이 연구는 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 대표이사 (RO1 GM079351). 우리는 그녀의 원래 프로토콜에 따라 번데기 난소 해에 그녀의 유용한 조언에 대 한 Dorothea 좋음 감사 합니다. 우리는 또한 그녀의 지원 및 원고에 대 한 의견에 대 한에 이미 Reilein 감사합니다.

1입니다. EggLaying
<ol><li>결합 약 10 남자와 정상적인 풍부한 비행 음식 효 모와 보충의 유리병에 원하는 유전자의 15 여성 성인 초파리 파리. 유리병과 밀을 피하기 위해, 성관계 여성 더 이상 보다 2-4 h14에 대 한 계란을 낳을 수 없습니다.</li>
	<li>비행 음식 다른 유리병에 대 한 열기는 유리병을 활용 하 여 새로운 병으로 유리병에서 성인 전송. 계란 3-4 일 동안 실 온에서 애벌레로 개발을 허용 합니다.</li>
</ol>2. 여성 애벌레를 선택
<ol><li>소프트로 촉촉한 좋은 브러시를 사용 하 여, 잘 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 가득한 테두리에 유리를 유리병에서 방황 3 탈피 애벌레를 전송 유리병의 벽을 따라 브러시와 롤링 운동을 확인 합니다. 1 x PBS 가득 잘 다른 그들을 전송 하 여 애벌레에서 음식을 파편을 씻어.</li>
	<li>남성과 여성의 애벌레 집게를 사용 하 여 구분 합니다. 남성 애벌레, 라운드, 크고 반투명 testes의 앞쪽 끝15에서 아래로 몸 약 2/3의 측면 쪽에 뚱뚱한 몸에 포함 된의 쌍을 확인 합니다. 여성 애벌레 평균에 더 큰, 남성, 보다 덜 반투명 고 훨씬 작은 생식 선을 검출 하기가 더 어렵습니다.</li>
	<li>여성 애벌레를 수집 남성 애벌레에 대 한 선택 합니다. 우물에서 적어도 10 여성을 수집 합니다. 1 x PBS 잘 가득 별도 여성 애벌레를 놓습니다.</li>
	<li>부드럽게 신선한 비행 식품의 새로운 유리병에 여성 애벌레를 전송 집게를 사용 누 룩과 보충.</li>
	<li>Pupariation16을 촉진 하기 위하여 어두운 위치에서 여성 애벌레와 유리병을 놓습니다. 하루 동안, pupariation에 대 한 애벌레를 모니터링 합니다. 각 유 충 움직이게 하 고는 prepupa로 개발 하 고, 원형 유리병에 대 한 prepupa 고 때 처음에 prepupa 형성 하는 대략적인 시간을 기록 합니다. 앞쪽 spiracles의 돌출 및 puparium 형성17의 타이밍에 의해 prepupae를 식별 합니다. Prepupae (puparium 형성, APF 후 시간 측정) 원하는 시간 정도로 개발을 허용 합니다. 참고: 약 10 h 간격 내에서 puparium 형성을 받 다 어떤 동물 든 지 여겨질 수 있다는 prepupa. 자리를 차지 하는 내부 탈피 후 번데기 단계 puparium 형성 후 약 12 h를 시작 합니다.</li>
</ol>3. 항 체 얼룩이 Pupae 준비
<ol><li>
번데기 뚱뚱한 몸을 비운 나중 단계에서 사용 되는 얇은 유리 피펫으로 형성 합니다.
	<ol>
<li>분 젠 버너에 파스퇴르 피펫으로의 유리 팁을 녹여. 유리가 녹으면 집게를 사용 하 여 얇은 팁을 피펫으로의 나머지에서 가로로 팁을.</li>
		<li>냉각 후, 깔끔한 원형 개통을 형성을 피펫으로 팁의 일부를 끊다. 전구는 피펫으로의 다른 쪽 끝에 연결 합니다.</li>
		<li>1 x PBS와 피펫으로 로드.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유리병의 벽에 붙어 있다, pupae 수확 번데기와 유리병 사이의 접촉 영역에 따라 물 작은 방울을 적용 합니다. 단백질 수 있도록 1-2 분을 대기 접착제를 부드럽게 촉촉한 괜 찮 브러시와 벽에서 번데기를 해제 하기 전에 해산. 1 x PBS 가득 잘 유리에 번데기를 전송 합니다. 우물과 밀을 피하기 위해 번데기 당 단일 잘을 칩니다.</li>
	<li>한 쌍의 집게와 번데기의 후부 끝을 잡고, 번데기의 머리 표시 될 때까지 신중 하 게 다른 쌍 번데기 케이스의 앞쪽 부분을 눈물.</li>
	<li>집게와 번데기 머리의 앞쪽 대부분 팁을 부드럽게 당겨 번데기는 번데기 케이스에서. 참고: 뚱뚱한 몸 부분의이 과정 밖으로 유출 수 있습니다.</li>
	<li>하 고 복 부 자루만 남아 때까지 후부 반에서 번데기의 앞쪽 절반을 삭제 합니다.</li>
	<li>
복 부 자루에서 뚱뚱한 몸 세포를 추출 합니다.
	<ol>
<li>얇은 유리 피펫으로 1 x PBS 다른 손에 가득 들고 한 손에 집게와 우물의 바닥에 대 한 복 부 자루를 파악.</li>
		<li>번데기 난소 주변의 지방 신체 세포를 씻어 하 복 부에 자루와 천천히 피펫으로 1 x PBS의 개통으로 얇은 피펫으로 팁을 목표로 합니다. 참고: 난소는 한 쌍의 작은, 반투명, 전기, 및 직사각형 구조를 복 자루 안에 남아 있어야 한다.</li>
		<li>뚱뚱한 몸 세포 지방 시체의 2/3 이상 사라질 때까지 또는 난소 복 자루의 개통의 가까이 볼 수 있습니다 때까지 씻어. 그것은 매우 천천히이 단계를 실행 하는 것이 중요 사고에 의해 복 부 로부터 난소를 씻어 수 없습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>난소 뚱뚱한 몸을 셀 세척 하는 동안 밖으로 유출가지고 확인을 잘을 검사 합니다. 난소 안에 잘 볼 수 있다면, 그들은 복 부에 남아 있다 한다. 경우 난소 밖으로 서, 새로운 번데기에 잘 놓고이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>고정 버퍼 (1 x PBS, 4 %paraformaldehyde)으로 가득 분명 coverglass 챔버로 복 부를 전송 하 고 상단에는 뚜껑을 배치. 되도록 난소의 충분 한 수 견딜 얼룩 및 장착 과정 보다 더 많은 난소를 해 부. 주의: 고정 버퍼 paraformaldehyde 독성을 포함 합니다. 적절 한 보호 장갑, 안전 안경, 등등을 착용 하십시오.</li>
</ol>4입니다. Immunohistochemistry
<ol><li>착 색 과정을 통해 집게를 사용 하 여 부드럽게 밀어 어떤 부동 난소는 덮개 유리의 바닥에 난소 항 체 솔루션에 완전히 몰입 하는 보장 하기 위해.</li>
	<li>장소는 Nutator의 평평한 표면에 양면 테이프의 스트립 하 고 연 발된 coverglass 접착 표면에 장소.</li>
	<li>실 온에서 15 분 동안 3.7 단계에서 고정 버퍼에서 난소를 품 어.</li>
	<li>난소를 씻어 3 시간 1 %1 x PBS에 Triton X-100 5, 10, 및 45 분 (총에서 1 시간), 각각, 철저 한 permeabilization 수 있도록.</li>
	<li>1 x PBS 0.5%에서 10% 정상 염소 혈 청에서 난소를 차단 30 분 대 한 트라이 톤 X-100.</li>
	<li>600에서 난소를 밤새 품 어 선택의 1 차적인 항 체의 µ L 희석 0.5%와 1 x PBS에 적절 한 농도에 4 ° c.에 트라이 톤 X-100</li>
	<li>1 x PBS 0.5%에서 3 시간 5 분 동안 난소 린스 트라이 톤 X-100.</li>
	<li>선택의 이차 항 체의 600 µ L에 2 h 0.5%와 1 x PBS에 적절 한 농도를 희석 Triton X-100 실내 온도에 대 한 난소를 품 어.</li>
	<li>1 x PBS 0.5% 트라이 톤 X-100와 1 x PBS에 5 분 동안 한 번에에서 5 분 동안 두 번 난소를 씻어.</li>
</ol>5. 해 부하 고 번데기 난소를 장착
<ol><li>현미경 슬라이드에 1 x PBS의 작은 방울을 배치 합니다. 복 부 자루에서 연 발된 coverglass 유리 잘 전송 사용 집게 1 x PBS 가득 합니다. 우물과 밀을 피하기 위해 번데기 당 단일 잘을 칩니다.</li>
	<li>찢 어 떨어져 복 부 자루 및 모든 나머지 지방 시체 집게와. 참고: 작은, 반투명, 전기, 및 직사각형 구조는, 난소는 우물 안에 표시 되어야 합니다. 난소는 종종 밀접 하 게 지방 기관에 의해 포위, 모든 뚱뚱한 몸을 철저 하 게 늘 확인 하는 것이 중요 하다 그래서 떨어져.</li>
	<li>1 x는 집게의 끝 사이 난소의 중심을 파악 하 여 슬라이드를 현미경에 PBS의 드롭에 우물에서 난소를 전송. 그것은 매우 잃을 또는 전송 하는 동안 그들을 파괴 하는 것을 그렇게 하지 않도록 난소를 압박 하지 않고 확고 한 그립을 사용 하는 것이 중요. 솔루션을 시간이 지남에 밖으로 마르면 때 슬라이드에 1 x PBS의 몇 방울을 추가 합니다.</li>
	<li>일단 모든 난소는 해 부 하 고 현미경 슬라이드, 피펫으로 40 µ L 22 x 22 mm coverslip 장소 난소 위에 부드럽게 coverslip에 장착 매체의 전송. 슬라이드 이미징 전에 하룻밤을 건조 하 게.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Stem+Cell+Niches:+A+Decade+of+Discovery+Suggests+a+United+View+of+Stem+Cell+Regulation.">Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation.</a> Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li><li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ovary:+an+active+stem+cell+community.">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).</li><li>Dansereau, D. 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(51), e2537 (2011).</li><li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+of+the+Gonads+in+DROSOPHILA+MELANOGASTER.">The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).</li><li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference.">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).</li><li>Bainbridge, S., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Development. 66, 57-80 (1981).</li><li>Courdec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bric+&#224;+brac+locus+consists+of+two+paralagous+genes+encoding+BTB/POZ+domain+proteins+and+acts+as+a+homeotic+and+morphogenetic+regulator+of+imaginal+development+in+Drosophila.">The bric &#224; brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila.</a> Development. 129, 2419-2433 (2002).</li><li>Arrese, E. L., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=INSECT+FAT+BODY:+ENERGY,+METABOLISM,+AND+REGULATION.">INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION.</a> Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).</li><li>Zhang, Y., Xi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+Body+Development+and+its+Function+in+Energy+Storage+and+Nutrient+Sensing+in+Drosophila+melanogaster.">Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster.</a> J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).</li><li>Wong, L. C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Drosophila+Ovaries.">Dissection of Drosophila Ovaries.</a> J Vis Exp. (1), e52 (2006).</li></ol>

저자는 선언 하는 관심의 없습니다 충돌 있다.

이 프로토콜의 가장 중요 하 고 어려운 단계 고정 전에 번데기 난소의 준비를 포함 한다. 작고 뚱뚱한 몸 세포 번데기 복 부 내부에 의해 묻혀 난소 항 체와 함께 충분히 스테인드은,이 뿐만 아니라 복 부 자루에 큰 여 겸 자, 함께 눈물 하지만 방해 하는 뚱뚱한 몸을 셀 추출 하는 것이 중요 합니다 항 체에서의 난소 이 단계를 성공적으로 실행 해야 복 부 자루에서 뚱뚱한 몸 세포를 세척 하는 동안 ...

줄기 세포 연구 초파리 난소를 사용 하 여 줄기 세포 틈새1,2,,34의 첫 번째 문서부터 널리 확장 했다. 개발 도구의 계보 추적 유전자 초파리 난소 해 일반적으로 줄기 세포 계보를 연구 하는 데 사용 되었습니다 다음 하 고 줄기 세포 유지, 확산, 및 운명 줄기 세포 틈새에 경로 신호. 이러한 신호 통로의 지식 탈 선 줄기 세포 활동5,,67에서 발생 하는 암의 잠재적인 원인에 대 한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 그것은 또한 최근 여 포 줄기 세포 (FSCs)로 알려진 초파리 난소에서 체세포 줄기 세포 강하게 그들의 조직8의 여러 측면에서 포유류 장 줄기 세포를 닮은 표시 되었습니다. 이러한 이유로, 초파리 난소는 줄기 세포 행동을 공부 하기 위한 매우 유용한 모델 시스템.
이른 줄기 세포 개발 및 틈새, 마지막 줄기 세포 조직에 단서를 각각 제공 하는 애벌레와 성인 난소 번데기 난소는 생식 및 체세포 재구성 및 그들의 정체성을 확립 하는 중간 구조 9 , 10. 여러 연구 번데기 난소10,11,,1213에 조직 개발의 측면 검사, 질문 남아 있다 분화와 공간 조직에 관한 난소 세포 유형 번데기 개발 중. 특히, FSCs의 규격은이 기간 동안 발생합니다. 이 프로토콜 설명 해 부하 고 원하는 시간 지점에서 번데기 난소를 얼룩이 지는 방법-성인 단계를 자세하게는 애벌레에서 번데기 난소 개발 분석 시간 과정 실험에 사용할 수 있는 기술.
작은 크기, 반투명, 및 번데기 복 부 내에서 번데기 난소의 어려움에 대 한 계정,이 프로토콜 활용 도구 주문 품 얇은 밀고 파스퇴르 피펫으로 복 부 지방을 신체 조직에 항 체 접근을 방해를 제거 하는 난소입니다. 명확 하 고, 연 발 coverglass 번데기와 락는 "Nutator"에 난소에 gentler 플랫폼의 제공 더 큰 시야를 얼룩이 지는 항 체 중에 사용 마이몬과 Gilboa14애벌레 난소 해에 대 한 프로토콜에 따라, Triton X-100의 상대적으로 높은 농도 고용 착 절차의 초기 단계에서 세포 막 permeabilization 및 항 체에 대 한 액세스를 극대화 하는 난소 세포입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps, biology</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-10A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 Depression Glass Spot Plates</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet bulb</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm glass coverslips No 1</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutator</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine brush #0, #3-#5</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman Starter Kit</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F167300</td>
			<td>Contains p20, p200, p1000 pipettors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9624</td>
			<td>Dilute to 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>5000121</td>
			<td>Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000)</td>
			<td>Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore)</td>
			<td></td>
			<td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum)</td>
			<td>Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly vials</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>V9406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Balls, For Wide Vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>51-102W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast, Bakers Dried Active</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>101400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly food</td>
			<td>Produced in laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Mixture of water, brewer&#39;s yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and staining of drosophila pupal ovaries

성인 초파리 난소와 달리 번데기 난소는 상대적으로 어려운 액세스 하 여 검사 때문에 그들의 작은 크기, 반투명, 번데기 케이스 내 인. 번데기 난소를 해 부의 도전 또한 번데기 내의 그들의 물리적 위치에 속 인 다: 난소 번데기 복 부 내부 지방 신체 세포로 둘러싸여 있으며, 적절 한 항 체 얼룩이 지기 수 있도록 이러한 지방 세포를 제거 해야 합니다. 이러한 문제를 해결 하려면이 프로토콜 번데기 복 부에서 지방을 신체 세포를 추출 하는 사용자 지정 된 파스퇴르 pipets를 사용 합니다. 또한, 연 발된 coverglass 대신 사용 된다 microcentrifuge 튜브 착 과정 중 번데기의 가시성을 개선 하기 위해. 그러나, 이들과 다른 장점이이 프로토콜에 사용 되는 툴,에 불구 하 고 이러한 기술의 성공적인 실행 될 수 있습니다 여전히 번데기 난소의 작은 크기로 인해 연습의 몇 일. 이 프로토콜에서 설명 하는 기술은 난소 번데기 개발의 다양 한 단계에서 분석 하는 시간 과정 실험에 적용할 수 있습니다.

이 절차의 성공적인 실행 명확한 항 체는 그 구조와 초파리 번데기 난소의 세포 조직 얼룩 발생 한다. 이 프로토콜에서 설명 Immunohistochemistry 애벌레와 성인 난소에 얼룩진 일반적으로 셀 형식을 식별 하 사용할 수 있습니다. 셀에서 파생 된 번데기 줄기의 메뚜기 세포18 (흰색에서 Fasciclin III에 의해 제시 된)는 그림 3에 표시 됩...

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Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Drosophila 난소 줄기 세포 틈새 시장 개발을 공부 하는 우수한 모델 시스템입니다. 애벌레와 성인 난소를 해 부 방법 출판 되었습니다 비록 번데기 난소 해 자세히 게시 되지 않은 다른 기술이 필요 합니다. 여기 우리는 해 부, 얼룩, 번데기 난소를 장착 한 프로토콜 개요.

해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

9.3K 조회수.  Columbia University. Drosophila 난소 줄기 세포 틈새 시장 개발을 공부 하는 우수한 모델 시스템입니다. 애벌레와 성인 난소를 해 부 방법 출판 되었습니다 비록 번데기 난소 해 자세히 게시 되지 않은 다른 기술이 필요 합니다. 여기 우리는 해 부, 얼룩, 번데기 난소를 장착 한 프로토콜 개요.

비디오: Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 번데기 눈

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

연구

발생학

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

문화 공동 문화 마우스의 난소와 난소

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

애벌레 Zebrafish의 생식소 조직의 해부

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

마우스 배아 신장의 해부 및 배양

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells named wing imaginal discs formed during embryonic development. In the larval stages the imaginal discs grow, increasing its number of cells and forming monolayered epithelial&#160;structures. Inside the pupal case, the imaginal discs bud out and fold into bilayers along a line that becomes the future margin of the wing. During this process, the longitudinal primodia veins originate vein cells on the prospective dorsal and ventral surfaces of the wing. During the pupal stage the stripes of vein cells of each surface communicate in order to generate tight tubes; at the same time, the cross-veins begin their formation.
With the help of appropriate molecular markers, it is possible to identify the major elements composing the wing during its development. For this reason, the ability to accurately detect transcripts or proteins in this structure is critical for studying their abundance and localization related to the development process of the wing.
The procedure described here focuses on manipulating pupal wings, providing detailed instructions on how to dissect the wing during the pupal stage. The dissection of pupal tissue is more difficult to perform than their counterparts in third instar larvae. This is why this approach was developed, to obtain rapid and efficient high quality samples. Details of how to immunostain and mount these wing samples, to allow the visualization of proteins or cell components, are provided in the protocol. With little expertise it is possible to collect 8-10 high quality pupal wings in a short amount of time.

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

The ability to accurately detect transcripts or proteins in Drosophila tissues is critical for studying their abundance and localization related to the development process. Here is the description of a straightforward procedure to dissect pupal wings. These wings can be used as samples in several techniques (immunohistochemistry, PCR assay, etc.).

번데기 날개 초파리 Immunodetections 또는 PCR 분석 실험에 적합의 해 부를 신속 하 고 효율적인 방법

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

전체 산 면역 형광 및 교양된 마우스 난소의 여 포 정량화

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

녹고, 경작, 그리고 초파리 셀 라인 Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.