것에 기초합니다.

Drosophila 그루밍 행동의 부량

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

quantification-of-drosophila-grooming-behavior

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.1K 조회수.  Williams College.  이 프로토콜은 미용 행동을 측정하기위한 견고하고 정량적 인 데이터를 산출하는 Drosophila 의 확장 가능한 개별 그루밍 분석 기술을 설명합니다. 이 방법은 일정 기간 동안 비 - 손질 된 동물의 몸에 염료 축적의 차이를 비교하는 것에 기초합니다. 

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Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

분석의 방법 Drosophila 행동

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

연구

신경과학

Drosophila Passive Avoidance Behavior as a New Paradigm to Study Associative Aversive Learning

This protocol describes a new paradigm for analyzing aversive associative learning in adult flies (Drosophila melanogaster). The paradigm is analogous to passive avoidance behavior in laboratory rodents in which animals learn to avoid a compartment where they have previously received an electric shock. The assay takes advantage of negative geotaxis in flies, which manifests as an urge to climb up when they are placed on a vertical surface. The setup consists of vertically oriented upper and lower compartments. On the first trial, a fly is placed into a lower compartment from where it usually exits&#160;within 3-15 s, and steps into the upper compartment where it receives an electric shock. During the second trial, 24 h later, the latency is significantly increased. At the same time, the number of shocks is decreased compared to the first trial, indicating that flies formed long-term memory about the upper compartment. The recordings of latencies and number of shocks could be performed with a tally counter and a stopwatch or with an Arduino-based simple device. To illustrate how the assay can be used, the passive avoidance behavior of D. melanogaster and D. simulans male and female were characterized here. Comparison of latencies and number of shocks revealed that both D. melanogaster and D. simulans flies efficiently learned the passive avoidance behavior. No statistical differences were observed between male and female flies. However, males were a little faster while entering the upper compartment on the first trial, while females received a slightly higher number of shocks in every retention trial. The Western diet (WD) significantly impaired learning and memory in male flies while flight exercise counterbalanced this effect. Taken together, the passive avoidance behavior in flies offers a simple and reproducible assay that could be used for studying basic mechanisms of learning and memory.

Drosophila Passive Avoidance Behavior as a New Paradigm to Study Associative Aversive Learning

This work describes a simple behavioral paradigm that allows the analysis of aversive associative learning in adult fruit flies. The method is based on suppressing the innate negative geotaxis behavior due to the association formed between a specific environmental context and an electric shock.

초파리 연관적 역경 학습을 연구하는 새로운 패러다임으로서의 수동적인 회피 행동

This protocol describes a new paradigm for analyzing aversive associative learning in adult flies (Drosophila melanogaster). The paradigm is analogous to ...

행동분석학

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

의 고품질의 디지털 비디오 취득<em&gt; 초파리</em&gt; 측면 관점에서 애벌레 및 성인 동작

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

<meta charset="utf8"></head><body>마우스 모델의 자폐 스펙트럼 장애에 대한 행동 분석

Strategies for Assessing Autistic-Like Behaviors in Mice

Autism spectrum disorder (ASD) is a neurobiologically complex condition with a heterogeneous genetic etiology. Clinically, ASD is diagnosed by social communication impairments and restrictive or repetitive behaviors, such as hand flapping or lining up objects. These behavioral patterns can be reliably observed in mouse models with ASD-linked genetic mutations, making them highly useful tools for studying the underlying cellular and molecular mechanisms in ASD. Understanding how genetic changes affect the neurobiology and behaviors observed in ASD will facilitate the development of novel targeted therapeutic compounds to ameliorate core behavioral impairments. Our lab has employed several protocols encompassing well-described training and testing procedures that reflect a wide range of behavioral deficits related to ASD. Here, we detail two assays to study the core features of ASD in mouse models: self-grooming (a measure of repetitive behavior) and the three-chamber social interaction test (a measure of social interaction approach and preference for social novelty).

<meta charset="utf8"></head><body>생쥐의 자폐증과 유사한 행동을 평가하기 위한 전략

Rodent models are valuable tools for studying core behaviors related to autism spectrum disorder (ASD). In this article, we expound on two behavioral tests for modeling the core features of ASD in mice: self-grooming, which assesses repetitive behavior, and the three-chamber social interaction test, which documents social impairments.

생쥐의 자폐증과 유사한 행동을 평가하기 위한 전략

Autism spectrum disorder (ASD) is a neurobiologically complex condition with a heterogeneous genetic etiology. Clinically, ASD is diagnosed by social ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

에서 냄새 유도 행동의 고해상도 정량화<em&gt; 초파리</em사용&gt;<em&gt; Flywalk</em&gt; 패러다임

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

의 Mechanosensation에 대한 행동 분석 클론의 MARCM은 기반<em&gt; 초파리</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model organisms such as the fruit fly, Drosophila melanogaster. Drosophila is useful for understanding the basic neurobiology underlying cognitive deficits resulting from mutations in genes associated with human cognitive disorders, such as intellectual disability (ID) and autism. This work describes a methodology for testing learning and memory using a classic paradigm in Drosophila known as courtship conditioning. Male flies court females using a distinct pattern of easily recognizable behaviors. Premated females are not receptive to mating and will reject the male&#39;s copulation attempts. In response to this rejection, male flies reduce their courtship behavior. This learned reduction in courtship behavior is measured over time, serving as an indicator of learning and memory. The basic numerical output of this assay is the courtship index (CI), which is defined as the percentage of time that a male spends courting during a 10 min interval. The learning index (LI) is the relative reduction of CI in flies that have been exposed to a premated female compared to na&#239;ve flies with no previous social encounters. For the statistical comparison of LIs between genotypes, a randomization test with bootstrapping is used. To illustrate how the assay can be used to address the role of a gene relating to learning and memory, the pan-neuronal knockdown of Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (Dhap-at) was characterized here. The human ortholog of Dhap-at, glyceronephosphate O-acyltransferase (GNPT), is involved in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, an autosomal-recessive syndrome characterized by severe ID. Using the courtship conditioning assay, it was determined that Dhap-at is required for long-term memory, but not for short-term memory. This result serves as a basis for further investigation of the underlying molecular mechanisms.

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

This protocol describes a Drosophila learning and memory assay called courtship conditioning. This classic assay is based on a reduction of male courtship behavior after sexual rejection by a non-receptive premated female. This natural form of behavioral plasticity can be used to test learning, short-term memory, and long-term memory.

학습과 기억의 척도 로서의 Drosophila Courtship 컨디셔닝

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

초파리 자폐 스펙트럼 장애의 유전 및 행동 특성에 대한 모델

Paradigms for Behavioral Assessment in Drosophila Model of Autism Spectrum Disorder

Autism Spectrum Disorder (ASD) encompasses a heterogeneous group of neurodevelopmental disorders with common behavioral symptoms including deficits in social interaction and ability for communication, enhanced restricted or repetitive behaviors, and also, in some cases, learning disability and motor deficit. Drosophila has served as an unparalleled model organism for modeling a great number of human diseases. As many genes have been implicated in ASD, fruit flies have emerged as a powerful and efficient way to test the genes putatively involved with the disorder. As hundreds of genes, with varied functional roles, are implicated in ASD, a single genetic fly model of ASD is unfeasible; instead, individual genetic mutants, gene knockdowns, or overexpression-based studies of the fly homologs of ASD-associated genes are the common means for gaining insight regarding molecular pathways underlying these gene products. A host of behavioral techniques are available in Drosophila which provide easy readout of deficits in specific behavioral components. Social space assay and aggression and courtship assays in flies have been shown to be useful in assessing defects in social interaction or communication. Grooming behavior in flies is an excellent readout of repetitive behavior. Habituation assay is used in flies to estimate the ability for habituation learning, which is found to be affected in some ASD patients. A combination of these behavioral paradigms can be utilized to make a thorough assessment of the human ASD-like disease state in flies. Using Fmr1 mutant flies, recapitulating Fragile-X syndrome in humans, and POGZ-homolog row knockdown in fly neurons, we have shown quantifiable deficits in social spacing, aggression, courtship behavior, grooming behavior, and habituation. These behavioral paradigms are demonstrated here in their simplest and straightforward forms with an assumption that it would facilitate their widespread use for research on ASD and other neurodevelopmental disorders in fly models.

저자 스포트라이트: 초파리의 자폐 스펙트럼 장애 증상 탐구 - 유전자 모델 및 행동 검사

Autism Spectrum Disorder (ASD) is associated with impaired social and communicative behavior and the emergence of repetitive behavior. For studying the interrelation between ASD genes and behavioral deficits in the Drosophila model, five behavioral paradigms are described in this paper for assaying social spacing, aggression, courtship, grooming, and habituation behavior.

자폐 스펙트럼 장애의 초파리 모델에서 행동 평가를 위한 패러다임

Autism Spectrum Disorder (ASD) encompasses a heterogeneous group of neurodevelopmental disorders with common behavioral symptoms including deficits in ...

Drosophila 그루밍 행동의 부량

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분석의 방법 Drosophila 행동

초파리 연관적 역경 학습을 연구하는 새로운 패러다임으로서의 수동적인 회피 행동

의 고품질의 디지털 비디오 취득

생쥐의 자폐증과 유사한 행동을 평가하기 위한 전략

생쥐의 자폐증과 유사한 행동을 평가하기 위한 전략

생쥐의 자폐증과 유사한 행동을 평가하기 위한 전략

에서 냄새 유도 행동의 고해상도 정량화

의 Mechanosensation에 대한 행동 분석 클론의 MARCM은 기반

학습과 기억의 척도 로서의 Drosophila Courtship 컨디셔닝

자폐 스펙트럼 장애의 초파리 모델에서 행동 평가를 위한 패러다임