이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 부여에 의해 지원되었다.

1. 1 일 전에 시작 : 파리의 건강한 인구는 표준 culturing 프로토콜을 사용하여 유지되어야합니다 달걀 누워 개발 제 3 instar의 애벌레가 pupariation를 시작 방황 때까지 일정한 온도에서 진행하는 허용의 3~4일 후 병 또는 튜브에서 성인을 제거하십시오. 애벌레 / pupal 전환은 prepupae (0시간 번데기 형성 - APF 이후로 간주)의 형성에 의해 표시됩니다. 고정되어 pupae들은 흰색 착색에 의한 구형 pupae에서 아직 자신의 직사각형, 둥근 모양과 앞쪽에 spiracles의 돌출부에 의해 pupariation을 시작하지 않은 애벌레 구분할 수 있습니다. 당신이 필요합니다 : <ul><li> pupae를 수집하기 위해 페인트 브러시 </li><li> culturing의 pupae에 대한 습기 챔버 : 페트리 접시는 침수 종이 타월로 줄지어 있고 pupae의 수집, 유전자형이나 섹스의 다양한 시간 포인트 표시된 필터 종이로 덮여 </li><li> 1X 인산이 pupae를 세척을위한 식염수 (PBS)를 버퍼 </li></ul> 수집, culturing 및 스테이징 pupae <ol><li> 침수 붓을를 사용하면 부드럽게 문화 병 / 유리병에서 0hr APF pupae를 제거하고 습기 챔버의 뚜껑에 배치합니다. </li><li> 화필 및 1X PBS를 사용하면 부드럽게 번데기 케이스에서 파편을 제거하는 pupae을 씻어 </li><li> 필요한 정렬 섹스 pupae 경우. pupae의 생식선 primordia는 남녀를 정렬하는 데 사용할 수 있습니다. 남성 생식선의 primordia 쉽게 약 삼분의이 본문 5 길이 아래 pupal 표피를 통해 본 반투명 디스크 측면 쌍의 수 있습니다. 여성 생식선의 primordia 작은되며 쉽게 식별하지 않습니다. </li><li> 습한 챔버에 적절하게 표시된 위치에 pupae을 놓고 일정 온도로 돌아갑니다. 적절한 발달 시점에 문화. </li></ol> 2. 주 2 : 해부, 고정 및 기본 항체 인큐베이션 전에 시작 : 당신이 필요합니다 : <ul><li> 해부의 stereomicroscope </li><li> 외과 포셉 </li><li> 11 번 블레이드로 외과 메스 </li><li> 두 아홉 잘 유리 우울증 요리 (코닝 제품 # 7220-85) <ul><li> 1X PBS 한 접시의 우물을 채우기 : 이것은 해부 pupae 청소 rinsing 요리 </li><li> 고정 버퍼와 두번째 접시의 우물을 작성 </li></ul></li><li> 항체 보육에 대한 습기 챔버. 우리는 침수 종이 타올로 늘어선 플라스틱 sealable 샌드위치 상자를 사용합니다. </li><li> 고정 버퍼 : 1X PBS, 4 % paraformaldehyde, 0.2 % deoxycholic 산성 (permeabilization에 대한) </li><li> 해부 플랫폼 : 한쪽으로 준수 양면 테이프 조각 맑은 현미경 슬라이드 </li><li> 1X PBS </li><li> p100 또는 p200 pipettor </li></ul> 해부 <ol><li> 포셉을 사용하면 부드럽게 한 번에 pupae 하나를 제거하고 테이프의 광범위한 너비를 직면하고있는 pupae의 앞쪽에 끝이 해부 플랫폼에서 그들을 놓으십시오. pupae이 지나치게 서부 유럽 표준시있다면, 먼저 그들을 종이 타월을 사용하여 건조 얼룩. </li><li> pupae 완전히 테이프 준수 전에 그들을 위치로 붓을을 사용합니다. </li><li> 공기 건조에 pupae 허용하고 테이프 (5-10 분)을 준수 </li><li> 수술 메스 양자 각 pupae을 해부하다. 이것은 가장 앞쪽에에서 pupae의 뒷부분 끝까지 하나의 신속한 상처로 수행됩니다. 정상적으로 완료하면, 상처는 앞쪽에 및 사후 모두 spiracles 쌍을 이등분합니다. 세정 빠르게 조직 proteolytic 손상을 방지하기 위해 필요한 샘플을 청소로 한 번에 10 개 이상 pupae을 해부하다. </li><li> 붓을 사용하여 테이프에서 그들을 느슨하게 각 해부 pupae에 1X PBS의 작은 금액을 전송합니다. </li></ol> 청소, 고정 및 기본 항체 인큐베이션 <ol start="6"><li> 외과 포셉 한 쌍이 anteriorly 개별 번데기의 절반을 파악하고 즉시 rinsing 요리의 잘에 젖어 함께. 해부 플랫폼은 현미경 무대에 rinsing 음식으로 대체해야합니다. 처리가 완료되고 샘플 장착을위한 준비가 될 때까지 pupae 케​​이스는 표본에 남아 있어야합니다. </li><li> 아직 붙잡는 동안 번데기의 절반 부드럽게 복부의 내부 조직을 떠나 씻어 pipettor을 사용합니다. 세척하는 동안 너무 많은 압력이 상피 세포의 손실로 이어질 수 있습니다. </li><li> 즉시 상온에서 고정 버퍼에 깨끗한 번데기의 절반을 전송 마찬가지로 남아있는 번데기의 절반을 처리합니다. 연습, 해부 20 번데기의 반쪽의 세척은 5 분도 채 안 걸릴한다로. </li><li> pupae 1 (하나) 시간 실온에서 고정 버퍼에 품어 수 있습니다. </li><li> 1X PBS에서 수정 pupae 배 오분을 씻어 </li><li> 샘플은 즉시 immunohistochemistry를 위해 처리될 수 있습니다 또는 최대 3 개월까지 셀 또는 에피토프 반응의 손실없이 -20 ° C에서 100 % 에탄올에 저장되어있을 수 있습니다. </li><li> 샘플을 저장하려면, 희석을 통해 샘플을 평형PBS의 시리즈 : 전 100 % EtOH로 전송하기 위해 각 희석에 20 분 실온에서 EtOH (3시 1분, 1시 1분, 1시 3분). </li><li> 샘플 immunohistochemistry에 대한 처리하기 전에 반대 시리즈를 통해 PBS에 다시 equilibrated해야합니다. </li><li> 차 항체를 추가하기 전에 1 (하나) 시간 1X PBS (2 % 소 혈청 알부민과 보충)에서 샘플을 차단합니다. </li><li> 4 박 이상의 1X PBS 적절한 농도로 희석 차 항체 ° 락을하지 않고도 C와 부화. </li></ol> 3. 3 일 : 보조 항체 보육, 장착 및 이미징 전에 시작 : 당신이 필요합니다 : <ul><li> 두 외과 포셉 </li><li> 마운트 미디어 (글리세롤, Vectashield [벡터 연구소] 또는 Slowfade 골드 [Invitrogen]) </li><li> 우울증 잘 현미경 슬라이드 (0.8 ㎜) </li><li> Coverslips (24 X 40mm) </li></ul> 차 항체 보육 및 장착 : <ol><li> 샘플에게 배 십분 1X PBS로 각각 씻으십시오 </li><li> 이차 항체를 추가하기 전에 1 (하나) 시간 1X PBS (2 % 소 혈청 알부민과 보충)에서 샘플을 차단합니다. </li><li> 3 (세) 시간 락을없이 어둠 속에서 실온에서 1X PBS 적절한 농도로 희석 차 항체와 부화. </li><li> 샘플에게 배 십분 1X PBS로 각각 씻으십시오 </li><li> 적절한 경우, counterstain pupae (우리는 DAPI로 핵을 얼룩 예제 [4 &#39;, 6 diamidino - 2 - phenylindole] 10 분 동안 PBS에 희석). </li><li> 장착하기 전에 적절한 미디어에 샘플을 (30 분 최소) 평형. </li><li> 샘플 슬라이드를 준비합니다. pupae의 형태 플랫 장착을 방지합니다. 샘플은 이미지에 대한 우울증 슬라이드 (드롭 슬라이드)의 우물에 탑재하고 있습니다. 장소 잘 우울증에 장착 미디어 75 100ul. 여러 샘플은 단일 슬라이드에 장착할 수 있습니다. </li><li> 번데기의 경우는 설치하기 전에 샘플에서 제거되어야합니다. anteriorly 내부 pupal 멤브레인 파악하지 않도록하는 개인 번데기 케이스를 파악. </li><li> 포셉의 두 번째 쌍의로 부드럽게 머리에 의해 내부 pupal 멤브레인을 파악하고 pupal 케이스에서 제거합니다. </li><li> 즉시 잘 우울증에 샘플을 전송 및 추가 샘플 처리를 계속합니다. </li><li> 우울증에 잘 측면 표면이 위로 향하게와 샘플 균일 프로브 또는 포셉 위치를 사용합니다. 가끔 공기 방울은 프로브와 함께 제거할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 공기 방울을 소개 않도록주의하면서 시료로 coverslip을 낮출 </li></ol> 4. 대표 결과 : 샘플이 프로토콜은 성인 복부의 매출 형태를 유지를 사용하여 준비 하였다. 이미지 스택은 복부 토폴로지를 조사하기 위해 적용될 수 2 차원 이미지를 3 - D 렌더링을 생성할 것으로 예상됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3139/3139fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. Drosophila pupae의 세그먼트 유전자 제품 날지 못하는 단백질과 Engrailed 표현 (EN - gal4 : uas - GFP)은. : 및 안티 GFP 마우스 방지 WG (아이오와 하이 브리 도마 은행 4D4)와 번데기 형성 후 26시간 (APF)에 시각되었습니다. 10X 배율은 앞쪽에 남아 있으며, 지느러미가있다. Nucleii는 DAPI로 counterstained되었습니다. 약 50 이미지 (슬라이스 사이 ΔZ는 2.5μm이다)의 스택은 예상했다.

<ol>
	<li>Kopp, A., Duncan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anteroposterior+patterning+in+adult+abdominal+segments+of+Drosophila.">Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila.</a> Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).</li><li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis.">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li><li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangements,+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila.">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li><li>Matsuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+Morphology+and+evolution+of+the+insect+abdomen.">in Morphology and evolution of the insect abdomen.</a> , (1976).</li><li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+of+the+Gonads+in+Drosophila+Melanogaster.">The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 16, 212-224 (1931).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 비디오에 제시된 기술은 발달 시간 포인트의 다양한 Drosophila pupae를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 32시간 24 시간의 기간 동안 APF 처리 Pupae는 APF 상피에서 세포의 손실을 가장 쉽습니다. 확장 부화 단계 동안 세제의 사용 (예 : 트리톤 X - 100과 십대 초반 - 2​​0 등) 셀 손실의 가능성을 증가하기 때문에 권장하지 않습니다. 오히려, deoxycholic 산성은 초기 고정 단계에서 세제로 사용됩니다. 모든 후속 단계는 세제없이 1X PBS에서 수행됩니다. 또한, 확장 부화 단계 중에 샘플을 출렁 이는 것은 셀 손실을 증가하고 피해야한다. 샘플은 공촛점 현미경 기술을 이용하여 몇 군데하실 수 있습니다. 그러나, Drosophila pupae과 같이 설명 처리도 공촛점 기술에 비해 이미지 품질을 항복 구조 조명 현미경 시스템을 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다.

<ul><li> 해부의 stereomicroscope </li><li> 외과 포셉 </li><li> 11 번 블레이드로 외과 메스 </li><li> 아홉 잘 유리 우울증 요리 (코닝 제품 # 7220-85) </li><li> culturing의 pupae에 대한 습기 챔버 </li><li> 1X 인산은 버퍼링 식염수 (PBS) </li><li> # 11 외과 메스 </li><li> 양면 테이프 </li><li> 고정 버퍼 : 1X PBS, 4 % paraformaldehyde, 0.2 % deoxycholic 산성 (permeabilization에 대한) </li><li> p100 또는 p200 pipettor </li><li> 우울증 잘 현미경 슬라이드 (0.8 ㎜) </li></ul>

drosophila pupal abdomen immunohistochemistry

Drosophila pupal의 복부는 상피 morphogenesis와 1-3 성적으로 동종 이형의 morphologies의 개발 연구를 위해 설립된 모델 시스템입니다. (25 ° C) 약 96시간에 걸쳐 pupation, 동안, imaginal 세포의 proliferating 인구는 성인 복부 세그먼트를 생성하는 애벌레 표피를 교체하십시오. 이러한 imaginal 세포는, embryogenesis 동안에 태어난 유충의 각 복부 세그먼트에서 histoblast의 둥지의 측면 쌍으로 존재합니다. histoblast의 둥지의 네 쌍은 성인 지느러미 표피 (앞쪽에 및 사후 지느러미 둥지), 복부 표피 (복부 둥지)와 각 세그먼트 (공기 구멍 둥지) 4과 관련된 spiracles을 일으키다. puparation되면 이러한 diploid 세포는 (큰 polyploid 애벌레 표피 세포 - LECs의 크기로 구별) 증식, 이주 및 LECs 교환의 틀에 박힌 절차를 시작합니다. 다양한 분자와 유전자 도구는 성인 복부의 morphogenesis에 관련된 유전자 경로의 기여를 조사하기 위해 고용 수 있습니다. 최고의 성인 phenotypes는 일반적으로 성인 복부 손톱의 아래의 절개를 분석하고 있습니다. 그러나, 근본적인 분자 과정의 조사 독특한 도전을 제시 pupal 상피의 immunohistochemical 분석을 필요로합니다. Temporally 동적 morphogenesis와 별개의 두 상피 인구 (애벌레와 imaginal)의 상호 작용은 절개와 후속 처리되는 동안 과도한 세포 손실하는 경향이 연약한 조직을 생성합니다. 우리는 해부, 고정, 장착 및 공촛점 또는 표준 형광 현미경에 적합한 일관성있는 고품질의 샘플을 생성 immunohistochemical 연구 Drosophila pupal의 abdominem의 상피의 이미지의 방법을 개발했습니다.

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Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

의 항체 염색법<em&gt; Drosophila</em&gt; pupae 성인 복부 발달 유전학의 유전자 분석을 향상시킬 수 있습니다. 우리는 무대의 해부, 고정 및 항체 염색법을위한 프로토콜을 제시<em&gt; Drosophila</em&gt; pupal 복부.

Drosophila Pupal의 복부 Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

drosophila-pupal-abdomen-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

16.2K 조회수.  University of Alabama. 의 항체 염색법 Drosophila pupae 성인 복부 발달 유전학의 유전자 분석을 향상시킬 수 있습니다. 우리는 무대의 해부, 고정 및 항체 염색법을위한 프로토콜을 제시 Drosophila pupal 복부.

비디오: Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Immunohistochemistry에 대한 슬라이스 준비 씬 Sectioning

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

연구

생물학

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

Here we present, in video format, a protocol for in situ hybridizations in pupal wings of the butterfly Bicyclus anynana using riboprobes.  In situ hybridizations, a mainstay of developmental biology, are useful to study the spatial and temporal patterns of gene expression in developing tissues at the level of transcription. If antibodies that target the protein products of gene transcription have not yet been developed, and/or there are multiple gene copies of a particular protein in the genome that cannot be differentiated using available antibodies, in situs can be used instead. While an in situ technique for larval wing discs has been available to the butterfly community for several years, the current protocol has been optimized for the larger and more fragile pupal wings.

In order to examine gene expression in the pupal wing tissue of Bicyclus anynana, we present an optimized protocol for in situ hybridizations using riboprobes. We also provide guidelines for the further optimization of this protocol for use in pupal wings of other Lepidopteran species.

Riboprobes를 사용하여 나비 Pupal 날개에 대한해라 프로토콜

Here we present, in video format, a protocol for in situ hybridizations in pupal wings of the butterfly Bicyclus anynana using riboprobes.  In situ ...

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

Immunohistochemistry : 벡터 연구소에서 Vectastain ABC 키트를 사용하여 파라핀 섹션

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

형광 항체를 사용하여 마우스 표피의 파라핀 섹션에 Immunohistochemistry

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila 애벌레 NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

의 번데기 케이스를 통해서 영상<em&gt; 초파리</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

해부, 이미징 및 약물 학적 치료 : 초파리의 번데기 고환 및 단일 남성 생식 줄 낭종의 생체 내 문화

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

해부와의 설치<em&gt; 초파리</em&gt; 번데기 아이 디스크

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.