이 작품은 교육, 청소년, 체육 (LO1304)의 체코 교육부와 체코의 기술기구 (TE01020028)에서 보조금에 의해 지원되었다. 저자는 환경 뚜껑의 정지 영상을 촬영 박사 락스 바라나에게 감사의 말씀을 전합니다.

아가로 오스 코팅 된 플레이트 1. 준비 <ol><li> 저 융점 아가로 오스 0.75 g을 달아 혈청없이 mL의 맥코이의 5A 매체의 (또는 페놀 레드없이) (100)에 추가합니다. 전자 레인지에서 솔루션을 가열 완전히 아가 로스를 용해마다 1-2 분 소용돌이 친다. 를 살균 할 수있는 솔루션을 압력솥. </li><li> [정보 70 ° C로 냉각시키고, 아가 멸균 층류 상자 진공 여과에 의하여 500 ㎖, 0.22 μm의 필터 최상부 통해 필터링. 한 번에 전체 솔루션을 사용하지 않는 경우 작은 볼륨으로 0.75 % 여과 아가로 오스 솔루션 (FAS)을 나누어지는. 추운 방 또는 최대 4 주 동안 4 ° C 냉장고에이 즉시 사용 아가로 오스 솔루션 무균를 저장합니다. </li><li> 흐름 상자에 멸균 인산 완충 생리 식염수 (PBS)와 다음 70 % 에탄올 (EtOH로)와 함께 콤비 시약 디스펜서 및 주요 카세트에 플라스틱 - 금속 - 팁 분배 카세트와 작은 튜브를 연결합니다. </li><li> 사용하기 전에, FAS I의 저장 분취 가열<html> n은 전자 레인지가 녹아있다. 총리는 아가로 오스 솔루션 코트 384도, 조직 문화 (TC)와 분배 카세트 FAS의 15 μL와 마이크로 플레이트 &quot;특별한&quot;처리 한. 접시에 아가로 오스는 세포를 파종하기 전에 15 ~ 20 분 동안 냉각시킵니다. 추운 방에 4 ° C에서 멀리 직접 빛으로부터 폴리에틸렌 봉지에 싸여 무균 아가로 오스 - 코팅 된 플레이트를 저장합니다. 주 : 원액에서 아가 로스의 농도 변화를 방지하기 위해 0.75 % FAS 반복 가열을 피한다. 상술 된 조건 하에서 저장 될 때 아가 - 코팅 된 플레이트는 최대 2 주 동안 저장 될 수있다. FAS는 판의 코팅 동안 가열을 필요로하지 않습니다. </li><li> 카세트 팁 및 튜브에 남아있는 아가로 오스를 제거하기 위해 70 ~ 80 ° C를 멸균 수로 프라이밍에 의해 분배 카세트를 청소합니다. </li></ol> 2. 세포 배양 및 MCTS 형성 <ol><li> 배양 인간 결장 암종 HCT116 세포, 전술 한 바와 같이아가씨 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 8. </li><li> 아가로 코팅 된 384 웰 냉장에서 TC 마이크로 플레이트가 처리 필요한 수를 제거하고 15 분 동안 실온 (RT)로 평형화. </li><li> 70 % EtOH로 멸균 PBS와 표준 튜브 분배 카세트를 프라이밍에 의해 세포 파종의 콤비 시약 디스펜서를 준비합니다. 필요한 μL로 시딩 볼륨과 디스펜서 수동 설정 버튼을 이용하여 매체에 토출 속도를 조정한다. 주 : 전체 세포 시딩 공정은 무균 조건에서 층류 상자에서 수행된다. </li><li> 재조합 세포 분해 효소를 이용하여 조직 배양 플라스크에서 부착 세포를 해리. 완전 성장 배지 50 μL에 웰 당 2.5 × 104 세포 / ml의 밀도로 시드 셀 무균 비이커에 세포 현탁액 재고 확인. 이상의 384 WP 시드 때 비이커의 바닥에 침강을 방지하기 위해 자기 교반기를 사용하여 세포를 교반한다. </li><li> 허용플레이트는 실온에서 30 분간 휴식 후 4 × g에서 15 분 동안 원심 분리한다. </li><li> 한편, 증착 환원성 환경 뚜껑을 가지고 짧은면에서 멸균 H 8ml의 2 O 5 % 디메틸 술폭 시드 (DMSO)로 채우기 5 ㎖ 피펫 (도 1A)를 사용하여 (좌우). 먼저, 서서히 상하로 피펫 팁을 스위핑 좌측 홈통으로 액체를 충전 4㎖를 분배. 오른쪽 골이 단계를 반복합니다. 참고 : 액체가 뚜껑의 중심에 병합 및 가스 교환 (그림 1A)에 대한 간격을 두지 않는 쪽 골짜기에 추가되었는지 확인합니다. 뚜껑의 외관 및 이후에 384- 웰 TC 플레이트의 외측에 웰 H의 H 2 O의 삼출 2 O 결과 과량 추가. </li><li> (그림 2A를 멸균 H 2 O와 384 웰 TC 플레이트의 액체 저장소를 채우고 액체로 채워진 환경 뚜껑 일반 판 뚜껑을 교체). </li><li> 95 % 습도, 5 % CO 2, 20 % O 2와 37 ° C 회전 배양기에서 플레이트를 배치하고, 세포를 4 일 동안 MCTSes으로 응집 할 수있다. 갑자기 떨어지는 습도 수준을 방지하기 위해, 후속하는 일이 너무 오래 동안 인큐베이터의 도어를 열지 않도록. </li></ol> 로봇 형 시스템을 사용하여 3. 중간 교환 <ol><li> MCTS 형성 다음날 4 일, 잘 자동화 마이크로 플레이트 워셔 디스펜서를 사용하여 당 사전 예열 매체의 30 μL를 추가합니다. MCTSes 추가 3 일간 성장하도록 허용합니다. 그들은 실험에 원하는 크기를 달성 할 때까지 정기적으로 3 일마다 배지를 교체합니다. </li><li> 각 웰로부터 매체의 볼륨을 정의 대기음 경험적 와셔 매니 폴드의 Z -height을 조정한다. 기음 30 웰 당 매체의 μL 신선한 사전 예열 매체의 30 μL로 교체합니다. 주 : 세탁기 매니 폴드 아래로 이동하는 분배 속도와 속도를 설정가장 낮은 속도로 우물에 우물에서 난류를 최소화합니다. </li></ol> MCTS 4. 높은 콘텐츠 이미징 및 반 자동화 된 이미지 분석 <ol><li> 이미지 4X 공기 목적을 이용한 고 함량 자동 촬상 시스템의 MCTS (NA 16). </li><li> 숫자와 간격은 Z -stacks 및 웰 당 전체 MCTS를 캡처 실험에서 원하는 픽셀 비닝을 조정 MS (11)의 노출 시간 및 4 × 4의 비닝을 설정한다. </li><li> 프로그래밍 언어로 작성된 사내 루틴을 사용하여 &quot;읽어&quot;에서 설명한 바와 같이, 이미지를 단계적으로 처리한다. 참고 :하는 .m 코드와 .txt 인 추가 정보 파일은 보조 코드 파일 (그림 1B)로 사용할 수 있습니다. 루틴 측정 2D 이미지에서 MCTS 지역, 전공 및 부전공 축, 경계, 그리고 견고. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55403/55403fig1.jpg" /> 그림 1 :환경 뚜껑의 제조 및 반자동 루틴의 흐름도. 올바른 (왼쪽)과 초과 액체를 충전 (오른쪽) 양 (여기, 5 % DMSO) 가득 증발 감소 환경 뚜껑 (A) 이미지. 화살표는 액체를 추가 단측 통을 나타낸다. 별표는 DMSO의 정확한 양의 첨가 다음 뚜껑의 중앙의 간격을 나타낸다. (B)이 반 자동화 영상 분석 루틴에 포함 된 단계를 도시하는 플로. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55403/55403fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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저자는 공개 아무것도 없어.

필터링 된 아가로 오스와 384 잘 TC 플레이트 코팅 LOT의 표준 관행 코트로 오스 및 / 또는 분배 장치를 필요로하는 플레이트, 아가 로스 겔 (6)의 가열을 방지하기 위해 유지되어야을 1.5 % 저 융점 아가로 오스를 사용하는 것이다. 직경이 0.2 내지 0.4 mm에 이르기까지 작은 튜브 구멍 액체 분배 카세트를 사용하여 여러 판을 준비하는 동안 아가로 오스의 겔은 잠재?...

종양에서의 암 세포는 생리 학적으로 외 매트릭스와 세포의 상호 작용에 의해 둘러싸인 복잡한 3 차원 (3D) 구조로 배열된다. 거의 모든 조직에서의 세포는 3 차원 환경에 상주 종양 특성을 모방 관내 종양 모델에서 더 많은 생리 학적 관련성에 대한 필요성은 여러 차원 배양 기술 1, 2, 3의 발전을 가져왔다. 이 모델은 현재 3D 2의 치료제로의 전이 및 세포 반응에 종양 미세 환경의 역할을 연구 기초 연구 도구가되고있다. 또한, 2 차원 (2D) 세포 배양 4에 비해, 3D 모델 세포 신호 전달 경로에 영향을 종양 기질 상호 작용의 더 나은 이해를 위해 허용한다. 암세포의 다세포 종양 타원체 (MCTSes)는 자주 차원 셀 (C)에 사용되는생체 내 종양에 상대 친밀감으로 인해 ulture 모델. 사용하는 여러 방법 중에서, 아가 - 코팅 된 플레이트에 MCTS 발생의 액체 오버레이 기술 (LOT)의 리드 최적화 목표 검증 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11에 대한 상당한 관심을 받고있다. 이것은 LOT 6, 7을 사용 MCTS 배양 화합물 라이브러리의 파일럿 화면을 실행할 수 있었다 성공적으로 최근의 연구로부터 명백하다. 그러나, 매체의 증발에 의한 불균일 손실 MCTS의 형태와 성장에 잘 - 투 - 잘 변화는 미세 적정 플레이트를 사용하여 LOT (의원)을 함께 일반적인 장애물이다. 결과적으로, 불균일 MCTSes의 형성 의미 관련성 타협약리학 적 검정 8, 12, 13에서의 데이터. 분배 유닛 자동 액체를 사용하는 경우 재현성 문제 이외에, LOT 계 고 처리량 분석에 영향을 미치는 또 다른 실질적인 문제는 의원 코팅은 아가 로스이다. 분배 유닛은 아가로 오스 겔을 방지하기 위해 가열 유지 될 수 있지만, 분배 카세트 배관의 막힘 로봇 시스템 (6)에 대한 잠재적 관심사이다. 이러한 문제들을 극복하기 위해, 우리는 최근에 MCTS 문화 (8)의 LOT에 약간의 수정을 고안했다. 이러한 변형은 주로 흔히 높은 처리량 스크리닝 실험실에서 발견되는 장비를 이용하여 MP들에서 요철 매체 손실을 방지 할 수있는 방법에 기초한다. 3 걸쳐 균일 한 크기와 재현 MCTSes의 생성에 대한 수정 LOT의 자세한 절차84 웰 플레이트 (WPS)가 여기에 표시됩니다. 원고은 특히 단면적의 측정에 대한 명확히 한정된 경계를 갖고 있지 않은 부분적으로 분해 된 약물 처리 MCTSes에서 MCTS 크기의 평가 반자동 루틴을 보여준다.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>Low-melting</td></tr><tr><td>McCOY&#039;s 5A Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8403</td><td></td></tr><tr><td>&amp;ldquo;rapid&amp;rdquo; Filtermax filter</td><td>TPP</td><td>99505</td><td>0.22 &amp;mu;m, 500 mL</td></tr><tr><td>Multidrop&amp;trade; Combi Reagent Dispenser&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Small Tube Dispensing cassette&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24073295</td><td>Metal tip&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>384-well TC plate&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>6057308</td><td>Plate type- CellCarrier</td></tr><tr><td>Standard Tube Dispensing Cassette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td></td></tr><tr><td>MicroClime Environmental Lid</td><td>Labcyte</td><td>LLS-0310</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Rotary Incubator (SteriStore )</td><td>HighRes Biosolutions</td><td>23641</td><td>Serial No.: D00384</td></tr><tr><td>Microplate Washer Dispenser&amp;nbsp;</td><td>BioTek</td><td>Unspecified</td><td>Model: EL406&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>High-Content Imaging System (CellVoyager )</td><td>Yokogawa Electric Corporation</td><td>Unspecified</td><td>Model: CV7000</td></tr><tr><td>Orange G</td><td>New England Biolabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&amp;trade; Express recombinant cell dissociation reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604021</td><td>Phenol red free</td></tr></tbody></table>

evaporation-reducing culture condition increases the reproducibility of multicellular spheroid formation in microtiter plates

밀접 생체 조건에서 모방 종양 모델 잠재적 항암제의 스크리닝을위한 약물 발견 및 개발에서 점점 인기를 끌고있다. 다세포 종양 회전 타원체 (MCTSes)를 효과적으로 리드 최적화 및 목표 검증을위한 시험 관내 모델들이 우수하고, 고형 종양의 생리적 조건을 모방. MCTS 배양에 사용할 수있는 다양한 기술 가운데 아가 액체 오버레이 방법 MCTS 생성하기위한 가장 저렴한 방법이다. 그러나, 높은 처리량 스크리닝 액체 오버레이를 사용 MCTS 배양의 안정적인 전송은 아가로 마이크로 타이 터 플레이트 (MPS)의 코팅 우물 걸쳐 균일 MCTS 형성의 irreproducibility 포함한 많은 한계에 의해 손상 될 수있다. 의원 약물 전체 플레이트의 사용을 방지 판의 외부로부터 매체의 과도한 증발 인한 효과 가장자리 상당히 쉽다테스트합니다. 이 원고는 균일 한 MCTS 형성의 확장 성 및 재현성을 높일 수있는 액체 오버레이 기술에 대한 상세한 기술 향상된 기능을 제공합니다. 약물 치료가 발표 된 후 또한, MCTS의 평가에 대한 간단한, 반 자동 및 보편적으로 적용 할 수있는 소프트웨어 도구에 대한 자세한 내용은 있습니다.

특히 주변 우물에서 매체의 요철 손실은 작은 문화 볼륨이 의원에 자주 발생하는 문제입니다. 예를 잘 조절 온도 / 가습 시스템 및 증발 감소 의원과 접시 뚜껑 인큐베이터 실질적으로 개선 된 배양 조건은, 우물 8에서 매체의 상당한 손실을 줄일 수 있습니다. 상대 증발을 측정하기 위해 오렌지 G (OG)의 동일한 양을 각 웰에 첨가하고, 3 일 동안 OG 흡광도?...

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Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

마이크로 타이 터 플레이트에서 배지의 요철 손실 균일 다세포 타원체 종양 형성의 재현성에 영향을 미친다. 배양 조건을 개선하면 구형 형성의 재현성 및 액체 오버레이 기술을 사용하여 회전 타원체 기반 분석의 결과를 개선 상당한 매체 손실을 감소시킨다.

증발 감소 문화 조건은 미세 적정 플레이트에서 다세포 회전 타원체 형성의 재현성을 증가

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

evaporation-reducing-culture-condition-increases-reproducibility

Research

JoVE Journal

Cancer Research

6.9K 조회수.  Palacky University in Olomouc.  마이크로 타이 터 플레이트에서 배지의 요철 손실 균일 다세포 타원체 종양 형성의 재현성에 영향을 미친다. 배양 조건을 개선하면 구형 형성의 재현성 및 액체 오버레이 기술을 사용하여 회전 타원체 기반 분석의 결과를 개선 상당한 매체 손실을 감소시킨다. 

비디오: Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically relevant than conventional adherent-sheet cultures, they more accurately recapitulate the complexity and interactions present in real tumors. In order to harness this model to better assess tumor biology, or the efficacy of novel therapeutic agents, it is necessary to be able to generate spheroids reproducibly, in a controlled manner and in significant numbers.
The AggreWell system consists of a high-density array of pyramid-shaped microwells, into which a suspension of single cells is centrifuged. The numbers of cells clustering at the bottom of each microwell, and the number and ratio of distinct cell types involved depend only on the properties of the suspension introduced by the experimenter. Thus, we are able to generate tumor spheroids of arbitrary size and composition without needing to modify the underlying platform technology. The hundreds of microwells per square centimeter of culture surface area in turn ensure that extremely high production levels may be attained via a straightforward, nonlabor-intensive process. We therefore expect that this protocol will be broadly useful to researchers in the tumor spheroid field.

We introduce a protocol for the generation of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of uniform size- and composition-controlled tumor spheroids, using commercially available microwell plates.

마이크로 웰 플레이트를 사용하여 크기 조절 종양 상체 많은 수의 생산

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

연구

생체공학

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

암 연구학

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing cells as two-dimensional, single-cell monolayers (2D culture), spheroid cell culture promotes, regulates, and supports physiological cellular architecture and characteristics that exist in vivo, including the expression of extracellular matrix proteins, cell signaling, gene expression, protein production, differentiation, and proliferation. The importance of 3D culture has been recognized in many research fields, including oncology, diabetes, stem cell biology, and tissue engineering. Over the last decade, improved methods have been developed to produce spheroids and assess their metabolic function and fate.
Extracellular flux (XF) analyzers have been used to explore mitochondrial function in 3D microtissues such as spheroids using either an XF24 islet capture plate or an XFe96 spheroid microplate. However, distinct protocols and the optimization of probing mitochondrial energy metabolism in spheroids using XF technology have not been described in detail. This paper provides detailed protocols for probing mitochondrial energy metabolism in single 3D spheroids using spheroid microplates with the XFe96 XF analyzer. Using different cancer cell lines, XF technology is demonstrated to be capable of distinguishing between cellular respiration in 3D spheroids of not only different sizes but also different volumes, cell numbers,&#160;DNA content and type.
The optimal mitochondrial effector compound concentrations of oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A are used to probe specific parameters of mitochondrial energy metabolism in 3D spheroids. This paper also discusses methods to normalize data obtained from spheroids and addresses many considerations that should be considered when exploring spheroid metabolism using XF technology. This protocol will help drive research in advanced in vitro spheroid models.

These protocols will help users probe mitochondrial energy metabolism in 3D cancer cell-line-derived spheroids using Seahorse extracellular flux analysis.

세포외 플럭스 분석을 이용한 단일 3D 미세조직 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사 탐구

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

각질 줄기 세포 가소성을 모델링하기 위해 높은 처리량 표피 스페로이드 배양 시스템 구축

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

발생학

Generation of Tissue Spheroids via a 3D Printed Stamp-Like Device

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have more realistic biological responses that resemble the in vivo environment. Due to their advantages, tissue spheroids represent an emerging trend toward superior, more reliable, and more predictive study models with a broad range of biotechnological applicability. However, reproducible platforms that can achieve large-scale production of tissue spheroids have become an unmet need in fully exploring and boosting their potential. Herein, the large-scale production of homogeneous tissue spheroids is reported using a low-cost and time-effective methodology. A 3D printed stamp-like device is developed to generate up to 4,716 spheroids per 6-well plate. The device is fabricated by the stereolithography method using a photocurable resin. The final device is composed of cylindrical micropins, with a height of 1.3 mm and a width of 650 &#181;m. This approach allows the fast generation of homogeneous spheroids and co-cultured spheroids with uniform shape and size and &gt;95% cell viability. Moreover, the stamp-like device is tunable for different sizes of well plates and Petri dishes. It is easily sterilized and can be reused for long periods. The efficient large-scale production of homogeneous tissue spheroids is essential to leverage their translation for multiple areas of industry, such as tissue engineering, drug development, disease modeling, and on-demand personalized medicine.

<meta charset="utf8"></head><body>3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

The present protocol describes a technique to produce tissue spheroids on a large scale cost-effectively using a 3D printed stamp-like device.

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

Advances in 3D cell culture have developed more physiologically relevant in vitro models, such as tissue spheroids. Cells cultivated as spheroids have ...

생화학

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell cultures. The clinostat mimics an environment where cells can assemble as highly reproducible spheroids with low shear forces and active nutrient diffusion. We demonstrate that both cancer and non-cancer hepatocytes (HepG2/C3A and THLE-3 cell lines) require 3 weeks of growth prior to achieving functionalities comparable to liver cells. This protocol highlights the convenience of utilizing incubators for 3D cells with cameras monitoring the cell growth, as snapshots can be taken to count and measure spheroids upon treatment. We describe the comparison of THLE-3 and HepG2/C3A cell lines, showing how non-cancerous cell lines can be grown as well as immortalized cancer cells. We demonstrate and illustrate how proteomics experiments can be conducted from a few spheroids, which can be collected without perturbing cell signaling, i.e., no trypsinization required. We show that proteomics analysis can be used to monitor the typical liver phenotype of respiratory chain metabolism and the production of proteins involved in metal detoxification and describe a semi-automated system to count and measure the spheroid's area. Altogether, the protocol presents a toolbox that comprises a phenotypic characterization via image capture and a proteomics pipeline to experiment on 3D cell culture models.

We present a protocol for growing high-reproducible spheroids and their phenotypic characterization using image capture and proteomics.

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

FLIM 기반 대사 및 저산소증 분석을 위한 다세포 스페로이드 형성

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

저자 스포트라이트: Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 사용한 대사 및 산소화 분석을 위한 스페로이드 형성 방법 표준화

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

증발 감소 문화 조건은 미세 적정 플레이트에서 다세포 회전 타원체 형성의 재현성을 증가

요약

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이 비디오의 챕터

마이크로 웰 플레이트를 사용하여 크기 조절 종양 상체 많은 수의 생산

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

세포외 플럭스 분석을 이용한 단일 3D 미세조직 구상체의 미토콘드리아 에너지 대사 탐구

각질 줄기 세포 가소성을 모델링하기 위해 높은 처리량 표피 스페로이드 배양 시스템 구축

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)