이 작품은 크리스토퍼와 다나 리브 재단, 의학 연구위원회 (Medical Research Council), 유럽 연구위원회 ECMneuro 및 캠브리지 NHMRC 생물 의학 연구 센터에서 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 촬영하는 동안 자신의 기술 지원을 헬린 메렐 반 &#39;t Spijker 및 저스티나 바렛에 깊은 감사의 말씀을드립니다. 우리는 AAV 생산 지원을 위해 박사 엘리자베스 몰 로니 교수 유스트 버헤건 (신경 과학을위한 네덜란드 연구소) 감사의 말씀을 전합니다.

다음의 모든 동물 절차가 영국 동물에 따라 (과학적 절차) 법 1986이 절차에 익숙하지 않은 경우에 실시되었다, 국가 / 지역의 규정을 확인하고 프로토콜을 시작하기 전에 의학적 조언을 구하시기 바랍니다. 1. 동물의 적절한 변형을 선택 참고 : 감각과 발 deafferentation의 손실에서 후근 압박 손상의 결과. 앞발의 deafferentation의 일반적인 부작용은 오버 정리, 자기 절단 및 발 autotomy를 포함 할 수 있습니다. <ol><li> 절차는 동물을 얻습니다. 주 : 래트를 들면, 리스터-두건의 Wistar로서 더 활성 균주, 예컨대 루이스와 스프 라그 - 돌리로 더 다루기 균주에 비해 deafferentation 후 발 autotomy의 높은 발병률을 갖는다. 가능하면 가장 다루기 변형, 루이스는 항상 먼저 고려되어야한다. 특히 활성 균주는 유전 적 m에 실험에 필요하다면odification 또는 특정 행동 평가 요구 사항, 수의학 치료가 예상 부작용을 해결하기 위해 자리에 있어야합니다. </li></ol> 2. 사출에 대한 바이러스 준비 주의 : 생물 및 실험실 안전 규정에 따라 모든 바이러스를 처리합니다. <ol><li> 희석 또는 / ㎖ 개별 바이러스 패키징 프로토콜 9 다음 2 × 1012 게놈 카피 (GC)의 역가 바이러스를 농축시킨다. 주 : 여기에서, 바이러스 5 % 수 크로스와 둘 베코 인산염 완충 식염수 (D-PBS)로 희석 하였다. 역가, 바이러스, 프로모터의 종류에 따라 최적화 할 수있는 크기를 구축하고, 세포 유형을 대상으로 할 수있다. </li><li> 옵션 : 나중에 사출 쉽게 시각화를위한 바이러스 솔루션 1 %를 착색 염료 (예를 들어, 빠른 그린)를 추가합니다. 아주 부드럽게 솔루션을 섞는다. </li><li> (4 시간 이내) 즉시 사용 얼음 솔루션을 유지하거나 장기를위한 -80 ° C의 냉동고에장기 저장. </li></ol> 3. 동물의 수술 준비를 수행 참고 : 수술의 극단적 인 침입으로 인해, 무균 기술을 항상 사용되어야한다. <ol><li> 준비하고 수술을 시작하기 전에 모든 수술 도구와 척추 고정대를 소독. 예를 들어, 134 ℃에서 오토 클레이브에서 멸균 도구. 각 동물에 대한 소독 도구의 새로운 세트를 사용합니다. </li><li> 동물을 마취. 금단 반사 나 눈꺼풀 반사위한 각막을 터치하여 테스트 발을 집어 적절한 마취를 확인한다. <ol><li> 예를 흡입 이소 플루 란 마취를 이용하여 성숙한 래트를 들어, 2.0 L의 4 % 이소 플루 란을 사용 / 유도 산소 분. 과대 또는 과소 투여를 피하기 위해 동물의 호흡 패턴에 따라 다양한 농도의 이소 플루 란, 1.5 L / 분의 산소의 3 % 이소 플루 란 - 수술 내내 유지를 들어, 2를 사용한다. </li></ol></li><li> 에, 동물이 처음 마취 CE 동물의 수술 전 체중을 기록한다. </li><li> 자궁 경부 DRG 주입의 경우, 견갑골에 원위부에 귀 사이에서 목에 털을 면도. 방부제 제품과 면도 영역 소독. </li><li> 적절한 진통제의 투여 (예를 들어, 5 ㎎ / ㎏ 카프로 펜) 항생제 (예를 들어, 5 ㎎ / ㎏ enrofloxacin)과 함께, 동물의 옆구리에 피하 식염수 2 mL를 주입한다. </li><li> 절차를 수행하는 동안 각막 건조를 방지하기 위해 두 눈에 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 동물의 아래에 배치 된 37 ℃ 가열 패드와 척추 고정대 수술을 진행. </li></ol> 4. DRG를 주입하고 도설 루트 압박 손상을 수행 참고 :이 매우 섬세한 수술이다. 동물의 수술을 살기를 진행하기 전에 해부학에 익숙해 처음 몇 죽은 동물을 연습하는 것이 좋습니다. <ol><li> 엘ocate 피부를 통해 저명한 C2 및 T2 극돌기. 10 호 메스 블레이드 (피부가 열리면, 백색 섬유질 조직 정중선 근육의 제 1 층에 보여야과 C2 및 T2 가시 돌기 사이의 피부 절개를, 근육의 제 1 층을 갖는 &quot; ) 질감 &quot;젤리처럼. </li><li> 메스 블레이드를 사용하여 흰색 중간 선을 따라 근육의 첫 번째 레이어에 비슷한 크기의 절개를합니다. 이 근처에있는 하행 대동맥에서 주요 동맥의 가지가있는 한, 저명한 T2 극돌기 넘어하지 마십시오. 참고 : 심한 출혈 이후이 단계에서 어디서든 발생할 수 있습니다. 항상 출혈을 중지하고 항상 명확한 시각화 할 수 있도록 멸균 면봉이나 수술 흡수 스폰지를 사용하여 혈액을 제거합니다. 절차 진행 &quot;맹목적으로&quot;나중에 동물에 예기치 않은 부작용으로 이어지는, 척수, DRG, 또는 지느러미 루트에 원치 않는 손상 될 수 있습니다. </li><li> 후퇴두 견인기, 하나 rostrally 배치 한 꼬리 쪽을 이용하여 근육의 첫번째 층; 근육의 두번째 층은 가로 무늬 모양으로 표시한다. </li><li> (두 길이 근육 얇은 멤브레인 조직 관찰에 의해 접속 될 수있다) 근육의 제 2 층의 정중선을 찾아. 두 종의 근육을 분리 microscissors 쌍을 사용하여 멤브레인을 해부 조직. 이 불필요한 근육 손상 및 출혈을 초래할 수 있으므로, 메스 블레이드 가능하다면 사용을 피. </li><li> 척추를 덮는 얇은 근육의 제 3 층이 노출되도록 적절히 조정 견인기. 가시 돌기 가볍게 근육의 제 3 층 위에 집게 한 쌍의 터치 느낄 수있다. </li><li> microscissors를 사용하여 근육의 제 3 층에 작은 절개를 부드럽게 명확하게 척추를 노출 옆길 방식으로 큐렛이나 메스를 사용하여 뼈에서 근육을 긁어. 필요한 경우, 라미을 마련하기 위해 근육이나 힘줄의 일부를 잘라nectomy 쉽게. </li><li> , C8의 DRGs에 C4를 좌측 헤미 절제술 수행 - - 좌측 C5 노출되도록 신중 박판의 일부를 제거하고 미세 rongeurs 유경의 쌍을 이용하여 척추를 T1. DRG는 척추의 가로 난원 근처에 위치한다. 참고 : C3 - C7 척추는 눈에 띄는 극돌기이 없습니다. DRG C5는 C4 및 C5 척추골 사이에 위치되는 C8 DRG는 C7 및 척추 사이 T1 동안, C6 DRG는 등등 C5 및 C6 척추 사이이며. 더 C8 척추는 C8의 DRG의 존재와 C8 척수 세그먼트에도 불구하고,이 없다. </li><li> DRG 충분한 사출 노출되면, 정위 주사기 홀더 상 주문품, 33 게이지 바늘이 장착 무딘 바이러스 채워진 마이크로 리터 주사기를 배치하여 주사기를 준비한다. 주입 전에 주사 바늘의 삽입을 돕기 위해 타겟 DRG 각 표면에 작은 구멍을 만들어 30 게이지 바늘을 사용하여 경사. </li><li> 33 g을 넣고정위 좌표를 조정하기 위해 부드럽게 손잡이를 돌려 DRG의 중심으로 AUGE 바늘. 이 유체가 DRG의 복부 측면에서 누출 될 수 있습니다로, 바늘을 통해 삽입하지 마십시오. 발생 즉시 바늘의 위치를 ​​조정 누설해야한다. 참고 : 숫자 정위 좌표가 사용되지 않습니다; 그러나, 주사 바늘을 유지하기 위해 프레임을 사용하는 것이 도움이된다. </li><li> 주입 주사기 펌프를 이용하여 0.2 μL / 분으로 각각 DRG에 바이러스 1 μL를 주입한다. 바늘을 철회하기 전에 추가로 3 분 동안 기다립니다. 바이러스 솔루션은 색깔의 염료를 포함하는 경우 주입하는 동안, DRG 천천히 색상을 변경합니다. </li><li> 동시 C5 수행하려면 - C8 등의 루트 호감 부상을, 각각의 루트 (10)의 3 회 호감 각각 사용하여 완전히 집게의 끝 반대 끝이 뾰족한 집게 (본 마이크로), 한 쌍의 조직에서 흰색 선은 호감 사이트에서 나타납니다. forc으로 요구되는 것보다 더 깊게하지 마십시오이 같은 EPS는 복부 루트가 손상 될 수 있습니다. </li><li> 주입 및 / 또는 분쇄 후, 어떤 출혈이나 동물을 닫기 전에 절개 사이트에서 왼쪽 뼈 조각의 작은 조각이 없는지 확인하십시오. 선호하는 경우, 노출 된 척수 및 DRG의 상단에 수술 흡수 스폰지의 작은 조각을 놓습니다. </li><li> 근육의 세 번째 레이어는 봉합하지 않고 척추에 자연적으로 다시 철회 할 수 있습니다. 느슨하게 번째 층의 두 길이 근육 6-0 흡수성 봉합사 재료 (≈ 3 중단 봉합) 봉합. 6-0 흡수성 봉합사로 근육의 제 1 층 (5 ≈ 중단 봉합) 봉합. </li><li> 흡수 5-0 봉합사로 피부를 (≈ 10 중단 봉합) 봉합. 주 : 봉합이 너무 타이트하지 있는지 확인하십시오. 피부의 팽창하는 것은 과도한 긴축의 표시이고, 동물에게 불편 함을 줄 수있다. </li><li> 무거운 출혈은 수술 중 발생한 경우, 피하는 주입 1-2지역 규정 하에서 허용 식염수 용액은 동물로부터 유체의 손실을 보충한다. </li><li> 식용 하이 드레이팅 젤을 제공하고 유지 영역으로 다시 동물을 반환하기 전에 적어도 1 시간 동안 정기적으로 모니터링을 수행하는 동물은 마취에서 완전히 회복 할 수 있습니다. </li><li> 감각 축삭 재생을 평가하기 위해 최적의 유전자 발현을 위해 최소 3 주 동안 동물을 유지합니다. </li></ol> 동물의 5. 수행 수술 후 케어 <ol><li> 첫 번째 주 후 수술 중 동물 용 식품 매쉬와 부드러운면 침구를 제공합니다. 필요한 경우, 국가 / 지역의 규정 및 수의학 조언에 따라 복구를 돕기 위해 진통제와 항생제의 추가 용량을 관리 할 수 ​​있습니다. </li><li> 십일 - 7 후 피부에 봉합사를 제거합니다. 참고 : 수술의 일반적인 부작용은 절개 사이트에서 장액 또는 혈종의 형성을 포함 인해으로 인한 가려움증에 피부에 자국을 긁어내부 흡수성 봉합사, 미묘한 감각 또는 운동 결손 및 후근 압박 손상 후 deafferented 발에 자해의 흔적. 실질적으로 예상보다 더 심각 어떤 복지 문제에 대해서는 즉시 수의사의 조언을 구해야한다. </li></ol> 제 축삭 추적하는 선행 성 CTB 분사를 수행 참고 :이 조직 컬렉션에 일주일 전에 추적 콜레라 독소 B 서브 유닛 (CTB) 축삭을 수행하는 것이 좋습니다. <ol><li> 제조업체의 지시에 따라 1 % CTB 솔루션을 준비합니다. </li><li> 옵션 : 나중에 사출 쉽게 시각화를위한 솔루션 1 % 색깔의 염료를 추가합니다. 아주 부드럽게 솔루션을 섞는다. </li><li> 동물을 마취하고 (단계 3.2.1 참조) 표 사지 테이핑하여 좌측 앞발을 안정화. </li><li> 수동 천천히 피하 털이 발바닥의 중심에 1 % CTB 1 μL를 주입하고 네 자리는 마이크로 리터 주사기 장착 (WI)를 사용주문품, 33 게이지 바늘을 짧은 토륨. 참고 : 주입하기 전에, 먼저 주사 바늘의 삽입에 도움 피부에 작은 피상적 인 개방을 만들기 위해 30 게이지 경 바늘을 사용하는 데 도움이됩니다. </li><li> 동물이 유지 영역으로 동물을 반환하기 전에 마취에서 완전히 복구 할 수 있습니다. </li></ol> 7. 수집 티슈 <ol><li> 면역 용 바이러스 주입 DRG 척수를 수집하기 위해 마취제 과다 투여로 transcardially하고 차가운 4 % 파라 포름 알데히드이어서 인산 완충 식염수 동물 관류. 조심스럽게 현미경으로 고정 된 조직을 수집하기 위해 척추에 전체 추궁 절제술을 수행합니다. 분석 4, 5, 6에 필요한 티슈 제조, 절편, 및 가공을 진행. 참고 : S의 존재에 의해 관찰 회수 절개 사이트, 자명하다자동차 조직. </li><li> 대안 적으로, 시험 관내 배양 용 바이러스 주입 DRG를 수집하는 이산화탄소의 농도 상승 등의 승인 방법 인도적으로 동물을 희생. 조심스럽게 가능한 무균 조건을 보장 현미경으로 DRG를 해부. 10 6, 5, 4 원하는대로 조직 배양을 진행. </li></ol>

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James Fawcett is a paid consultant for Acorda Therapeutics and Novartis.

이 문서에서 우리는 성인 쥐의 낮은 자궁 경부 척수의 DRG 주입 및 후근 압박 손상을 수행하는 단계별 가이드를 제시한다. 이것은 매우 침략하고 섬세한 수술이기 때문에, 우리는 강력하게 모든 잠재적 인 사용자가 동물 수술을 살기를 진행하기 전에 충분한 훈련과 연습을받는 것이 좋습니다. 사용자는 척수의 해부학뿐만 아니라 주변의 근육 조직, 척추 뼈 구조, 그리고 혈관에뿐만 아니라 잘 알고...

신경계 손상 후 축삭 재생을 달성하는 것은 어려운 과제 일 것입니다. 중추 신경계 (CNS)의 축삭 재생의 실패를 연구하기 위해 연구진은 신경 손상 모델의 과다를 사용했다. 중추 신경계의 지역이 다른, 축삭 재생을 연구하는 해부학 적절한 모델을 사용하는 것이 중요합니다. 해당 모델을 사용함으로써, 연구진은 &quot;1 대 모든&quot;치료 전략에 반대, 부상의 정도, 관심의 신경 세포 유형에 따라 특정 치료 및 재생을 평가하기위한 원하는 척추 기관을 공식화 할 수 있습니다. 척수 손상에서, 예를 들어, 대부분의 쇠약 증상은 감각과 운동의 손실에서 줄기. 운동의 손실이 하강 모터 경로의 손상에 의해 발생하는 동안 감각의 손실이 상승하는 감각 경로의 손상에 의해 발생합니다. 때문에 이러한 TW 사이의 셀룰러 및 해부학 적 차이O 경로, 많은 대상 축삭 재생 연구는 단지 하나의 성공적인 회복이 환자들에게 엄청난 도움이 될 것이라는 점을 근거로, 하나 개 또는 다른 경로에 초점을 맞 춥니 다. 이 글에서, 우리는 바이러스 성 벡터와 감각 축삭 재생을 연구하는 모델로 성인 쥐의 낮은 자궁 경부 척수의 동시 후근 호감 부상으로 직접 후근 신경절 (DRG) 주입을 사용하는 프로토콜을 제시한다. DRG 감각 뉴런은 CNS에 주변에서, 같은 촉감과 통증 감각 정보를 중계 할 책임이 있습니다. 척수 감각 뉴런의 긴 축삭 돌기 장거리 축삭 재생을 연구하는 좋은 모델이 될. 또한, 설치류 등 최소한의 복지 합병증 지느러미 루트 압박 손상으로 감각 경로의 병변에서 살아남을 수있는, 연구진은 완전히 척수 병변 할 필요없이 CNS 축삭 재생을 공부할 수 있습니다. 사중의 C5 - C8 (자궁 리터레벨 레벨 5-8) 등의 루트 압박 손상은 앞발의 deafferentation 2에 유용한 모델이 될 것으로 나타났다. 또한, 지느러미 루트 압박 손상은이 같은 폐해 흉터 형성과 같은 다른 요인에 의해 복잡하기 때문에 직접 척수 손상보다 축삭 재생을 연구하는 &quot;깨끗한&quot;모델을 제공합니다. 회생 상태 뉴런 재 프로그램 바이러스 유전자 요법의 사용이 점점 더 많은 신경 학적 조건 3 유망한 치료 전략으로 간주되어왔다. 연구 행동 복구 4,5,6 견고한 축삭 재생을 달성 할 수있는 성장 촉진 단백질의 유전자를 나르는 아데노 - 관련 바이러스 (AAV) 벡터의 적용을 도시 하였다. 면역 반응과 같은 뉴런 비 분열 세포를 형질 도입하는 능력을 유도의 AAV의 명백한 낮은 병원성이 만들어그 유전자 치료에 대한 최적의 벡터. 또한, AAV 재조합 형태는 치료에 사용된다. 이 형태에서는, 숙주 게놈 내로는 7 바이러스 게놈 통합 예컨대 렌티 바이러스와 같은 다른 바이러스 벡터에 비해 삽입 성 돌연변이 유발의 위험을 줄일 수없는 것이다. 이것은 AAV 유전자 치료 응용 프로그램을위한 안전한 선택을합니다. DRG 감각 뉴런의 세포 기관을 포함, 연구 및 / 또는 감각 축삭의 재생을 촉진하는 유전자 치료에 대한 바이러스의 관리를위한 가장 적절한 해부학 적 대상입니다. 다른 AAV 혈청 형 및 렌티 바이러스를 비교 한 연구에서는 AAV 혈청 형 5의 (AAV5)는 DRG (8)에 직접 주입 할 때 적어도 12 주 시간 코스 위에 DRG 신경 세포를 형질 도입에서 가장 효율적인 것으로 나타났다. 또한, AAV는 대경 신경 미세 섬유 200 kDa의 모든 아형 DRG 신경 세포를 형질 도입, 40 % 이상 전달 효율을 얻을 수있다(NF200) 양성 뉴런 소경 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드 (CGRP) - 또는 동종 렉틴 B4 (IB4) 양성 뉴런 4, 8. DRG 주입 및 후근 압박 손상의 수술로 매우 침략하고 섬세한, 우리는이 문서가 새로운 사용자는 매우 효율적인 방식으로 절차를 학습하는 데 도움이 될 것입니다 믿습니다. C8 등의 루트 압박 손상 - ​​동시 C5와 C7의 DRGs -이 문서에서 우리는 성인 사주 C6로 제어 바이러스 AAV5-GFP (녹색 형광 단백질)의 주입 후 쥐에서 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 모델은 감각 축삭의 재생을 촉진하는 바이러스 성 유전자 치료의 사용을 조사하고 연구에 특히 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>Fast Green FCF dye</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td>For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1%</td></tr><tr><td>Cholera Toxin B subunit</td><td>List Biological Laboratories</td><td>104</td><td>For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1%</td></tr><tr><td>IsoFlo</td><td>Zoetis</td><td>115095</td><td>Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane)</td></tr><tr><td>Baytril 2.5% injectable</td><td>Bayer</td><td>05032756093017</td><td>Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer&#039;s recommended dosage: 10 mg/kg</td></tr><tr><td>Carprieve 5.0% w/v</td><td>Norbrook</td><td>02000/4229</td><td>Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer&#039;s recommended dosage: 4 mg/kg</td></tr><tr><td>Lacri-Lube</td><td>Allergan</td><td>PL 00426/0041</td><td>Eye ointment</td></tr><tr><td>Olsen-Hegar Needle Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 12502-12</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7 mm Cup</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Bonn Micro Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 11083-07</td><td>For performing dorsal root crush injury</td></tr><tr><td>Tissue Separating Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 14072-10</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Goldstein Retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 17003-03</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors (straight)</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST 15018-10</td><td></td></tr><tr><td>SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge</td><td>Ethicon</td><td>1972</td><td>For bleeding control</td></tr><tr><td>Microliter Syringe RN701 (10 &amp;mu;L)</td><td>Hamilton</td><td>80330</td><td></td></tr><tr><td>Custom-made Removable Needle (for DRG injection)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>33 gauge, 38 mm, point style 3</td></tr><tr><td>Custom-made Removable Needle (for CTB injection)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>33 gauge, 10 mm, point style 3</td></tr><tr><td>UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr></tbody></table>

dorsal root ganglion injection and dorsal root crush injury as a model for sensory axon regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

표현 된 바와 같이, 부착 DRG와 횡 척수 부는 C7에 직접, DRG 신경 세포를 형질 도입 4 주 제어 바이러스 AAV5-GFP를 주사 한 후 척수 감각 축삭 추적이 프로토콜의 효과를 보여주기 위해 제시 지느러미 루트 압박 손상 (그림 1A)없이 DRG. 등쪽 칼럼 척수 후각 축삭 모두 GFP (도 1b),뿐만 아니라 주입 DRG (도 1C) 내의 균체 및 축삭을 표현한다. cuneat...

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Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

등쪽 뿌리 신경절 사출 및 지느러미 루트 감각 축삭의 재생을위한 모델로 부상 크러시

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

dorsal-root-ganglion-injection-dorsal-root-crush-injury-as-model-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.8K 조회수.  University of Cambridge. This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

비디오: Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Axonal 상해 다음 도설 루트 신경 조직에서 염색질의 Immunoprecipitation

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

연구

신경과학

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Rhizotomy 후 도설 루트 Axons의 라이브 영상

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

라이브 이미징 및 상해 응답의 연구에 대한 마이크로 유체 칩을 사용<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

생체공학

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

전체 마운트 근육 분석에 의한 재현성 마우스 좌골 신경 크러시와 중생의 후속 평가

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Combining Peripheral Nerve Grafting and Matrix Modulation to Repair the Injured Rat Spinal Cord

Traumatic injury to the spinal cord (SCI) causes death of neurons, disruption of motor and sensory nerve fiber (axon) pathways and disruption of communication with the brain. One of the goals of our research is to promote axon regeneration to restore connectivity across the lesion site. To accomplish this we developed a peripheral nerve (PN) grafting technique where segments of sciatic nerve are either placed directly between the damaged ends of the spinal cord or are used to form a bridge across the lesion. There are several advantages to this approach compared to transplantation of other neural tissues; regenerating axons can be directed towards a specific target area, the number and source of regenerating axons is easily determined by tracing techniques, the graft can be used for electrophysiological experiments to measure functional recovery associated with axons in the graft, and it is possible to use an autologous nerve to reduce the possibility of graft rejection. In our lab we have performed both autologous (donor and recipient are the same animal) and heterologous (donor and recipient are different animals) grafts with comparable results. This approach has been used successfully in both acute and chronic injury situations. Regenerated axons that reach the distal end of the PN graft often fail to extend back into the spinal cord, so we use microinjections of chondroitinase to degrade inhibitory molecules associated with the scar tissue surrounding the area of SCI. At the same time we have found that providing exogenous growth and trophic molecules encourages longer distance axonal regrowth into the spinal cord. Several months after transplantation we perform a variety of anatomical, behavioral and electrophysiological tests to evaluate the recovery of function in our spinal cord injured animals. This experimental approach has been used successfully in several spinal cord injury models, at different levels of injury and in different species (mouse, rat and cat). Importantly, the peripheral nerve grafting approach is effective in promoting regeneration by acute and chronically injured neurons.

Traumatic injury to the spinal cord disrupts communication with the brain. To restore lost connectivity we utilize a peripheral nerve graft to provide a substratum for regenerating fibers in combination with neurotrophic factors and matrix-modulating enzymes to remove inhibitory molecules to promote long distance growth.

부상당한 쥐 척수를 복구하는 주변 신경 이식과 매트릭스 변조를 결합

Traumatic injury to the spinal cord (SCI) causes death of neurons, disruption of motor and sensory nerve fiber (axon) pathways and disruption of ...

생물학

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

루트 신경절 신경 세포와 차별화 된 지방 유래 줄기 세포를 이룬다 :<em&gt; 체외</em&gt; 공동 문화 모델은 주변 신경 재생을 연구하는

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

주변에 Neuroregeneration 중앙 신 경계를 연구 하 고 대 한 Vivo에서 초파리 부상 모델

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

의학

Sheath-Preserving Optic Nerve Transection in Rats to Assess Axon Regeneration and Interventions Targeting the Retinal Ganglion Cell Axon

Retinal ganglion cell (RGC) axons converge at the optic nerve head to convey visual information from the retina to the brain. Pathologies such as glaucoma, trauma, and ischemic optic neuropathies injure RGC axons, disrupt transmission of visual stimuli, and cause vision loss. Animal models simulating RGC axon injury include optic nerve crush and transection paradigms. Each of these models has inherent advantages and disadvantages. An optic nerve crush is generally less severe than a transection and can be used to assay axon regeneration across the lesion site. However, differences in crush force and duration can affect tissue responses, resulting in variable reproducibility and lesion completeness. With optic nerve transection, there is a severe and reproducible injury that completely lesions all axons. However, transecting the optic nerve dramatically alters the blood brain barrier by violating the optic nerve sheath, exposing the optic nerve to the peripheral environment. Moreover, regeneration beyond a transection site cannot be assessed without reapposing the cut nerve ends. Furthermore, distinct degenerative changes and cellular pathways are activated by either a crush or transection injury.
The method described here incorporates the advantages of both optic nerve crush and transection models while mitigating the disadvantages. Hydrostatic pressure delivered into the optic nerve by microinjection completely transects the optic nerve while maintaining the integrity of the optic nerve sheath. The transected optic nerve ends are reapposed to allow for axon regeneration assays. A potential limitation of this method is the inability to visualize the complete transection, a potential source of variability. However, visual confirmation that the visible portion of the optic nerve has been transected is indicative of a complete optic nerve transection with 90-95% success. This method could be applied to assess axon regeneration promoting strategies in a transection model or investigate interventions that target the axonal compartments.

<meta charset="utf8"></head><body>축삭 재생을 평가하기 위한 쥐의 시신경 절편 보존 및 망막 신경절 세포 축삭을 표적으로 하는 중재

This protocol describes an optic nerve transection that preserves the optic nerve sheath in rats. Hydrostatic pressure from microinjections into the optic nerve generate a complete transection, allowing for sutureless reapposition of the transected optic nerve ends and direct targeting of the axonal compartment in a transection model.

등쪽 뿌리 신경절 사출 및 지느러미 루트 감각 축삭의 재생을위한 모델로 부상 크러시

요약

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