우리는 친절 바사 및 트래픽 잼 항체를 공급 루스 리먼과 Dorthea Godt에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 NICHD의 후원하에 개발하고 아이오와의 대학에 의해 관리 제공된 주식과 발달 연구 하이 브리 도마 은행을 유지하기위한 인디애나 대학 블루밍턴 주식 센터에 감사드립니다. 우리는 그들의 조언과 지원을 Wawersik 실험실의 모든 구성원 감사합니다. 이 작품은 먼로 학자 프로그램 그랜트와 NSF (AF 및 LB에) (MW로) IOS0823151을 부여에 의해 투자되었다.

컬렉션 케이지의 1 준비 <ol><li> CO 2 젊은, 비옥 한 파리를 마취. 케이지에 마취 파리를 전송합니다. 최적의 수율을 얻을 수 사에 나이 2~7일에 이르기까지 100-120 성인 파리를 사용하려면 다음과 남성에 대한 여성의 한 비율입니다. 파리에게 적절한 순응 기간을 허용 ~ 24 시간 고정을 위해 샘플을 획득하기 전에. 48 시간 순응 기간 - 케이지가 처녀 여성으로 설정 한 경우 남성에 사용 36를 결합. </li><li> 케이지의 개방 단부에서 케이지의 구멍에 중심에 효모 페이스트의 한푼 크기의 방울 미리 준비된 사과 주스 한천 플레이트를 배치합니다. 그런 다음, 테이프로 고정합니다. 사과 주스 한천 플레이트와 파라 필름와 케이지의 접합부를 밀봉. </li><li> 염기로서 사과 쥬스 한천 플레이트와 보조 용기에 케이스를 놓고 실험에 의해 결정된 바와 같이 파리 적절한 기간에 대해 정의 된 온도에서 재현 할 수있다. 참고 : 시료 채취 시간 위스콘신다를 것이다. 후기 배아 / 초기 L1 유충 수집 할 때 예를 들어, (17-24 시간)를, 파리는 25 ° C에서 17 시간 동안 사전 샘플의 노화에 25 ℃에서 7 시간 동안 사과 주스 한천 접시에 알을 낳기 위해 수 있습니다. 마찬가지로, 중반 후반 첫번째 령 애벌레의 컬렉션 (36-48 시간) 파리 25 ° C에서 36 시간 동안 사전 샘플의 노화에 25 ° C에서 12 시간 동안 알을 낳기 위해 수 있습니다. </li><li> 기간이 완료되면 파리 마취없이 떨어져 사과 주스 한천 플레이트에서 드롭 있도록 테이블에 새장을 누릅니다. 신속 효모 페이스트의 방울을 함유 한 신선한 플레이트로 사용을 대체. 테이프와 파라 필름으로 신선한 판을 고정베이스로 사과 주스 한천 플레이트와 케이지를 저장합니다. </li><li> 조심스럽게 금속 주걱 사용 된 플레이트에서 효모 강하를 제거합니다. 실험적으로 필요한 경우 장소 사용되는 사과 주스 접시에 뚜껑 나이에 배아를 마련 할 수 있습니다. 참고 : 샘플을 노화 동안 판은 25 ° C에서 저장 될 수있다 높은 온도가 experimenta가 아니라면에서야이 필요합니다. 상기 기술 한 바와 같다 수집을위한 배아를 나이하는 방법의 예 (단계 1.3 참고 사항을 참조하십시오). 노화를 샘플링하기 전에 효모 페이스트의 제거는 효모에 크롤 링 아래 한천을 깨는에서 유충을 방지하기 위해 수행된다. 나머지 사과 주스 한천과 효모 붙여 넣기 잔류 애벌레 성장을위한 영양분을 제공합니다. 효모 페이스트에 직접 배치 배아 효모 페이스트 제거를 통해 손실되는 반면,이 손실은 염색 효율을 줄일 수있는 샘플 효모 및 한천 잔류하는 것이 바람직하다. 하나는 효모 페이스트를 제거하지 않도록 선택한 경우, 효모는 페인트 브러시와 혼합, 인산염 버퍼 트리톤 X-100 (PBTx)와 액화 한 후 이전에 고정에 셀 스트레이너를 사용하여 샘​​플에서 제거 할 수 있습니다. </li></ol> 2 고정 <ol><li> 사과 주스 한천 플레이트에 배치 배아가 원하는 시점에 세되면, 조심스럽게 일에서 샘플을 제거 인산 버퍼 트리톤 X-100 (PBTx) 용액에 적신 작은 붓을 사용하여전자 판. 참고 : 이전 애벌레 이동하고 뚜껑의 안쪽에 크롤링 할 수 있습니다. 이 샘플은 페인트 브러시와 제거에 의해 유사하게 수집 할 수있다. </li><li> 셀 스트레이너의 내부를 향하는 능선에 대한 샘플을 함유 한 페인트 브러시를 닦아주십시오. 그런 다음, 스트레이너의 벽과 PBTx 솔루션을 포함하는 물총 병 붓을 씻어. PBTx 솔루션을 캡처 여과기 아래에 배양 접시 덮개를 놓습니다. </li><li> 모든 샘플은 여과기로 전송 된 후, 메쉬 오프 샘플 인상 여과기로 충분히 PBTx을 붓는다. 그리고, 스트레이너를 올려 액체 폐기물 컨테이너로 페트리 접시의 내용을 붓는다. </li><li> 단계를 반복 2.3 세 번 효모를 제거하고 샘플과 함께 전송 된 수 있습니다 폐기물을 비행. </li><li> 메쉬를 유충을 제기하기에 충분한 50 % 표백제 여과기에 (의 NaOCl) / 물 (DDH 2 O) 용액을 붓는다. 유충은 5 분 동안 용액에 앉아 할 수 있습니다. 그런 다음, 스트레이너를 들어 올려 t을 부어그는 액체 폐기물 용기에서 배양 접시의 내용을 표시합니다. 참고 : - 융모막 막을 제거하기 위해 22 시간 표백제는 0 세 배아 샘플이 필요합니다. 이전 샘플 표백제 애플리케이션은 생략 할 수 있지만, 그것의 포함은 유해하지 않다. 누락이 필요한 경우, PBTx이 단계에서 표백제를 대체. 희석 표백제 용액 준비 24 시간 이내에 사용하시기 바랍니다. </li><li> 메시 오프 샘플을 높이기 위해 스트레이너에 충분한 PBTx을 부어 PBTx와 여과기에 샘플을 씻으십시오. 샘플 3 분 동안 용액에 앉아 할 수 있습니다. 그리고, 스트레이너를 올려 액체 폐기물 컨테이너로 페트리 접시의 내용을 붓는다. </li><li> 반복 단계 2.6 다섯 번. </li><li> 셀 스트레이너 건조의 바닥 DAB 후 붓을 사용 PEMS 용액 1.75 ㎖에 함유하는 섬광 바이알로 샘플을 전송. </li><li> 환기 흄 후드에서 작업, 37 %의 포름 알데히드 250 μL와 섬광 유리 병에 시약 등급 헵탄의 8 ML을 추가합니다. <br/&gt; 참고 : 포름 알데히드 및​​ 헵탄이 위험합니다. 3.3 - 안전을 위해 통풍이 잘되는 흄 후드 작동 및 단계 2.9에 적합한 장갑을 착용하는 것을 계속한다. </li><li> 유리 병은 200 rpm으로 20 분 동안 비슷한 적당한 속도로 흔들 수 있습니다. </li><li> 이전의 성상을 제거하지 않고 섬광 유리 병에 메탄올 10 mL를 넣고 유리 병은 1 분 동안 500 rpm으로 흔들어 할 수 있습니다. 참고 : 메탄올은 위험합니다. 환기 흄 후드에서 작업하고 적절한 장갑을 착용 계속합니다. </li><li> 후드에서 액체 폐기물 용기 위에 셀 스트레이너에 내용을 부어 바로 통에서 유리 병을 제거하고. 바이알에 여분의 메탄올을 첨가하고 모든 샘플이 제거되었는지 확인하기 위해 필요한 셀 스트레이너를 통해 실행. 참고 : 셀 스트레이너 천천히 방전 될 수 있습니다. 이를 해결하기 위해,보다 빠르게 여과기를 통해 용액을 그리기 위해 셀 스트레이너의 바닥 실험실 조직을 터치. 메탄올, 포름 알데히드, 헵탄이 있어야한다제도적 지침에 따라 적절한 폐기 될 때까지 적절한 폐기 용기에 보관. </li><li> 실험실 조직을 사용하여 셀 스트레이너의 마른 바닥, 메탄올 0.5 ㎖에 들어있는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 스트레이너에서 캡처 샘플을 전송하기 위해 붓을 사용합니다. 참고 : 여러 섬광 유리 병을 사용하는 경우 단계를 완료 2.12 한 번에 2.13 한 병 셀 스트레이너에 건조에서 샘플을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 샘플이 microcentrifuge 관에 추가되면, 피펫과 메탄올을 제거합니다. 확인 샘플 튜브의 바닥에 침전되었다. </li><li> 튜브의 메탄올 0.5 ㎖에 첨가하여 microcentrifuge 관에 샘플을 헹군다. 다음 정착 피펫 메탄올을 제거하는 샘플 기다립니다. </li><li> 단계를 반복하여 15 세 번. </li><li> 에서 관에 메탄올 0.5 ML을 추가 한 다음 저장 -20 나중에 사용하기 위해 C 냉동고 °. </li></ol> 3 재수 및 면역 염색을위한 시료의 준비 <ol><li> 튜브 샘플을 떠나, 피펫 microcentrifuge 관에서 메탄올을 제거합니다. 적절한 폐기 때까지 적절한 폐기 용기에 보관 메탄올 폐기물. , 초음파 처리 효율을 향상시키기 위해 시료의 더 이상 3mm가 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브의 바닥에 침전 없음 사용 참고. 과잉 시료 위 재수 화 공정을 시작하기 전에 피펫 분리 튜브로 이송 될 수있다. 깨끗한 면도날과 피펫 팁을 절삭하는 피펫 팁의 막힘을 방지하기 위해 사용될 수있다. </li><li> 3 분 동안 튜브와 바위에 50 % 메탄올 / 인산 버퍼 트윈 (PBTw) 솔루션의 1.0 ML을 추가합니다. </li><li> 적절한 폐기물 용기에 메탄올 용액을 제거하고 두 번 PBTw의 1.0 μl를 씻어. 각 린스 후, 샘플 피펫 PBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다. </li><li> 소 혈청 알부민 / 인산염 완충 트윈 (BBTw)의 1.0 ML을 추가 바이알과 바위에 섞는다. 로커에 3 분 후, SAMP를 허용르 정착과 피펫 BBTw를 제거합니다. </li><li> 단계를 반복 마지막 세척 후 샘플을 잃지 않고 가능한 한 많은 BBTw을 제거 돌보는 3.4 두 번. </li><li> 튜브에 BBTw의 0.5 mL를 넣고 얼음에 튜브를 배치합니다. </li></ol> 샘플의 4 초음파 처리 <ol><li> 10 % 최대 진폭에 초음파기를 2 초 일정 초음파의 실행 시간을 지정합니다. 참고 :이 설정은 재료 및 장비 표에 표시된 초음파기에 고유 한 다른 sonicators에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. </li><li> 이전 시료의 초음파로, 프로브를 청소하는 탈 이온수 및 실행 초음파기 가득 50 ML 원뿔 튜브에 프로브 팁을 배치하여 초음파기 프로브를 청소합니다. 실행 한 후 실험실 조직과 드라이 초음파기 프로브. </li><li> 이 시료 위에 약 3-4mm 배치되도록 샘플을 함유하는 마이크로 원심 튜브에 프로브를 담그고 초음파 처리를 시작한다. </li><li> m을 제거icrocentrifuge 튜브 초음파로부터 열을 소산 샘플 microcentrifuge 관의 하단에 정착 할 수 있도록 적어도 30 초 동안 얼음에 배치하고. </li><li> 반복 4.3 및 처리되는 샘플의 연령에 따라 필요에 따라 4.4 단계를 반복합니다. 참고 : 최적의 초음파 샘플 볼륨의 경우, 초음파를 필요로하지 않는 미만 17 시간 배아, 그러나 그 시간 17 사이의 24 (/ 17 단계 초기 L1)이이 sonications이 필요합니다. 애벌레 사이 24-36 (초 / 중반-L1), 36-48 (중 /-L1 후반) 48-60 (초 / 중반 L2), 60-72 (중 / 후반 L2), 72-84 ( )-L3 초, 84-96 (초 / 중반 L3), 96-108 (중 / 후반 L3) 시간이 필요 5, 9, 11, 13, 각각 15, 18, 22 sonications. 초음파 시간에 더 정교에 대한 설명을 참조하십시오. </li><li> BBTw 두 번 1.0 ㎖로 씻어. 각 린스 후 샘플 피펫 BBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다. </li><li> 유리 병 바위에 BBTw의 1.0 ML을 추가합니다. 로커에 3 분 후, 샘플 정착 피펫 BBTw를 제거 할 수 있습니다. &lt;/ 리&gt; <li> 단계를 반복 4.7 두 번. </li></ol> (5) 면역 염색 <ol><li> microcentrifuge 관에 BBTw에 희석 5 % 정상 혈청을 추가하여 샘플을 차단합니다. 1 시간 동안 락을 한 후 블록을 제거합니다. 참고 : 보조 항체가 생성되는 종에서 정상 혈청을 사용합니다. </li><li> 5 % 정상 혈청 / BBTw 용액에 농도를 적절한 작업하는 차 항체를 희석. </li><li> 4 ° C에서 또는 (약 22 ° C 실온에서 적어도 3 시간 동안 차 항체 솔루션 O 락 샘플 / N. 주 : 항체 배양 시간 및 온도는 다를 수 있습니다. O / RT에서 N 4 ° C에서 배양 또는 3 시간은 일반적으로 충분합니다. 그러나,이 일의 잠복기는 특히 오래된 샘플 또는 낮은 친화력 차 항체를 사용하는과, 염색 품질을 향상시킬 수 있습니다. 긴 인큐베이션은 일반적으로 4 ° C에서 수행됩니다. 이차 항체 (5.10 참조)을 사용하면 유사한 고려가 이루어져야합니다. </li><li> 샘플에 정착 할 수 있도록 허용미세 원심 분리 튜브의 바닥. 피펫 차 항체를 그립니다. 원하는 경우 재사용에 대한 항체를 저장합니다. </li><li> 두 번 BBTw의 1.0 ㎖로 씻어. 각 린스 후 샘플 피펫 BBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다. </li><li> 유리 병 바위에 BBTw의 1.0 ML을 추가합니다. 로커에 3 분 후, 샘플 정착 피펫 BBTw를 제거 할 수 있습니다. </li><li> 반복 단계 5.6 다섯 번. </li><li> microcentrifuge 관에 5 % 정상 혈청 / BBTw 용액을 첨가함으로써 차단 샘플. 1 시간 30 분 동안 흔들 후 블록을 제거합니다. 이러한 추가적인 차단 단계가 필요하지 않고, 특정 항체 염색 품질을 향상시킬 수 있습니다. </li><li> 5 % 정상 혈청 / BBTw 용액에 농도를 작동하는 적절한 보조 항체를 희석. </li><li> 빛 노출로 인해 변색 줄이기 위해 알루미늄 호일에 microcentrifuge 관을 감 쌉니다. 4 ° C에서 12 시간 48 2 차 항체 용액 또는 RT (약 22 ° C에서 적어도 3 시간 동안 바위 샘플. </li><li> 샘플 미세 원심 분리 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 피펫 차 항체를 그립니다. </li><li> 두 번 PBTw의 1.0 ㎖로 씻어. 각 린스 후 샘플 피펫 PBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다. </li><li> 유리 병 바위에 PBTw의 1.0 ML을 추가합니다. 로커에서 5 분 후, 샘플 정착 피펫 PBTw를 제거 할 수 있습니다. </li><li> 단계를 반복 5.13 세 번. </li><li> 옵션 : 1,000 PBTw에 : DAPI 1 희석 추가합니다. 록 샘플은 3 분 동안 알루미늄 호일에 싸서; 다음 피펫 DAPI 솔루션을 제거합니다. 샘플 피펫 PBTw를 제거하기 전에 정착 할 수 있도록 PBTw의 1.0 mL를 다섯 번 씻어. </li><li> -20 ° C에서 microcentrifuge 관 및 저장소에 1,4 - 디아 자비 시클로 [2.2.2] 옥탄 (DABCO) 용액 100 ㎕ - 80를 추가합니다. 주의 : 다른 글리세롤 계 안티 - 페이드 에이전트가 대신 할 수있다. </li></ol> (6) 분석 <ol><li> DABCO / P-페닐의 10 μL - 슬라이드에 샘플을 설치하기 전에 여분의 5를 추가ylenediamine (PPD) microcentrifuge 관에 antifade 솔루션입니다. 참고 : 샘플 절개없이 슬라이드에 추가 할 수 있습니다. 슬라이드에 추가 샘플 볼륨을 커버 슬립의 크기에 따라 달라집니다. 슬라이드 상에 샘플을 피펫 때 피펫 팁은 시료 전단 않도록 면도날을 이용하여 차단 될 수있다. 그것은 쉬운 분석을위한 행 샘플을 정렬하는 것이 유용하다. 추가 antifade 제로 PPD의 첨가는 필요하지 않을 수 있지만, 샘플 장기 photobleaching에 저장되어있는 경우를 방지 할 수있다. </li><li> 부드럽게 샘플을 통해 유리 커버 슬립을 배치합니다. 그런 장소에 보안 커버 슬립은 매니큐어를 사용. </li><li> 보기는 형광 현미경을 이용하여 시료를 탑재. </li></ol>

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	<li>Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+controlling+germ+cell+migration+and+embryonic+gonad+formation+in+Drosophila.">Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila.</a> Development. 125, 667-678 (1998).</li><li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , 141-157 (2000).</li><li>Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+E-cadherin+is+essential+for+proper+germ+cell-soma+interaction+during+gonad+morphogenesis.">Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis.</a> Development. 130, 4417-4426 (2003).</li><li>Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Laboratory Handbook. , 122-205 (2005).</li><li>Blair, S. S., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , 159-173 (2000).</li><li>Patel, N., Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology.">Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology.</a> Methods in Cell Biology. , 445-487 (1994).</li><li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+staining+of+Drosophila+larval+ovaries.">Dissection and staining of Drosophila larval ovaries.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Le Bras, S., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+male+germline+stem+cell+niche+in+Drosophila.">Development of the male germline stem cell niche in Drosophila.</a> Dev Biol. 294, 92-103 (2006).</li><li>Sheng, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jak-STAT+regulation+of+male+germline+stem+cell+establishment+during+Drosophila+embryogenesis.">Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis.</a> Dev Biol. 334, 335-344 (2009).</li><li>Sinden, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jak-STAT+regulation+of+cyst+stem+cell+development+in+the+Drosophila+testis.">Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis.</a> Dev Biol. 372, 5-16 (2012).</li><li>DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonautonomous+sex+determination+controls+sexually+dimorphic+development+of+the+Drosophila+gonad.">Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad.</a> Dev Cell. 14, 275-286 (2008).</li><li>Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=raw+Functions+through+JNK+signaling+and+cadherin-based+adhesion+to+regulate+Drosophila+gonad+morphogenesis.">raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis.</a> Dev Biol. 367, 114-125 (2012).</li><li>Fuller, M., Bat, M., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+niche:+Lessons+from+Drosophila+testis.">The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis.</a> Development. 138, 2861-2869 (2011).</li><li>Williamson, A., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+development+in+Drosophila.">Germ cell development in Drosophila.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).</li><li>Jemc, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+gonadal+cells:+the+supporting+cast+for+the+germline.">Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline.</a> Genesis. 49, 753-775 (2011).</li><li>Spradling, A. C., Bat, M., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).</li><li>Eliazer, S., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+niche:+studies+from+the+Drosophila+ovary.">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2, 45 (2011).</li><li>Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ovary+morphogenesis:+Analysis+of+terminal+filament+formation+and+identification+of+a+gene+required+for+this+process.">Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process.</a> Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).</li><li>Godt, D., Laski, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cell+rearrangement+and+cell+recruitment+in+Drosophila+ovary+morphogenesis+and+the+requirement+of+bric+a+brac.">Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac.</a> Development. 121, 173-187 (1995).</li><li>Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+regulation+of+niche+and+stem+cell+precursors+by+hormonal+signaling.">Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling.</a> PLoS Biol. 9, e1001202 (2011).</li><li>Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egfr+signaling+controls+the+size+of+the+stem+cell+precursor+pool+in+the+Drosophila+ovary.">Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary.</a> Mech Dev. 130, 241-253 (2013).</li><li>Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+anchored+by+adherens+junctions+in+the+Drosophila+ovary+niches.">Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches.</a> Science. 296, 1855-1857 (2002).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila.+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139, 4297-4310 (2012).</li><li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> BioEssays. 26, 739-751 (2004).</li><li>Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+gene+negatively+regulates+neural+progenitor+cell+proliferation+in+the+larval+central+brain+of+Drosophila.">The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila.</a> Development. 133, 2639-2648 (2006).</li><li>Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brat+is+a+Miranda+cargo+protein+that+promotes+neuronal+differentiation+and+inhibits+neuroblast+self-renewal.">Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal.</a> Dev Cell. 10, 441-449 (2006).</li><li>Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+segregation+of+the+tumor+suppressor+brat+regulates+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells.">Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells.</a> Cell. 124, 1241-1253 (2006).</li><li>Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+proliferation+of+the+larval+brain+glia+in+Drosophila.">Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila.</a> Dev Biol. 283, 191-203 (2005).</li><li>Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+identity,+morphology,+apoptosis+and+mitotic+activity+in+a+primary+neural+cell+culture+system+in+Drosophila.">Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila.</a> Neural Dev. 7, 14 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 성공적 따라서 박리를위한 필요성을 제거 반응계에서 초파리 배아와 유충 표적 조직 발현 사이하는 방법을 제공한다. 초기 배아에게 1,2,3 염색을 위해 사전 프로토콜에 따라, 융모막 멤브레인은 50 % 표백제 (NaOCl을)를 사용하여 제거한다. 샘플은 포름 알데히드와 메탄올에 고정되어 있습니다. 애벌레 표피가 떠있는 오래된 샘플을 발생하기 때문에, 전체 샘플은 애벌?...

초파리의 배아 및 유충은 많은 기관과 조직의 발달 과정을 연구 할 수있는 좋은 모델을 제공합니다. 개별 세포의 세포 이미징을 개발하는 복잡한 환경을 확인하기 위하여, 이들 연구에서 종종 필요하다. 조직에서 세포의 면역 염색을 통해 시각화 달성 될 수있다. 프로토콜 17 시간 달걀 누워 (AEL) 1-3 후 배아 초파리 조직 &lt;존재하는 면역 염색 잘 설명했다. 효과적인 항체의 투과를 방지하는 배아의 단부를 향해 그러나 보호 표피 형태. 따라서, 이러한 면역 염색 프로토콜은 늦게 단계의 배아에서 조직의 분석과 애벌레 개발 (1 차 령 (L1), 2 차 령 (L2), 및 3 차 령 (L3))의 후속 단계에서 비효율적이다. 이 비 효율성이 확장 개발 기간 4 중 발생하는 동적 프로세스에 대한 우리의 이해에 장벽을 부과한다. 담배 마는UE 절제술이 장벽 5-7을 우회 할 수있는 널리 사용되는 기술이다. 그러나, 해부 비효율적 증명할 수 있습니다. 추출은 위치 또는 배아와 애벌레 조직을 분리하는 어려움에 의해 방해를 할 수있다. 또한, 표적 조직의 물리적 제거를 파열 또는 그 전체를 추출하기 위해 실패에 의해 손상 될 수 있습니다. 초음파는 분자간 상호 작용을 방해 음파를 이용하는 방법입니다. 이는 신경 세포 유형 6을 개발하기 위해 발현 사이 초파리 유충 표피의 무결성을 파괴하는데 사용되어왔다. 이 프로토콜은 늦게 단계 배아 직경 8 ~ 10 년으로 50μm 작게 할 수있다 애벌레 생식선을 발현 사이하도록하고있다. 이러한 연구를 통해, 수컷 생식선 줄기 세포 (GSC) 틈새 형성 과정이 말기에있어서 한 줄기 세포 발달과 DIF 조절 초파리 배아 8-10 및 메커니즘후기 배아 생식선 및 유충의 ferentiation 9-12을 밝혀왔다. 따라서, 초음파로 인해 조직의 크기가 어려울 수 있습니다 조직 절개에 대한 효율적인 대안을 제공합니다. 또한, 전체 유기체의 컨텍스트 내에서 셀을 떠나 시츄 형태로 유지 시츄 초파리 조직의 면역 염색을 가능하게한다. 여기에, 우리는 현장에서 초 / 중반 L3 조직을 통해 늦게 단계 배아의 형광 면역 염색에 대한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 초파리 생식선 및 신경 조직의 분석은이 프로토콜의 효능을 입증하기 위해 대표 결과에 나타낸다. 또한,이 면역 프로토콜은 외부 표피와 기타 다른 초파리 생물 조직뿐만 아니라 조직을 분석하도록 구성 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1: Reagents and Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Triton X-100 (PBTx)</td>
			<td>For 5 L: 500 mL PBS 10X 4.45 L ddH2O 50 mL Triton 10%</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x (PBS 10X)</td>
			<td>For 1 L in dH2O: 80 g NaCl 2 g KCl 14.4g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4</td>
			<td>Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton 10%</td>
			<td>For 50 mL: 5 mL of Triton 5 mL of PBS 10X 45 mL of ddH2O</td>
			<td>Rock to mix. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEMS</td>
			<td>0.1 M Pipes (pH 6.9) 2.0 mM MgSO4 1.0 mM EGTA</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>For a 400ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH</td>
			<td>Dissolve Pipes in 300 mL dH2Oand then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 mL with dH2O and autoclave. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>37% formaldehyde by weight in methanol</td>
			<td>Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>n-Heptane</td>
			<td>CAS 142-82-5. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Methanol</td>
			<td>CAS 67-56-1. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Tween (PBTw)</td>
			<td>To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10%</td>
			<td>Filter sterilize after adding all components. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 10%</td>
			<td>For 50 mL: 5 mL Tween 5 mL of PBS 10X 40 mL of ddH2O</td>
			<td>Rock to mix. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin/Phosphate Buffer Tween (BBTw)</td>
			<td>To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10% 1 g Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Add BSA then sterilize using a 0.2 micrometer vacuum filter unit. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>To make 10 mL: Normal Goat Serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories Code: 005-000-121) 10 mL ddH2O</td>
			<td>Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 micrometer syrninge filter. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)</td>
			<td>To make 100 mL: 25 mL ddH2O 1 mL Tris HCl (1M, pH 7.5) 2.5 g of DABCO solid (CAS: 281-57-9) 3.5 mL 6N HCl 250 uL 10N NaOH 70 mL glycerol</td>
			<td>In 250 mL beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO + p-phenylenediamine (PPD) Solution</td>
			<td>1.765 mL NaHCO3 0.353 Na2CO3 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3)</td>
			<td>Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 uL of PPD solution to 500 uL of DABCO. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apple juice plates</td>
			<td>To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0) 45 g granulated sugar (store bought) 500 mL Apple juice (store bought) 15 mL Tegosept 10% 1.5 mL ddH2O</td>
			<td>Add agar to ddH2O in 4L flask then autoclave for 30 minuntes. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10mL volumes into 35 mm petri dishes and let stand at room temperature to solidfy. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept 10%</td>
			<td>To make 100mL: 10g Tegosept 100 mL Ethanol</td>
			<td>Store aliquots at -20 degrees C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast paste</td>
			<td>~50 g Dry Active Yeast</td>
			<td>Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2: Staining Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>1:1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571 //// Stock at 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-Vasa</td>
			<td>1:250</td>
			<td></td>
			<td>A gift from Ruth Lehmann</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Fasciclin III</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>7G10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-1B1</td>
			<td>1:4</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>1B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guniea pig anti-Traffic Jam</td>
			<td>1:2500</td>
			<td></td>
			<td>A gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Prospero</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>Prospero MR1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-Elav</td>
			<td>1:30</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>Rat-elav 7EBA10 anti-elav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Repo</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>8D12 anti-Repo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit Alexa546</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse Alexa488</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-guniea pig Alexa633</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rat Alexa488</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3: Materials and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Cages</td>
			<td>Hand-made; Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101</td>
			<td>Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model: Branson Digital Sonifier 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Probe</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model #: 102C (CE)</td>
			<td>EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-25-20</td>
			<td>0.2 micrometer cellulose, acetate membrane filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software</td>
			<td>Microscope: Olympus Light source: Lumen Dynamics Camera: Q-Imaging Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.</td>
			<td>Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc Light source: X-Cite 120Q Camera: RETIGA-SRV Imaging Software: Slidebook 5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>450-0020</td>
			<td>0.2 micrometer cellulose nitrate membrane filter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sonication-facilitated immunofluorescence staining of late-stage embryonic and larval drosophila tissues in situ

초파리에서 수행 연구는 배아 및 유충은 세포의 운명 사양 및 기관 형성 등의 발생 과정에 중요한 통찰력을 제공 melanogaster. 면역 염색은 조직 및 기관의 개발 시각화한다. 그러나 배아의 끝 부분에 형성하는 보호 표피 늦게 단계의 배아 및 유충에 항체의 투과를 방지 할 수 있습니다. 면역 염색 전에 절개 정기적 초파리 유충의 조직을 분석하는 데 사용되는 반면 작은 조직 찾아서 분리하기 어려울 수 있기 때문에, 그것은 어떤 분석 비효율적 증명한다. 초음파는 애벌레 초파리 면역 염색 프로토콜의 해부에 대한 대안을 제공합니다. 늦은 단계의 배아 및 유충의 대량의 빠른 동시 처리 가능하며 현장 형태로 유지한다. 포름 알데히드에 고정 후, 샘플을 초음파 처리한다. 샘플은 다음 항원 특정 기본 개미와 면역 염색을 실시ibodies 및 형광 표지 이차 항체는 형광 현미경을 통해 표적 세포 유형 및 특정 단백질을 가시화한다. 초음파 처리의 과정에서, 상기 시료에 초음파 프로브뿐만 아니라, 초음파의 강도와 지속 시간의 적절한 배치가 중요하다. 표준 면역 프로토콜로 부가적인 약간의 수정은 고품질의 얼룩을 위해 필요할 수있다. 잡음비 낮은 신호에 대한 항체, 긴 배양 시간은 통상적으로 필요하다. 이 초음파 - 촉진 프로토콜에 대한 개념의 증거로서, 우리는 발달 단계의 범위에서 세 가지 조직 유형 (고환, 난소 및 신경 조직)의 면역 염색을 보여줍니다.

마지막 단계의 배아와 현장에서 애벌레 조직의 분석 초음파 기반의 면역 염색의 효능을 입증하기 위해, 야생 형 배아 및 유충은 고환, 난소의 면역 및 신경 조직을 위해 처리 하였다. 샘플은 공 초점 현미경을 통해 몇 군데 있었다 대표적인 결과는 (그림 1과 그림 2)를 나타낸다. 결과는 설명 프로토콜은 초파리 개발의 늦은 배아 초기 통해 / 중간 L3 단계에서 형태 적 특징?...

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Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

sonication-facilitated-immunofluorescence-staining-late-stage

Research

JoVE Journal

Biology

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

12.5K 조회수.  College of William & Mary. Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae. 

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Drosophila Melanogaster에서 애벌레 CNS의 해부

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연구

생물학

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila 애벌레 NMJ의 해부

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila 애벌레 NMJ Immunohistochemistry

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Zebrafish 배아 눈 조직의 Microdissection

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

해부 그리고 스테 이닝 Drosophila 애벌레 난소

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

마이크로 RNA<em&gt; 현장에서</em&gt; 포르말린 고정 신장 조직에 대한 하이브리드

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

에서 애벌레 활동의 측정<em&gt; 초파리</em&gt; 활동 모니터

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...