Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Christopher and Dana Reeve Foundation, il Medical Research Council, il Consiglio europeo della ricerca ECMneuro, e il Cambridge NHMRC Biomedical Research Center. Vorremmo esprimere la nostra più profonda gratitudine a Heleen Merel van &#39;t Spijker e Justyna Barratt per la loro assistenza tecnica durante le riprese. Vorremmo ringraziare il Dott Elizabeth Moloney e il professor Joost Verhaagen (Netherlands Institute for Neuroscience) per l&#39;assistenza nella produzione di AAV.

Tutte le seguenti procedure di animali sono state condotte in accordo con il Regno Unito Animali (procedure scientifiche) Act 1986. Se familiarità con queste procedure, si prega di verificare con le normative locali / nazionali e consultare un veterinario prima di iniziare il protocollo. 1. La scelta di uno Strain Adatto degli animali NOTA: Una radice dorsale risultati lesione da schiacciamento nella perdita di sensibilità e zampa deafferentazione. effetti avversi più comuni di zampa anteriore deafferentazione possono includere over-governare, automutilazione, e zampa autotomia. <ol><li> Ottenere gli animali per la procedura. NOTA: per ratti, i ceppi più attivi, come Lister-incappucciato e Wistar, hanno una maggiore incidenza di zampa autotomia dopo deafferentazione rispetto ai ceppi più docile, come Lewis e Sprague-Dawley. Se possibile, il ceppo più docile, Lewis, dovrebbe sempre essere presa in considerazione prima. Dovrebbe essere necessario per l&#39;esperimento un ceppo particolarmente attivo dovuta al m geneticaODIFICA o requisiti specifici di valutazione del comportamento, cure veterinarie devono essere in atto per affrontare gli effetti negativi previsti. </li></ol> 2. Preparazione del virus per iniezione ATTENZIONE: Maneggiare tutti i virus in conformità alle normative di sicurezza biologica e di laboratorio. <ol><li> Diluire o concentrare il virus ad un titolo di 2 x 10 copia 12 genoma (GC) / mL seguendo protocolli di confezionamento individuale dei virus 9. NOTA: Qui, il virus è stato diluito in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS) con il 5% di saccarosio. Il titolo può essere ottimizzato a seconda del tipo di virus, promoter, costruire dimensioni, e mirata tipo di cellula. </li><li> Opzionale: Aggiungere 1% colorante (ad esempio, Fast Verde) per la soluzione di virus per una facile visualizzazione della iniezione in seguito. Mescolare la soluzione molto delicatamente. </li><li> Conservare la soluzione in ghiaccio per uso immediato (entro 4 ore) o in un congelatore C -80 ° per lungoconservazione a lungo termine. </li></ol> 3. Esecuzione della preoperatoria Preparazione del Animal NOTA: A causa della estrema invasività della chirurgia, le tecniche di asepsi in ogni momento. <ol><li> Preparare e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e il telaio stereotassico vertebrale prima di iniziare l&#39;intervento chirurgico. Ad esempio, sterilizzare gli strumenti in autoclave a 134 ° C. Utilizzare una nuova serie di strumenti sterilizzati per ogni animale. </li><li> Anestetizzare l&#39;animale. Confermare il corretto anestesia pizzicando la zampa per verificare il riflesso di ritiro o toccando la cornea per il riflesso palpebrale. <ol><li> Per ratti adulti utilizzando anestesia per inalazione come isoflurano, utilizzare 4% isoflurano in 2,0 L / min di ossigeno per l&#39;induzione. Per la manutenzione durante l&#39;intervento chirurgico, utilizzare 2 - 3% isoflurano in 1,5 L / min di ossigeno, variando la concentrazione di isoflurano secondo il modello di respirazione dell&#39;animale per evitare dosaggio sotto-sovra o. </li></ol></li><li> SopraCE L&#39;animale viene anestetizzato inizialmente, registrare il peso preoperatorio dell&#39;animale. </li><li> Per l&#39;iniezione DRG cervicale, radere il pelo sul collo di tra le orecchie per appena distale al scapole. Disinfettare la zona rasata con un prodotto antisettico. </li><li> Iniettare 2 ml di soluzione salina per via sottocutanea sul fianco dell&#39;animale, insieme con una dose adeguata di analgesico (es, 5 mg / kg carprofen) e antibiotici (ad esempio, 5 mg / kg enrofloxacina). </li><li> Applicare una pomata occhio ad entrambi gli occhi per evitare l&#39;essiccazione della cornea durante la procedura. </li><li> Procedere alla chirurgia su un telaio stereotassico vertebrale con un cuscinetto riscaldante a 37 ° C posto sotto l&#39;animale. </li></ol> 4. Iniezione DRG ed esecuzione di un Crush Injury radice dorsale NOTA: Si tratta di un intervento chirurgico estremamente delicato. Si consiglia di pratica su alcuni animali morti prima di familiarizzare con l&#39;anatomia prima di avanzare a vivere la chirurgia degli animali. <ol><li> LOcate prominenti processi spinosi C2 e T2 sulla pelle. Fare un&#39;incisione cutanea tra le C2 e T2 processi spinosi con una lama di bisturi n.10 (una volta che la pelle è aperto, una linea mediana bianco, fibroso-tessuto deve essere visibile sul primo strato del muscolo, il primo strato di muscolo ha un &quot; gelatinoso&quot; texture). </li><li> Eseguire un&#39;incisione di dimensioni simili sul primo strato del muscolo lungo la linea mediana bianco utilizzando un bisturi. Non andare al di là del processo spinoso T2 di primo piano, in quanto v&#39;è un ramo arterioso importante dal aorta discendente trova lì vicino. NOTA: sanguinamento pesante può verificarsi ovunque da questo punto in poi. interrompere sempre l&#39;emorragia e rimuovere il sangue utilizzando cotton fioc sterili o spugne riassorbibili chirurgici per permettere la visualizzazione chiara in ogni momento. Procedendo con la procedura &quot;alla cieca&quot; può causare danni indesiderati al midollo spinale, DRG, o delle radici dorsali, portando ad effetti avversi inattesi nell&#39;animale in seguito. </li><li> ritrarre laprimo strato di muscolo usando due divaricatori poste una rostralmente e uno caudalmente; il secondo strato di muscolo, con un aspetto striato, dovrebbe essere visibile. </li><li> Individuare la linea mediana del secondo strato di muscolo (dove si possono osservare due muscoli longitudinali collegati da un sottile tessuto, membranosa). Sezionare il tessuto membranoso utilizzando una coppia di microscissors per separare i due muscoli longitudinali. Evitare l&#39;uso di una lama di bisturi, se possibile, in quanto ciò potrebbe causare danni muscolari inutili e sanguinamento. </li><li> Regolare i divaricatori di conseguenza per esporre il terzo strato di muscolo sottile che copre la colonna vertebrale. I processi spinosi può essere sentito toccando leggermente con un paio di pinze sul terzo strato di muscolo. </li><li> Fare una piccola incisione sul terzo strato di muscolo utilizzando microscissors e delicatamente raschiare il muscolo dall&#39;osso utilizzando una curette o di bisturi in maniera sideway per esporre chiaramente le vertebre. Se necessario, tagliare alcuni dei muscoli o tendini via per fare la laminectomy più facile. </li><li> Per esporre la C5 sinistra - DRG C8, eseguire un fianco emi-laminectomia sul C4 - vertebre T1 rimuovendo accuratamente parte della lamina e peduncolo utilizzando una coppia di Rongeurs sottili. DRG si trova vicino forame trasversali delle vertebre. NOTA: C3 - C7 vertebre non hanno un processo spinoso di primo piano. C5 DRG si trova tra C4 e C5 vertebre, C6 DRG è tra C5 e C6 vertebre, e così via, mentre il C8 DRG è tra C7 e T1 vertebre. Non v&#39;è alcun vertebra C8, nonostante la presenza di un DRG C8 e un segmento del midollo spinale C8. </li><li> Una volta abbastanza del DRG è stato esposto per l&#39;iniezione, di preparare la siringa mettendo la siringa microlitro virus-riempita dotata di una, l&#39;ago 33-gauge smussato su misura sul supporto della siringa stereotassica. Prima dell&#39;iniezione, utilizzare un ago smussato 30 gauge per effettuare una piccola apertura superficiale su ciascuno dei DRG mirata per assistere con l&#39;inserimento dell&#39;ago iniezione. </li><li> Inserire il 33-gauge ago nel centro della DRG ruotando delicatamente la manopole per regolare le coordinate stereotassica. Non over-inserire l&#39;ago, in quanto ciò potrebbe causare fluido fuoriuscire dalla parte ventrale del DRG. Caso di perdite, regolare la posizione dell&#39;ago immediatamente. NOTA: Le coordinate stereotassica numerici non sono utilizzati; Tuttavia, è utile utilizzare il telaio per mantenere l&#39;ago per l&#39;iniezione. </li><li> Iniettare 1 ml di virus in ciascun DRG a 0,2 ml / min utilizzando una pompa per infusione a siringa. Attendere per altri tre minuti prima di estrarre l&#39;ago. Durante l&#39;iniezione, il DRG cambierà lentamente colore se la soluzione virus contiene un colorante. </li><li> Per eseguire un concomitante C5 - C8 lesioni spinali schiacciare, schiacciare ogni radice tre volte per 10 s ciascuno utilizzando una coppia di pinze a punta fine (Bonn Micro), opposte estremità delle pinze totalmente; una linea bianca nel tessuto dovrebbe comparire nel sito cotta. Non andare più a fondo richiesto con la forceps, poiché ciò può causare danni alla radice ventrale. </li><li> Dopo l&#39;iniezione e / o schiacciare, assicurarsi che non v&#39;è alcun sanguinamento o piccoli pezzi di frammenti ossei lasciati al sito di incisione prima di chiudere l&#39;animale. Se preferito, inserire un piccolo pezzo di spugna chirurgica assorbibile in cima al midollo spinale esposto e DRG. </li><li> Lasciare che il terzo strato di muscolo per ritrarre di nuovo, naturalmente, sulla colonna vertebrale, senza sutura. Liberamente sutura i due muscoli longitudinali sul secondo strato (≈ 3 interrotti suture) con assorbibile materiale 6-0 sutura. Suturare il primo strato di muscolo (≈ 5 interrotto suture) con assorbibile materiale 6-0 sutura. </li><li> Suturare la pelle con assorbibile 5-0 materiale di sutura (≈ 10 interrotto suture). NOTA: Assicurarsi che i punti di sutura non siano troppo strette. Rigonfiamento della pelle è un segno di un eccesso di serraggio e può causare disagio per l&#39;animale. </li><li> Se l&#39;emorragia pesante verificato durante l&#39;intervento chirurgico, sottocutanea iniettare 1 - 2mL di soluzione fisiologica per ricostituire la perdita di liquido dall&#39;animale come consentito dalla normativa locale. </li><li> Fornire gel idratante commestibile e permettere all&#39;animale di riprendersi completamente dall&#39;anestesia, eseguendo un controllo regolare per almeno 1 ora prima di ritornare l&#39;animale ritorna alla zona di attesa. </li><li> Mantenere l&#39;animale per almeno 3 settimane per l&#39;espressione del transgene ottimale per valutare la rigenerazione degli assoni sensoriali. </li></ol> 5. Esecuzione di assistenza post-operatoria del Animal <ol><li> Fornire poltiglia cibo e biancheria da letto di cotone morbido per l&#39;animale durante la prima settimana post-operatorio. Se necessario, somministrare dosi addizionali di analgesici e antibiotici per aiutare con il recupero in conformità con le norme locali / nazionali e consigli veterinaria. </li><li> Rimuovere i punti di sutura sulla pelle dopo 7 - 10 giorni. NOTA: effetti avversi più comuni della chirurgia includono la formazione di sieroma o un ematoma al sito di incisione, graffio segni sulla pelle a causa del prurito causato dale suture assorbibili interni, deficit sensoriali o locomozione sottili, e segni di automutilazione sulla zampa deafferented dopo la lesione da schiacciamento delle radici dorsali. Per eventuali problemi di benessere che sono sostanzialmente più grave del previsto, consultare veterinaria immediato. </li></ol> 6. Esecuzione di un&#39;iniezione anterograda CTB per assonale Tracing NOTA: Si raccomanda di eseguire tossina colerica B subunità (CTB) assonale tracciando una settimana prima della raccolta del tessuto. <ol><li> Preparare 1% soluzione CTB come da istruzioni del produttore. </li><li> Opzionale: Aggiungere colorante 1% alla soluzione per una facile visualizzazione della iniezione in seguito. Mescolare la soluzione molto delicatamente. </li><li> Anestetizzare l&#39;animale (vedere fase 3.2.1) e stabilizzare la zampa anteriore sinistra di nastratura l&#39;arto al tavolo. </li><li> Manualmente e iniettare lentamente 1 ml di 1% CTB per via sottocutanea al centro della zampa glabro e quattro cifre utilizzando una connessione Wi microlitro siringa graduataTh A, 33-gauge ago corto su misura. NOTA: Prima dell&#39;iniezione, aiuta a usare prima un ago smussato da 30 gauge per fare una piccola apertura superficiale sulla pelle, che assiste con l&#39;inserimento dell&#39;ago iniezione. </li><li> Permettere all&#39;animale di riprendersi completamente da anestesia prima di tornare l&#39;animale alla zona di attesa. </li></ol> 7. Raccolta Tissue <ol><li> Per raccogliere il DRG virus iniettato e del midollo spinale per immunoistochimica, somministrare una dose eccessiva di anestetico e transcardially profumato l&#39;animale con PBS seguita da freddo 4% paraformaldeide. eseguire con cura un laminectomia completa sulla colonna vertebrale per raccogliere il tessuto fissato al microscopio. Alla predisposizione dei tessuti, sezionamento e lavorazione come richiesto per l&#39;analisi 4, 5, 6. NOTA: Il sito dell&#39;incisione recuperato dovrebbe essere evidente, come rilevato dalla presenza di stessuto dell&#39;automobile. </li><li> In alternativa, per raccogliere il DRG virus iniettato per la coltura in vitro, sacrificare l&#39;animale in modo umano con un metodo approvato, come ad esempio un aumento di concentrazione di anidride carbonica. sezionare accuratamente DRG al microscopio, assicurando condizioni asettiche quando possibile. Procedere con la coltura di tessuti come desiderato 4, 5, 6, 10. </li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+novel+adeno-associated+virus+(AAV)+vector+that+crosses+the+seizure-compromised+blood-brain+barrier+(BBB).">Directed evolution of a novel adeno-associated virus (AAV) vector that crosses the seizure-compromised blood-brain barrier (BBB).</a> Mol Ther. 18 (3), 570-578 (2010).</li><li>Fagoe, N. D., Attwell, C. L., Kouwenhoven, D., Verhaagen, J., Mason, M. 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James Fawcett is a paid consultant for Acorda Therapeutics and Novartis.

In questo articolo, presentiamo una guida passo-passo per eseguire un&#39;iniezione DRG e lesione da schiacciamento radice dorsale in basso cervicale midollo spinale di ratto adulto. Poiché si tratta di un intervento chirurgico estremamente invasiva e delicata, si consiglia vivamente che tutti i potenziali utenti di ottenere la formazione e la pratica sufficiente prima di avanzare a vivere la chirurgia degli animali. Gli utenti dovrebbero avere familiarità non solo con l&#39;anatomia del midollo spinale, ma anche con ...

Il raggiungimento di rigenerazione degli assoni dopo una lesione del sistema nervoso è un compito impegnativo 1. Per studiare il fallimento della rigenerazione assonale nel sistema nervoso centrale (SNC), i ricercatori hanno usato una pletora di modelli di lesioni nervose. Come regioni del SNC differiscono, è importante utilizzare un modello anatomicamente appropriato per studiare la rigenerazione assonale. Utilizzando il modello appropriato, i ricercatori possono formulare una terapia specifica in base alla gravità del danno, il tipo di cellule neuronali di interesse, e il tratto della colonna vertebrale desiderato per valutare la rigenerazione, al contrario di una strategia di trattamento &quot;uno-per-tutti&quot;. Lesioni del midollo spinale, per esempio, i sintomi più debilitanti derivano dalla perdita di sensibilità e locomozione. Perdita di sensibilità è causata da un danno ai percorsi sensoriali ascendente, mentre la perdita di locomozione è causata da un danno alle vie motorie discendenti. A causa di differenze cellulari e anatomiche tra questi two percorsi, molti studi di rigenerazione degli assoni mirati concentrano solo su uno o l&#39;altro percorso, con la motivazione che il successo di recupero di entrambi sarebbe di enorme beneficio per i pazienti. In questo articolo, presentiamo un protocollo che utilizza un&#39;iniezione diretta gangli della radice dorsale (DRG) con un vettore virale e un concomitante radice dorsale lesione da schiacciamento nella inferiore cervicale midollo spinale di ratto adulto come modello per studiare la rigenerazione assonale sensoriale. DRG neuroni sensoriali sono responsabili per la trasmissione di informazioni sensoriali, come la sensazione tattile e il dolore, dalla periferia al SNC. Le lunghe proiezioni assonale dei neuroni sensoriali del midollo spinale servire come un buon modello per studiare la rigenerazione degli assoni a lunga distanza. Inoltre, come roditori possono sopravvivere ad una lesione percorso sensoriale, come una lesione da schiacciamento radice dorsale con complicazioni assistenziali minimi, i ricercatori possono studiare la rigenerazione degli assoni del sistema nervoso centrale, senza la necessità di lesioni completamente il midollo spinale. Una quadrupla C5 - C8 (cervicale level 5 - 8) della radice dorsale lesione da schiacciamento ha dimostrato di essere un modello utile per forepaw deafferentazione 2. Inoltre, una dorsale lesioni radice schiacciamento fornisce un modello &quot;pulito&quot; per studiare la rigenerazione assonale di una lesione del midollo spinale diretta perché è complicata da altri fattori, quali la formazione della cicatrice gliale. L&#39;uso della terapia genica virale per riprogrammare i neuroni in uno stato rigenerativo è stata sempre considerata come una strategia di trattamento promettente per molte condizioni neurologiche 3. Gli studi hanno dimostrato l&#39;applicazione di un vettore virus adeno-associato (AAV) portante il transgene di una proteina che favorisce la crescita può raggiungere rigenerazione assonale robusta con recupero comportamentale 4, 5, 6. La bassa patogenicità apparente di AAV nel provocare una risposta immunitaria e la capacità di trasdurre cellule che non si dividono, come i neuroni, rendonocosì il vettore ottimale per la terapia genica. Inoltre, il modulo AAV ricombinante è utilizzato per la terapia. In questa forma, è incapace di integrare suo genoma virale nel genoma dell&#39;ospite 7, riducendo il rischio di mutagenesi inserzionale rispetto ad altri vettori virali, come lentivirus. Questo rende AAV una scelta sicura per applicazioni di terapia genica. Come DRG contiene i corpi cellulari dei neuroni sensoriali, è il bersaglio anatomico più appropriata per la somministrazione del virus per la terapia genica di studiare e / o promuovere la rigenerazione assonale sensoriale. In uno studio comparativo differenti sierotipi di AAV e lentivirus, AAV sierotipo 5 (AAV5) ha dimostrato di essere il più efficiente in trasduzione neuroni DRG su un percorso tempo di almeno 12 settimane quando iniettato direttamente nel DRG 8. Inoltre, AAV può raggiungere più del 40% efficienza di trasduzione, trasduzione tutti i sottotipi neuronali DRG, come il grande diametro neurofilamenti 200 kDa(NF200) neuroni -positive e il piccolo diametro CGRP (CGRP) - o b4 isolectin (IB4) neuroni -positive 4, 8. Poiché la procedura chirurgica di iniezione DRG e lesione da schiacciamento delle radici dorsali è estremamente invasivo e delicato, noi crediamo che questo articolo vi aiuterà i nuovi utenti ad imparare la procedura in modo molto efficiente. In questo articolo, mostriamo risultati rappresentativi di ratti adulti quattro settimane dopo l&#39;iniezione di un virus controllo AAV5-GFP (proteina fluorescente verde) in C6 - C7 DRG con un concomitante C5 - C8 spinali lesione da schiacciamento. Questo modello è particolarmente adatto per i ricercatori che stanno indagando l&#39;uso della terapia genica virale per promuovere la rigenerazione degli assoni sensoriali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258</td>
			<td>For visualizing colorless solution. Recommended concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin B subunit</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>104</td>
			<td>For anterograde axonal tracing. Recommended concentration: 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>115095</td>
			<td>Inhalation anesthetic (active ingredient: isoflurane)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 2.5% injectable</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>05032756093017</td>
			<td>Antibiotic (active ingredient: enrofloxacin). Manufacturer&#39;s recommended dosage: 10 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprieve 5.0% w/v</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>02000/4229</td>
			<td>Analgesic (active ingredient: carprofen). Manufacturer&#39;s recommended dosage: 4 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacri-Lube</td>
			<td>Allergan</td>
			<td>PL 00426/0041</td>
			<td>Eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar Needle Holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>FST 12502-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman Pearson Rongeur Curved 0.7mm Cup</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>FST 16121-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bonn Micro Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>FST 11083-07</td>
			<td>For performing dorsal root crush injury</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Separating Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>FST 14072-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>FST 14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>FST 11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goldstein Retractor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>FST 17003-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors (straight)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>FST 15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURGIFOAM Absorbable Gelatin Sponge</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1972</td>
			<td>For bleeding control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringe RN701 (10 &#956;l)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made Removable Needle (for DRG injection)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td>33 gauge, 38 mm, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made Removable Needle (for CTB injection)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td>33 gauge, 10 mm, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>UMP3-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dorsal root ganglion injection and dorsal root crush injury as a model for sensory axon regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

Come una rappresentazione, una sezione trasversale del midollo spinale con DRG allegata viene presentato per mostrare l&#39;efficacia di questo protocollo di trasduzione neuroni DRG e rintracciare assoni sensoriali del midollo spinale quattro settimane dopo l&#39;iniezione di un virus di controllo, AAV5-GFP, direttamente nel C7 DRG senza pregiudizio radice dorsale schiacciamento (Figura 1A). Assoni sia nella colonna dorsale e il corno dorsale del midollo spinale esprimon...

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Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Radice dorsale Ganglion iniezione e dorsale radice Lesioni Crush come un modello per sensoriale Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.7K Views.  University of Cambridge. This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Video: Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Immunoprecipitazione della cromatina dal tessuto dei gangli dorsali seguenti danno assonale

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Ricerca

Neuroscienze

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Imaging in diretta degli assoni spinali dopo rizotomia

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

Misurare spinale Presinaptiche inibizione nei topi radice dorsale Recording potenziale<em&gt; In Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-coltura modello per studiare Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In Vitro Modellazione di cancerose Neural Invasion: La dorsale della radice Ganglio Modello

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Un approccio per migliorare l&#39;allineamento e la mielinizzazione dorsale Root Ganglion neuroni

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive targets for injection of novel therapeutics aimed at treating chronic pain. In small animal models, laminectomy has been used to facilitate DRG injection because it involves surgical removal of the vertebral bone surrounding each DRG. We demonstrate a technique for intraganglionic injection of lumbar DRG in a large animal species, namely, swine. Laminotomy is performed to allow direct access to DRG using standard neurosurgical techniques, instruments, and materials. Compared with more extensive bone removal via laminectomy, we implement laminotomy to conserve spinal anatomy while achieving sufficient DRG access. Intraoperative progress of DRG injection is monitored using a non-toxic dye. Following euthanasia on post-operative day 21, the success of injection is determined by histology for intraganglionic distribution of 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). We inject a biologically inactive solution to demonstrate the protocol. This method could be applied in future preclinical studies to target therapeutic solutions to DRG. Our methodology should facilitate testing the translatability of intraganglionic small animal paradigms in a large animal species. Additionally, this protocol may serve as a key resource for those planning preclinical studies of DRG injection in swine.

We describe a method for laminotomy in swine that provides access to lumbar dorsal root ganglia (DRG) for intraganglionic injection. Injection progress is monitored intraoperatively and histologically confirmed up to 21 days after surgery. This protocol could be used for future preclinical studies involving DRG injection.

Laminotomia per accesso del ganglio di radice dorsale lombare e l'iniezione nei suini

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of the PNS are affected by injury and disease, affecting the nerve function and the capacity for regeneration. Neuronal immune cells are commonly analyzed by immunofluorescence (IF). While IF is essential for determining the location of the immune cells in the nerve, IF is only semi-quantitative and the method is limited to the number of markers that can be analyzed simultaneously and the degree of surface expression. In this study, flow cytometry was used for quantitative analysis of leukocyte infiltration into sciatic nerves or dorsal root ganglions (DRGs) of individual mice. Single cell analysis was performed using DAPI and several proteins were analyzed simultaneously for either surface or intracellular expression. Both sciatic nerves from one mouse that were treated according to this protocol generated &#8805; 30,000 single nucleated events. The proportion of leukocytes in the sciatic nerves, determined by expression of CD45, was approximately 5% of total cell content in the sciatic nerve and approximately 5-10% in the DRG. Although this protocol focuses primarily on the immune cell population within the PNS, the flexibility of flow cytometry to measure a number of markers simultaneously means that the other cells populations present within the nerve, such as Schwann cells, pericytes, fibroblasts, and endothelial cells, can also be analyzed using this method. This method therefore provides a new means for studying systemic effects on the PNS, such as neurotoxicology and genetic models of neuropathy or in chronic diseases, such as diabetes.

Quantitative analysis of cell content within the murine sciatic nerve is difficult due to the scarcity of the tissue. This protocol describes a method for tissue digestion and preparation that provides sufficient cells for flow cytometry analysis of immune cell populations from nerves of individual mice.

Analisi delle cellule immuni in singolo nervo sciatico e del ganglio della radice dorsale da un singolo Mouse mediante citometria a flusso

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.