우리는이 작품에 대한 자신의 기술 지원 레이코 키세 및 Tomotsune Ameku 감사합니다. 우리는 또한 케이 이토, 올가 알렉시앙코, 아키코 고토 마사유키 미우라, 블루밍턴 초파리 증권 센터, 교토 증권 센터 (DGRC)과 주식 및 시약의 발달 연구 하이 브리 도마 은행에 감사하고 있습니다. 이 작품은 JSPS KAKENHI 허가 번호 16K20945, 나이토 재단, 그리고 이노우에 과학 연구 상에서 YSN 보조금에 의해 지원되었다; 및 문부 과학성 KAKENHI 허가 번호 16H04792에서 RN에 그랜트.

참고 : 프로토콜의 전체 구조는 그림 1과 같다. 1. 애벌레 링 선의 해부 (RG) 참고 : D에서. cyclorrhaphous 파리목에 속하는 melanogaster의는 상기 PG는 복합 내분비 장기 링 마개 (RG,도 2D)라는 조건. PG는 수술 (후술하는) 다른 유형의 세포로부터 분리하는 것이 실행할 수 없게되기 때문에, 실제 타겟 절개하여 그대로 손상 RG를 분리하는 것이다. <ol><li> 적절한 발달 단계에서 유충의 준비 참고 : D. melanogaster의 유충의 발달 단계를 동기화하기 위해서는 좁은 시간 창 내에서 계란을 수집하고 적절한 시간에 유충을 수집하는 것이 필요하다. <ol><li> 25 ° C에서 포도 주스 한천 플레이트에 2 시간 동안 계란을 수집합니다. </li><li> 수집 한 새로 부화 <sup&gt; 번째 령 집게로 해부 현미경 유충과 으깬 표준 효모 / 옥수수 가루 플라이 음식을 포함하는 작은 유리 병에 전송할 수 있습니다. 참고 : 유충의 연령에 의해 표현된다, &quot;시간 달걀 누워 (하엘) 후&quot; &quot;시간 후에 부화 (HAH)&quot;또는 &quot;L3의 탈피 (hAL3E) 후 시간&quot;. </li><li> 적절한 시점에서, 바람직하지 않은 부상을 방지하기 위해 일회용 플라스틱 루프를 단계적 애벌레를 수집합니다. 3 번째의 령 유충 발달 진행 차이를 최소화하기 위해 70 하엘 (HAH 48)의 2 차의 령 유충을 수집하고 2 개 시간 간격에서 탈피 할 수있다. 그 다음, L3의 탈피 후 2 시간 내에 3 차 령 유충을 수집하고; 이 절차는 0-2 hAL3E 유충을 제공합니다. </li><li> 인산 완충 식염수 (PBS)로 채워진 접시 단계적 유충을 이동. </li><li> 몸에서 잔류 음식을 제거하기 위해 PBS와 유충을 씻어. </li></ol></li><li> 아래에있는 A 유충의 거친 해부해부 현미경 <ol><li> 집게로 유충의 입 후크를 잡습니다. 마이크로 가위를 사용하여 상기 본체의 전방 길이 1/3에서 애벌레 몸을 절단. </li><li> 포셉 한 쌍의 전방 애벌레 신체의 절단 끝을 잡고. 집게의 다른 쌍을 사용하여 부드럽게 본체의 내측을 향하여 상기 헤드의 선단을 밀어; 이 절차는 밖으로 내부의 애벌레 몸을집니다. 참고 :이 단계는 1 차 령 유충의 해부에 대한 건너 뛸 수 있습니다. </li><li> 단계를 반복 1.2.1-1.2.2 추가 유충으로 5 ~ 10 분. 참고 : 유충의 수는 해부 시간을 저장 같거나 20보다 작아야합니다. </li></ol></li><li> 유충의 필렛 해부 참고 :이 방법은 조직의 위치를 ​​유지하는 것은 그대로 유지 할 수 있습니다. <ol><li> 단 1 시간 동안 물에 유충을 둡니다. 유충은 질식에 의한 고정된다. </li><li> 실리콘 코팅에 PBS의 드롭 유충의 등쪽을 넣어요리의 등쪽면을 위로. 주 : 등쪽면은 길이 방향으로 실행이 개 기관 튜브가 있습니다. </li><li> 해부 현미경, 집게를 사용하여 유충의 앞쪽 끝으로 곤충 핀을 삽입한다. 후방 측으로 애벌레 신체 스트레칭 및 유충의 후방 팁에 제 2 핀을 넣어. 주 : 곤충 핀 외에도 텅스텐 와이어로 만들어진 바늘 (21)이 유용 할 수있다. 바늘은 해부 바늘로서 사용하기위한 가열에 피펫 팁에 내장 될 수있다. </li><li> 해부 현미경, 마이크로 가위로 꼬리 근처의 작은 절개를합니다. 절개에서 머리를 향해 지느러미 중간 선을 따라 길이 방향 등의 표피를 잘라. 표피 아래 조직이 손상되지 않도록주의하십시오. </li><li> 양쪽의 bodywall 표피 스트레치와 해부 bodywall의 각 모서리 (4) 핀을 배치했다. </li><li> , 집게와 전방 지방 신체의 일부를 제거하고 뇌 RG의 C를 노출표면 상에 노출 될 omplex. 필요한 경우, 침샘 한 쌍을 제거합니다. </li></ol></li><li> 고정과 함께 면역 조직 염색 <ol><li> 500 μL (PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드) 수정 용액으로 충전 된 150 mL의 마이크로 튜브에 유생 체 (단계 1.2.2)의 앞쪽 1/3을 넣어. 정착액의 불리한 희석 발생할 수도 그렇지 PBS가 고정 된 샘플에 부착 한 번에 20 개 미만의 샘플을 고정한다. 필렛 해부를 들어, PBS 한 방울을 제거한 다음 수정 솔루션의 한 방울을 추가합니다. 참고 : 수정 솔루션의 경우, 3.7 %의 포름 알데히드 또는 4 % 파라 포름 알데히드 중 하나를 사용할 수있다. </li><li> 39 ° C에서 대안 2 시간 동안 실온 (RT) 또는 30 분 동안 수정 용액 해부 조직을 인큐베이션. </li><li> 500 μL PBS와 수정 솔루션을 교체하고 신속하게 샘플을 3 회 씻어. R에 로커에 15 분 동안 500 μL, 0.3 %의 PBT (PBS + 0.3 % 옥틸 페놀에 톡실 레이트)와 함께 샘플을 씻어T. 필릿 해부 곤충 핀을 제거하고 1.5 ㎖의 마이크로 튜브에 시료를 옮긴다. 주 : 조직에 대한 항체의 투과성을 증가시키기 위해, 샘플을 RT에서 로커에 1-2 시간 동안 500 μL 2.0 % PBT를 처리한다. </li><li> 용액 (PBT의 2 % 소 혈청 알부민)를 500 μL로 블로킹 PBT 바꾸기. RT에서 로커에서 1.5 시간 동안 샘플을 인큐베이션. </li><li> 50 μL 차 항체 용액을 블로킹 용액으로 희석 한 항체 즉 블로킹 용액을 대체. </li><li> 밤새 4 ℃에서 로커에 샘플을 인큐베이션. </li><li> 500 μL 0.3 % PBT와 차 항체 용액을 장착하고 신속하게 샘플 5 회 헹군다. RT에서 15 분간 로커 각 500 μL 0.3 % PBT와 샘플 3 회 반복한다. </li><li> 50 μL 차 항체 용액 (블로킹 용액으로 희석 한 염료 복합 항체)를 0.3 % PBT 바꾸기. 핵 염색 0.5 μL 4 &#39;, 6-diamidino- 들어2- 페닐 -은 (DAPI 0.1 mg의 / ㎖ 원액) 50 μL를 첨가한다. RT에서 또는 선택적으로 밤새 4 ℃에서 2 시간 동안 로커에 샘플을 인큐베이션. 참고 : 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오. </li><li> 500 μL 0.3 % PBT와 항체 용액을 덮고 5 회 헹군다. RT에서 15 분마다 500 μL 0.3 % PBT와 샘플 3 회 반복한다. </li></ol></li><li> 뇌-RG 복합체의 미세 해부 PG를 포함하고 장착 <ol><li> 0.3 % PBT 가득 접시에 면역 염색 샘플을 전송하는 일회용 피펫을 사용합니다. 참고 : 해부 및 장착시 불편 거품을 방지하기 위해, 0.3 % PBT PBS로 교체 할 수 있습니다. </li><li> 해부 현미경, 포셉 한 쌍의 표피 입 후크를 누르고 있습니다. 는 &quot;칼날&quot;로 1 ml 주사기에 부착 된 27 G 바늘을 사용하여 신체 표피의 뇌 RG 눈 디스크 착물을 제거 식도 눈 디스크의 앞쪽 끝 부분을 잘라. </li><li> SEPA집게로 뇌-RG-눈 디스크 단지에서 식도와 장 평가. 식도 복부 신경 코드 (VNC) 상기 뇌를 통과하기 때문에, 후방 측의 용기를 꺼내. 참고 : 샘플에서 추가 성충 디스크를 제거 바늘 칼로 뇌, 눈 디스크, 다리 디스크 사이의 연결을 차단합니다. </li><li> 다른 샘플 단계를 1.5.1-1.5.4 반복합니다. 참고 : 샘플에 달라 붙는 조직 파편을 방지 0.3 % PBT 또는 PBS로 채워진 다른 깨끗한 접시에 각각의 완성 된 샘플을 전송합니다. </li><li> 마이크로 피펫 깨끗한 유리 슬라이드의 중심에 샘플을 전송합니다. 참고 : 2 차 또는 3 차 령 유충의 경우, 마이크로 피펫 팁의 끝이 면도날을 절약 할 수. </li><li> 해부 현미경, 집게를 사용하여 자신의 등쪽면이 위로 개별 샘플을 맞 춥니 다. 참고 : RG는 그림 2A (뇌의 등쪽에 위치). 이 정렬은 촬영하는 동안 각각의 샘플의 사양을 용이하게합니다. </li><li> 유리 슬라이드를 기울이고 가능한 한 많은 초과 PBT를 닦아. 슬라이드 측에 장착 시약의 방울을 넣어. 드롭의 다른 측으로부터 커버 슬립의 가장자리에 놓고 집게 천천히 시료의 커버 슬립을 넣어. 참고 :이 절차는 커버 슬립 외부 이동 샘플을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 4 ℃에서 샘플을 저장합니다. 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 난소의 해부에 성인 여성 <ol><li> 성인 여성의 준비 <ol><li> 3-4일가 난소를 풍부하게하는 피드 여성 표준 효모 / 옥수수 가루 플라이 음식을 날아. 25 ° C에서 유지한다. </li></ol></li><li> 성인 여성 난소의 해부 <ol><li> 여성은 CO 2 가스 파리 마취와 자신의 머리를 잘라. </li><li> 3 센티미터 접시에 플라이 몸을 이동PBS로 가득. </li><li> 해부 현미경, 집게를 사용하여 등쪽 측의 가슴을 누르고 있습니다. 다른 집게 복부 세그먼트 또는 A5 A6를 잡고 후방 측으로 복부 표피를 벗겨. 포셉의 끝에서 끈적 끈적한 표피를 닦아냅니다. </li><li> 난관을 조이고 몸에서 난소를 꺼내. </li><li> 빗과 집게와 난소의 팁을 확산. 참고 :이 작업은 면역 염색의 효율성을 향상시킨다. </li></ol></li><li> 성인 여성의 뇌, VNC 및 생식 기관의 해부. 참고 :이 방법은 난소의 신경 분포가 그대로 유지 될 수 있습니다. <ol><li> 여성은 CO 2 가스 파리 마취하고 PBS로 가득 실리콘 코팅 접시로 전송. </li><li> 해부 현미경 하에서, 코를 잡고 집게로 뇌를 노출 머리의 표피를 벗겨. 뇌에 부착 된 기관을 제거합니다. 참고 : 꼰 로프n은 백색 둥근 구조이다. 뇌는 흉부에 VNC에 연결합니다. </li><li> 등쪽 측의 가슴을 잡고 포셉 한 쌍의 다리와 날개를 잘라. 포셉의 다른 쌍을 사용하여 다리의 기지에서 흉부 복부 표피를 벗겨. VNC를 노출되면, VNC 사용하는 집게에 부착 된 잔류 등의 표피와 근육을 제거합니다. 뇌와 VNC 사이의 연결이 손상되지 않도록주의하십시오. </li><li> 복부 표피를 벗겨과 난소 및 신경 세포, 작물, 창자, 난관, 자궁, 그리고 악세사리 글 랜드를 비롯한 대화 형 장기 노출 집게를 사용합니다. </li><li> 기관과 집게를 사용하여 지방을 몸을 포함한 잔여 조직을 제거합니다. </li></ol></li><li> 고정과 함께 면역 조직 염색 <ol><li> 250 μL로 채워진 1.5 ㎖의 마이크로 튜브에 고정 용액 난소 약 8-10 쌍 트랜스퍼 (4 % paraformaPBS에서 ldehyde) 및 RT에서 30 분 동안 샘플을 배양한다. </li><li> 500 μL PBS와 수정 솔루션을 교체하고 신속하게 샘플을 3 회 씻어. </li><li> RT에서 5 분마다 샘플을 500 μL의 0.1 % PBT 2 회 반복한다. </li><li> 차단 솔루션 50 μL와 PBT를 교체합니다. RT에서 로커에서 1 시간 동안 샘플을 인큐베이션. </li><li> 50 μL 차 항체 용액으로 블로킹 용액을 대체. </li><li> 밤새 4 ℃에서 로커에 샘플을 인큐베이션. </li><li> 500 μL 0.1 % PBT와 차 항체 용액을 대체. RT에서 15 분간 로커 각 500 μL 0.1 % PBT와 샘플 3 회 반복한다. </li><li> 50 μL 차 항체 용액 0.1 % PBT 바꾸기. 핵 염색을 위해, 50 μL 용액 0.5 μL를 추가 DAPI. RT에서 로커에서 2 시간 동안 샘플을 인큐베이션. </li><li> 500 μL 0.1 % PBT와 이차 항체 용액을 대체. 500 μL 0.1 % PBT로 시료를 3 회 반복<html> RT에서 15 분간 로커마다. 참고 : 세척 절차를 4 ° C에서 하룻밤을 수행 할 수 있습니다. 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오. </li></ol></li><li> 유리 슬라이드에 샘플을 장착 <ol><li> 0.1 % PBT는 마이크로 피펫을 이용하여 유리 슬라이드에 시료를 옮긴다. 참고 : 해부 및 장착시 불편 거품을 방지하기 위해, 0.1 % PBT PBS로 교체 할 수 있습니다. </li><li> 난소를 들어, 해부 현미경 집게 서로로부터 ovarioles의 문자열을 분리한다. germaria를 포함하는 ovarioles의 팁을 손상하지 마십시오. 뇌-VNC-생식 기관의 복잡한 경우, 잔류 표피를 제거하고 유리 슬라이드의 위치를 ​​배열합니다. </li><li> 가능한 한 많은 초과 PBT를 닦아 및 샘플의 중앙에 장착 시약 한 방울을 넣어. 천천히 집게를 사용하여 커버 슬립을 놓습니다. </li><li> 4 ℃에서 샘플을 저장합니다. 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오. </li></ol></li></ol>공 초점 레이저 주사 현미경과 함께 &quot;&gt; 3. 영상 <ol><li> 현미경으로 샘플을 관찰하고보기의 필드에 steroidogenic 기관을 가지고. 뷰가 고정되면, 화상 취득 모드로 촬상 시스템을 전환. 참고 : 10-20X의 대물 렌즈는 뇌-RG의 복잡하거나 전체 난소의 이미지를 얻기 위해 사용된다. 이와 달리, 대물 렌즈 40-63X (물 또는 오일 침지) GSC를 또는 PG 및 난소 신경 신경 밀도 단백질의 세포 내 위치 파악 시각화 사용된다. </li><li> 첨부 된 소프트웨어 이미지 수집의 매개 변수를 설정합니다. 형광의 조합 (예 : GFP 및 RFP)를 선택합니다. 고속 스캔 절차에 의해, 레이저 파워 검출기의 감도 (이득 / 오프셋), 및 핀 홀의 크기를 조절한다. 주 : 고품질의 이미지를 획득하기 위해, 주사 레이저 파워 검출기 (게인)의 감도는 각각의 샘플에 대해 최적화되어야한다. 모양을 간략하게 설명합니다조직에, 전송 된 광 화상을 형광 영상에 더하여 수행 될 수있다. </li><li> 이미지의 Z 스택을 가져 가라. 연속 빠른 스캔하는 동안, 현미경의 초점 거리와 초점면을 이동하고 시작 위치와 종료 위치를 설정합니다. 슬라이스의 수와 조각 사이의 간격 거리를 적절하게 조정된다. </li><li> 스캔 속도, 스캔 방법 및 양방향 스캔 모드를 선택합니다. </li><li> 이미지 수집을위한 &quot;실제 스캔을 시작합니다.&quot; </li><li> 첨부 된 소프트웨어의 형식으로 이미지를 저장합니다. 참고 : 원본 이미지 파일은 이미지 수집 매개 변수와 비늘의 정보가 포함되어 있습니다. 보낸 이미지는 컴퓨터 (22)에 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 처리 될 수있다. </li></ol>

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Biol. 386 (2), 408-418 (2014).</li><li>Song, X., Zhu, C. -. H., Doan, C., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+anchored+by+adherens+junctions+in+the+Drosophila+ovary+niches.">Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches.</a> Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).</li><li>Niwa, Y. S., Niwa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+control+of+steroid+hormone+biosynthesis+during+development+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).</li><li>Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+Rieske+oxygenase+DAF-36/Neverland+is+a+novel+cholesterol-metabolizing+enzyme.">The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme.</a> J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).</li><li>Niwa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-molting+glossy/shroud+encodes+a+short-chain+dehydrogenase/reductase+that+functions+in+the+&amp;#34;Black+Box&amp;#34;+of+the+ecdysteroid+biosynthesis+pathway.">Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the &amp;#34;Black Box&amp;#34; of the ecdysteroid biosynthesis pathway.</a> Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).</li><li>Komura-Kawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Zinc+Finger+Transcription+Factor+Ouija+Board+Controls+Ecdysteroid+Biosynthesis+through+Specific+Regulation+of+spookier.">The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier.</a> PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).</li><li>Yamanaka, N., Marqu&#233;s, G., O'Connor, M. 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Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).</li><li>Owald, D., Lin, S., Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light,+heat,+action:+neural+control+of+fruit+fly+behavior.">Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior.</a> Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 ecdysteroid 생합성 및 D. melanogaster의에서의 규제 메커니즘을 연구하고, 해부 및 면역 염색을위한 프로토콜을 고안했다. ecdysteroid 생합성의 타이밍은 신경 입력 큐 (33)의 환경에 의해 영향을받는, 그래서 박리시 뇌 VNC 및 다른 조직과 함께 ecdysteroidogenic 기관의 신경 분포를 유지하기 위해 필수적이다. 전술 한 바와 같이, D. melanogaster의...

다세포 생물에서는 세포의 그룹은 몸 전체에 필수적인 그들의 생체 활동의 전문 기능을 부여한다. 자신의 임무를 완수하기 위해 각 조직이나 기관의 기능과 관련된 유전자의 일련의 표현과 발전의 맥락에서 자신의 활동을 조율하기 위해 다른 조직과 통신한다. 이러한 전문적인 세포 기능과 간 장기 상호 작용을 특성화하기 위해, 우리는 다른 종류의 세포가 다세포 구조에서 그대로 유지되고 함께 세포의 그룹을 지정해야합니다. 이러한 전문 기관의 한 예는 많은 생합성 효소가 활성화 스테로이드 호르몬 1 콜레스테롤에서 변환 단계를 중재 steroidogenic 기관이다. 이러한 효소 유전자의 대부분은 기관 steroidogenic 구체적으로 표현되고, 생합성 경로 단단히 체액 입력 및 신경 입력을 통해 다수의 외부 자극에 의해 조절된다. 일단합성 스테로이드 호르몬은 체액으로 분비되는 유전자 (2)의 다양한 종류의 발현을 조절하기위한 여러 조직 및 기관을 대상으로한다. 따라서, 스테로이드 호르몬의 작용은 항상성, 성장 및 재생을 유지하기 위해 전신 반응을 유도한다. 스테로이드 호르몬 생합성 기능 및 스테로이드 호르몬의다면 발현 성 행동을 조사, 노랑 초파리은 적합한 모델 시스템으로 사용할 수있다. 애벌레 단계 동안, 곤충 스테로이드 호르몬, ecdysteroid가, 전문 내분비 기관에서 생합성되는 것은 prothoracic 글 랜드 (PG)을 3이라고합니다. PG에서, 여러 ecdysteroidogenic 효소 특히 적절한 발달 단계 4에서 탈피하고 변태 제어하는 에크 디손로 콜레스테롤로부터 여러 전환 단계를 촉매. 따라서 ecdysteroid 역가 동적 변화 규제환경 단서에 따라 많은 신호 전달 경로에 의해. 한편, 성인 단계에서 ecdysteroid은 재생, 수면, 메모리 및 수명 5, 6, 7, 8을 포함하여 생리에 중요한 역할을한다. 이는 적극적 ecdysteroid oogenesis 6, 7, 8, 9, 10, 11의 진행을 조절 난소 생합성하는 것으로 알려져있다. 최근 우리는 배아 줄기 세포 (GSC를)의 개수가 정합에 응답 ecdysteroid 성 펩티드 및 시그널링에 의해 영향을받는 것으로보고 (12)를 자극했다. D.의 강력한 도구가 잘 주석 게놈 정보를 포함 유전학 및 세포 생물학을, melanogaster의 이진 유전자발현 시스템 및 유전자의 RNAi 기술은 PG 및 난소 13, 14, 15 생합성을 ecdysteroid 필수적인 유전자를 식별 할 수있게했다. ecdysteroidogenic 유전자가 식별되면, 이러한 유전자 및 유전자 산물의 동적 지역화의 전사 조절은 생합성 경로 (16)에 조사 될 수있다. 이를 위해, 정량적 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응은 동일계 하이브리드 화 및 면역 조직 RNA 분석을 실시한다. 이러한 기술의 적용은 어려운 과제를 포함하고; PG 또는 난소의 정교한 해부. 특히, 초파리의 PG는 다른 곤충에 비해 상대적으로 작은 (예 : 누에와 타격 비행은), 그래서 하나는 과일의 중요한 기술이 샘플링 해부 비행 연습을 할 필요가있다. 또한, 두 ecdysteroidogenic 기관은 신경 분포를받을중추 신경계 (CNS) 17, 18, 19, 20 S. 따라서, 정확한 해부학 적 분석을 위해 상기 장기 ecdysteroidogenic은 CNS 및 다른 기관들은 신경 연결을 방해하지 함께 그대로 유지한다. 여기에서 우리는 해부와 D의 steroidogenic 기관의 시각화를위한 프로토콜을 제공합니다. melanogaster의. 해부 기술을 배우는 것은이 실험에 대한 중요한 출발점이 될 것입니다. 또한, 하나는 성공적으로 여러 항체 및 GAL4 드라이버 라인으로 steroidogenic 기관뿐만 아니라 상호 작용하는 기관에 레이블을 지정할 수 있습니다. 이러한 기술, 재료 및 유전학을 활용, 하나는 스테로이드 호르몬 생합성의 포괄적 인 메커니즘을 연구 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;egg collection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tissue culture dish (55 mm)</td><td>AS ONE</td><td>1-8549-02</td><td>&amp;nbsp;for grape-juice agar plates</td></tr><tr><td>collection cup</td><td>HIKARI KAGAKU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>yeast paste</td><td>Oriental dry yeast, Tokyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% grape juice</td><td>Welch Food Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;rearing larvae&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>small vials (12ml, 40&amp;times;23.5 mm, PS)</td><td>SARSTEDT</td><td>58.487</td><td></td></tr><tr><td>disposable loop</td><td>AS ONE</td><td>6-488-01</td><td></td></tr><tr><td>standard fly food</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;the recepi us on the website of Blooington stock center.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;dissection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dissecting microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>S8 AP0</td><td></td></tr><tr><td>tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated)</td><td>IWAKI</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>TORAY</td><td></td><td>coarting silicon inside dishes</td></tr><tr><td>Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)&amp;nbsp;</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td>A &quot;knife&quot; to cut the tissue</td></tr><tr><td>forceps, Inox, #5</td><td>Dumont, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>insect pin (0.18 mm in diameter)</td><td>Shiga Brand</td><td></td><td>for fillet dissection</td></tr><tr><td>micro scissors</td><td>NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.&amp;nbsp;</td><td>MB-50-10</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;fixation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultrapure water</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Nacalai tesque</td><td>16222-65</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Nacalai tesque</td><td>02890-45</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (1.5 ml)</td><td>INA OPTIKA</td><td>CF-0150</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Incubation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>As one swist mixer TM-300 (rocker)</td><td>As one</td><td>TM-300</td><td>rocker</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;primary antibody&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-Sro (guinea pig), 1:1000</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP (rabbit), 1:1000</td><td>Molecular Probes</td><td>A6455</td><td>Shimada-Niwa ans Niwa, 2014</td></tr><tr><td>anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100</td><td>Nakarai tesque</td><td>04363-66</td><td></td></tr><tr><td>anti-5HT (rabbit), 1:500</td><td>SIGMA</td><td>S5545</td><td></td></tr><tr><td>anti-Hts 1B1 (mouse)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>1B1</td><td></td></tr><tr><td>anti-DE-cadherin (rat), 1:20</td><td>DSHB</td><td>DCAD2</td><td></td></tr><tr><td>anti-nc82 (mouse), 1:50</td><td>DSHB</td><td>nc82</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;secondary antibody&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A-11081</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A-21435</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A-22283</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mounting reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro slide glass</td><td>Matsunami Glass Ind.,Ltd.</td><td>SS7213</td><td></td></tr><tr><td>Square microscope cover glass</td><td>Matsunami Glass Ind.,Ltd.</td><td>C218181</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave reagent (Mounting reagent)</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper)</td><td>WATSON</td><td>5660-222-1S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;imaging&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 laser scanning microscope system</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>inverted Axio Observer. Z1 SP left</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;image processing&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fly stocks&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w; GMR45C06-GAL4</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)</td></tr><tr><td>UAS&amp;ndash;GFP; UAS&amp;ndash;mCD8::GFP</td><td></td><td></td><td>gifts from K. Ito, The University of Tokyo.</td></tr><tr><td>w[1118]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4</td><td></td><td></td><td>see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. &amp;amp; Kravitz, E. A.(2010)</td></tr><tr><td>w; UAS-mCD8::GFP</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)</td></tr><tr><td>yw;; nSyb-GAL4</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)</td></tr></tbody></table>

protocols for visualizing steroidogenic organs and their interactive organs with immunostaining in the fruit fly drosophila melanogaster

다세포 생물에있어서, 세포의 작은 그룹은 성장과 재생에 대한 조직 반응을 유도하는 그들의 생물학적 활성의 특수한 기능을 부여한다. 곤충, 애벌레 prothoracic 글 랜드 (PG) 및 ecdysteroids라는 주요 스테로이드 호르몬 생합성에있는 성인 여성의 난소 플레이 필수적인 역할. 이러한 기관은 ecdysteroidogenic 생합성 타이밍 큐 환경에 의해 영향을 받는다되는 신경계에서 신경 지배된다. 여기에서 우리는 스테로이드 호르몬 생합성과 규제 메커니즘을 연구하기위한 적절한 모델 시스템을 제공 초파리 melanogaster의를 비행 ecdysteroidogenic 기관과 유충에서의 대화 형 기관과 과일의 성인을 시각화하는 프로토콜을 설명합니다. 숙련 된 해부은 우리가 뇌, 복부 신경 코드 및 다른 조직을 포함하여 ecdysteroidogenic 기관의 위치와 그들의 상호 작용하는 기관을 유지할 수 있습니다. 로모그래퍼 면역 염색ecdysteroidogenic 효소에 대한 ntibodies는 조직 - 특이 적 프로모터에 의해 구동 형질 전환 형광 단백질과 함께 ecdysteroidogenic 세포를 레이블을 사용할 수 있습니다. 또한, ecdysteroidogenic 기관의 신경 밀도는 특정 항체 또는 신경의 여러 유형에 GAL4 드라이버의 집합으로 분류 될 수있다. 따라서 ecdysteroidogenic 기관과 신경 세포의 연결은 면역 염색 및 형질 전환 기술에 의해 동시에 시각화 할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 누구의 증식과 유지 보수 ecdysteroids에 의해 제어되는 배아 줄기 세포를 시각화하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 스테로이드 호르몬 생합성과 신경 규제 메커니즘의 포괄적 인 이해에 기여한다.

우리는 steroidogenic 기관 및 D. melanogaster의 유충과 성인 여성에서의 대화 형 장기를 시각화하기 위해 위의 프로토콜을 사용했다. 프로토콜의 전체 구조는 그림 1과 같다. PG (도 2D), 뇌보다 더 작고 더 투명하고, 뇌 (도 2A 및 3A-C-E)의 전방 - 등쪽 측에 위치하고 포함 RG. PG 셀 라벨을 여러 그룹 ecdysteroidogenic 효소에 대한 항체의 다양한 형태를 ?...

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Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

우리는 해부, 고정, 스테로이드 호르몬 생합성과 규제 메커니즘을 연구하는 초파리 유충과 성인 여성의 steroidogenic 장기의 면역 염색을위한 프로토콜을 설명합니다. steroidogenic 기관뿐만 아니라, 우리는 배아 줄기 세포로 steroidogenic 기관의 신경 분포뿐만 아니라 steroidogenic 표적 세포를 시각화.

과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜<em&gt; 노랑 초파리</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

10.4K 조회수.  University of Tsukuba.  우리는 해부, 고정, 스테로이드 호르몬 생합성과 규제 메커니즘을 연구하는 초파리 유충과 성인 여성의 steroidogenic 장기의 면역 염색을위한 프로토콜을 설명합니다. steroidogenic 기관뿐만 아니라, 우리는 배아 줄기 세포로 steroidogenic 기관의 신경 분포뿐만 아니라 steroidogenic 표적 세포를 시각화. 

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Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

연구

발생학

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

의 형광 라벨링 Drosophila 심장 구조

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

생물학

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and apoptosis, development and ageing, to neuronal synaptic plasticity and regeneration have been associated with Ryanodine receptors (RyRs). Despite the importance of calcium signaling, the exact mechanism of its function in early development is unclear. As an organism with a short gestational period, the embryos of Drosophila melanogaster are prime study subjects for investigating the distribution and localization of CICR associated proteins and their regulators during development. However, because of their lipid-rich embryos and chitin-rich chorion, their utility is limited by the difficulty of mounting embryos on glass surfaces. In this work, we introduce a practical protocol that significantly enhances the attachment of Drosophila embryo onto slides and detail methods for successful histochemistry, immunohistochemistry, and in-situ hybridization. The chrome alum gelatin slide-coating method and embryo pre-embedding method dramatically increases the yield in studying Drosophila embryo protein and RNA expression. To demonstrate this approach, we studied DmFKBP12/Calstabin, a well-known regulator of RyR during early embryonic development of Drosophila melanogaster. We identified DmFKBP12 in as early as the syncytial blastoderm stage and report the dynamic expression pattern of DmFKBP12 during development: initially as an evenly distributed protein in the syncytial blastoderm, then preliminarily localizing to the basement layer of the cortex during cellular blastoderm, before distributing in the primitive neuronal and digestion architecture during the three-gem layer phase in early gastrulation. This distribution may explain the critical role RyR plays in the vital organ systems that originate in from these layers: the suboesophageal and supraesophageal ganglion, ventral nervous system, and musculoskeletal system.

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Here, we describe a protocol for detection and localization of Drosophila embryo protein and RNA from collection to pre-embedding and embedding, immunostaining, and mRNA in situ hybridization.

초기 초파리 배아 내의 면역조직화학 및 RNA 계내 분포를 위한 프로토콜

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

해부 그리고 스테 이닝 Drosophila 애벌레 난소

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

비행 고환에있는 영상 중심체

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서<em&gt; 초파리</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm development. However, immunolabeling of the whole Drosophila testis is often associated with significant non-uniformity of staining due to antibody penetration. Squashed preparations only partially overcome the problem since it decreases the 3D quality of the analyses. Herein, we describe a whole-mount protocol using NP40 and heptane during fixation together with immunolabeling in liquid media. It preserves the volume suitable for confocal microscopy together with reproducible and reliable labeling. We show different examples of 3D reconstitution of spermatocyte nuclei from confocal sections. The intra- and inter-testes reproducibility allows 3D quantification and comparison of fluorescence between single cells from different genotypes. We used different components of the intranuclear MINT structure (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) as well as two components associated with the nuclear pore complex to illustrate this protocol and its applications on the largest cells of the testis, the S4-S5 spermatocytes.

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

We present here an improved protocol for the whole-mount preparation and immunostaining of Drosophila testes, suitable for confocal microscopy and also allowing reproducible and reliable labeling. We illustrate this protocol by 3D representation and quantification of colocalization experiments on the large S4-S5 spermatocytes.

대형 정자 세포의 3D 공초점 분석을 위한 전산 Drosophila 고환의 면역 염색

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila melanogaster. Therefore, it is an excellent model to study heterochromatin formation and maintenance. Polytenized cells, such as the ones found in salivary glands of third instar D. melanogaster larvae, provide an excellent tool to observe the chromatin amplified nearly a thousand times and have allowed researchers to study changes in the distribution of heterochromatin in the nucleus. Although the observation of heterochromatin components can be carried out directly in polytene chromosome preparations, the localization of some proteins can be altered by the severity of the treatment. Therefore, the direct visualization of heterochromatin in cells complements this type of study. In this protocol, we describe the immunostaining techniques used for this tissue, the use of secondary fluorescent antibodies, and confocal microscopy to observe these heterochromatin aggregates with greater precision and detail.

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

This protocol aims to visualize heterochromatin aggregates in Drosophila polytene cells.

드로소필라 살리바리 땀샘의 이종로크로마티닌 관련 단백질의 시각화를 위한 면역형성 염색

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...

과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜

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