이 연구는 SANPORC 및 ALSA 재단 보조금 (Martin Marsala)에 의해 지원되었습니다. 국가 지속 가능성 프로그램, 프로젝트 번호 LO1609 (체코 교육 청소년 스포츠부); 및 RVO : 67985904 (Stefan Juhas 및 Jana Juhasova).

이 연구는 샌디에고 캘리포니아 대학의 동물 동물 보호 및 사용위원회의 승인을받은 프로토콜에 따라 수행되었으며 동물 실험을위한 실험실 동물 관리 지침 평가 협회를 준수했습니다. 모든 연구는 집단 크기와 동물의 고통을 최소화하는 방식으로 수행되었다. 1. 일반 동물 및 외과 준비 <ol><li> 수술 절차를 시작하기 전에 바이러스 (AAV9 - UBI - GFP, 5 μL aliquots) 8 해동. 덱스 트란 분말을 증류수에 혼합하여 5 % 덱스 트란 (10,000 MW) 용액을 준비한다. 바이러스 용액을 5 % 덱스 트란 용액 1 : 1과 혼합하여 최종 덱스 트란 농도 2.5 %로 만든다. <ol><li> 바이러스 용액을 얼음에 보관하십시오 (4 ° C). </li></ol></li><li> 성인 C57BL / 6J 마우스 (남녀, 20-30 g)를 사용하십시오. 5 % isoflurane (O 2 , 1 L / 분)을 사용하여 마우스를 마취하고 2 에서 그들을 유지호흡 률과 발의 협착 정도에 따라 3 % 흡입 한 isoflurane (O 2 , 1 L / min). </li><li> 면도 면도기로 동물의 등을 면도하고 2 % chlorhexidine으로 피부를 닦으십시오. </li><li> 만성 회복 연구에서 엄격한 무균 기술을 따릅니다. </li><li> 요추 subpial 주사가 수행되어야하는 경우, 메스로 Th8 - L1 척추를 덮고 Tha - 12 척추에서 paravertebral 근육을 분리 피부를 잘라 가위를 사용합니다. <ol><li> 마우스 척추 클램프를 사용하여 표준 stereotaxic 프레임에 동물을 탑재하십시오. </li><li> 균열이 나타날 때까지 치과 용 드릴 (드릴 비트 : 0.9mm, 속도 : 20,000rpm)을 사용하여 Th10-12 척추의 얇은 판의 양 측면을 면도하십시오. </li><li> 포셉로 금이 간 뼈 조각을 제거하고 요추 척수의 척수 표면을 노출. </li><li> 30G 스테인레스 스틸 바늘과 포셉을 사용하여 약 1cm의 경질 뚜껑을 자르십시오. </li></ol></li><li><strong&gt; 자궁 경부 피하 주사를 시행하려면 가위를 사용하여 등쪽 목 피부 1.5-2 cm을 절개하고 C1-C2 절편을 노출 시키십시오. <ol><li> 23G 스테인레스 스틸 바늘과 집게를 사용하여 cisterna magna의 atlanto-occipital 막을 제거합니다. </li><li> 면봉으로 조직 및 뼈 파편의 절개 부위를 닦으십시오. </li><li> 30G 스테인레스 스틸 바늘과 포셉을 사용하여 약 2 ~ 3mm의 경질 뚜껑을 자르십시오. </li></ol></li></ol> 2. Pial Membrane을 열고 AAV9 Delivery를위한 Subpial Needle 삽입 <ol><li> 유리 모세관 홀더 ( 그림 1A 및 B )를 사용하여 XYZ 조작기의 Z-arm에 34G 피아 관통 바늘을 장착합니다. 참고 : 피어 침투 바늘을 제조하려면 34G 바늘의 원래 경 사진 팁을 다이아몬드 연마 판이있는 유리 모세관 베벨러 (거친 모서리 크기 (5.0 μm ~ 50 μm 팁 크기) 및 연삭 각도)로 날카롭게합니다.15 - 20 °. 바늘 끝 (길이 1mm, 끝에서부터 측정)은 약 90 °로 부드럽게 구부립니다 ( 그림 1B , 왼쪽 삽입). </li><li> 8-10 X 배율로 설정된 외과 해부 범위를 사용하여 피아 관통 바늘로 X 암을 사용하여 약 1 mm ( 그림 1C )로 피어를 관통시킵니다. <ol><li> 5 ~ 10 °의 조직 표면에 침투하는 바늘의 각도를 유지하십시오. </li></ol></li><li> pia가 열린 후, X-arm을 사용하여 관 공 공간 ( 그림 1 D)에서 피아 관통 바늘을 수평으로 제거합니다. 참고 : 관통 된 부위는 혈관과 같은 랜드 마크로 기억하십시오. </li><li> PE - 10 또는 PE - 20 튜빙과 주사 바늘에 연결된 50 μL microsyringe를 사용하여 AAV9 - UBI - GFP 바이러스와 무딘 36G 주사 바늘을로드합니다. </li><li> 두 번째 XYZ 조작기의 Z- 아암에 바늘을 장착하십시오 ( 그림 1A </strong&gt; 및 B )를 유리 모세관 홀더 ( 그림 1B , 오른쪽 삽입물)를 사용하여 제거합니다. 참고 : subpial AAV9 주사 바늘을 제조하려면 36G 바늘의 둔각 팁을 다이아몬드 연마 판이있는 유리 모세관 베벨러 (거친 모서리 (5.0 μm ~ 50 μm 팁 크기))로 닦아서 날카로운 모서리를 제거합니다. 바늘 끝 (2-3 mm 길이, 끝에서부터 측정)을 약 90 °로 부드럽게 구부립니다. pia-penetrating 및 subpial 주입 바늘은 1-2cm 길이의 20G 슬레이브 스테인레스 스틸 튜브 (바늘 끝에서 10mm)에 삽입하고 에폭시로 붙입니다. 유리 모세관 홀더에 안전하게 부착하려면 20G (직경 0.91mm) 튜빙을 사용해야합니다. </li><li> 두 번째 매니퓰레이터의 X, Y 및 Z 암을 조작하여 AAV9 주사 바늘의 팁을 피아 삽입 부위에 위치시킨 다음 이전의 pial 멤브레인 구멍을 통해 약 2 ~ 3mm 정도를 엑스 팔( 도 1E 및 F ). 참고 : 1) AAV9-UBI-GFP는 이전에보고 된 프로토콜 9 , 10 에 따라 준비되고 최종 역가는 1.2 x 10 13 게놈 복사 / mL (gc / mL)로 조정됩니다. 2) 쉽게 확인할 수 있기 때문에 병 입구의 위치를 ​​표시 할 필요가 없습니다 ( 그림 1D ). </li><li> 50 μL microsyringe를 사용하여 AAV9 - UBI - GFP (1.5, 3 또는 5 μL)를 subpial 공간에 주입하십시오 (실험 그룹에 대해서는 표 1 참조). </li><li> AAV9 - UBI - GFP 주입이 완료되면 subpial 공간에서 주사 바늘을 제거합니다. </li><li> 4.0 모노 필라멘트 봉합사와 외과 용 클립을 사용하여 근육과 피부를 닫습니다. 참고 : 열린 척추를 봉할 필요가 없습니다. </li><li> 동물이 가열 패드에서 회복되도록하십시오. </li><li> 통증 조절을 위해 Buprenorphine 0.05 mg / kg / sc을 12 시간마다 주사하십시오.수술 후 2 ~ 3 일. </li></ol> 3. 관류 고정, 조직 Cryoprotection 및 Immunofluorescence 얼룩 <ol><li> subpial AAV9 주사 후 미리 정해진 시점에서, 안락사 솔루션 ( 재료 의 표 참조, 0.3 ML)과 transecially 20 ML heparinized 생리 식염수와 PBS에서 4 % paraformaldehyde 20 ML 다음으로 그들을 쥐를 깊이 마취. </li><li> 뼈 rongeur를 사용하여 척수와 두뇌를 해부하고 4 ° C에서 밤새 PBS에 4 % 포름 알데히드에서 사후 수정. </li><li> 최소 5-7 일 동안 PBS에 30 % 자당으로 척수와 뇌를 동결 보관하십시오. </li><li> 저온 유지 장치 (cryostat)에서 코로 날, 횡단 또는 세로 / 가로 동결 절편 (30 μm 두께)을 잘라내어 PBS 4 ° C에 보관하십시오. </li></ol> 4. 척수 및 뇌 절편의 면역 형광 염색 (표 참조) <ol><li> 자유롭게 떠 다니는 섹션을 primar로 배양하십시오.y 항체를 하룻밤. </li><li> 일차 항체와 부화 후, PBS에서 세 번 섹션을 씻어 형광 결합 당나귀 안티 토끼, 당나귀 안티 치킨, 그리고 당나귀 안티 염소 보조 항체와 함께 품어. </li><li> 현미경 슬라이드에 섹션을 마운트, 상온에서 건조하고, 안티 페이드 매체로 그들을 커버. </li><li> epifluorescence 형광 현미경 (목표 : 10X, NA-0.3, 20X, NA-0.8 및 63X, NA-1.4)를 사용하여 이미지를 캡처하십시오. </li></ol>

<ol><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).</li>
<li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li>
<li>Gray, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+differences+of+intravascular+AAV9+delivery+to+neurons+and+glia%3A+a+comparative+study+of+adult+mice+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates.</a> Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).</li>
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<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+AAV9-mediated+suppression+of+mutant+SOD1+slows+disease+progression+and+extends+survival+in+models+of+inherited+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS.</a> Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).</li>
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</ol>

Martin Marsala는 Neurgain Technologies, Inc. (San Diego, USA)의 공동 설립자입니다.

이번 연구는 성체 마우스에서 subpial vector (AAV9) 전달 기술에 대해 설명합니다. 첨부 된 비디오에서 설명한 바와 같이,이 접근법과 기술은 필요한 장비와 피어 - 침투 바늘 및 서브 피알 주사 바늘이 적절하게 제조되고 제조되고 테스트 된 사양에 따라 제공되는 경우 효과적으로 사용할 수 있습니다. 생쥐에서 일관되고 안전하게 자궁 내 주사를 시행 할 때의 중요한 기술?...

다양한 척수 및 CNS 신경 퇴행성 질환을 치료하기위한 AAV 벡터의 사용은 관심 유전자의 발현을 효과적으로 상향 조절하거나 침묵시키는 잘 받아 들여지는 플랫폼이되고있다. CNS / 척수 장애를 치료하기위한이 기술의보다 효과적인 활용에 대한 주요 제한 사항 중 하나는 성인 포유류의 심부 뇌 또는 척수 실질에 AAV 벡터를 전달하는 능력이 제한적이라는 것입니다. 그것은 성인 쥐, 고양이, 또는 인간이 아닌 영장류에서 AAV9의 전신 배달 뇌와 척수 1, 2, 3의 신경 세포에서 유전자의 발현을 유도에서만 적당히 효과가 있음을 예를 들어 설명되었다. 해부학 적으로 정의 된 뉴런 풀에서 제한된 도입 유전자 발현만을 유도하는 것으로 AAV9 벡터의보다 효과적인 척수강 내 전달이 또한 나타났다. 더 구체적으로, 그것은 악마들이었습니다.비인간 영장류, 돼지 또는 설치류에서 cisternal 또는 lumbo-sacral intrathecal AAV9 전달이 척수 α 운동 신경 세포 및 분절 지느러미 뿌리 신경절 뉴런에서 높은 수준의 전이 유전자 발현을 유도한다. 그러나 척추 신경 계통 또는 백질의 오름차순 또는 내림차순 축삭에서는 최소한 또는 전혀 발현이 4 , 5 , 6 , 7로 나타난다. 종합적으로, 이러한 데이터는 매우 효과적인 생물학적 - 해부학 적 장벽이 존재한다는 것을 보여 주며, 척수 내에서 전달 된 AAV가 더 깊은 척추 실질로 확산되는 것을 방지합니다. 성인 쥐와 돼지를 사용하여 이전 연구에서 새로운 subpial 벡터 전달 기술은 8 개발되었다. 이 접근법을 사용하여 single-bolus subpial AAV9 전달 후 매우 강력하고 다 분절 형질 전환 유전자 발현이 입증되었습니다. 강렬한 GFP 발현이 지속적으로 나타남교감 신경절 세포, 신경 교세포, 하강 / 상행 축삭에서 주입 된 척추 분절을 통해 관찰되었다. 이 연구는 피 아게트가 척수 실질 내로의 효과적인 AAV9 확산을 막을 수있는 주요 장벽임을 나타냈다. 이 이전에 개발 된 기술과 subpial 주입 장치는 대형 설치류 (쥐와 같은) 또는 성인 돼지에서 비교적 사용하기 쉽지만,이 시스템은 성인 마우스와 같은 작은 동물에서 사용하기에 적합하지 않습니다. 다양한 신경 퇴행성 장애의 이용 가능한 트랜스 제닉 마우스 모델이 매우 많기 때문에, 마우스에서 효과적인 척추 - 실질 세포 전달 기술의 개발이 분명한 필요성이있다. 이러한 기술의 이용 가능성은 세포 비 특이성 ( 예, 사이토 메갈로 바이러스 -MVV 또는 유비퀴틴) 또는 세포 특이 적 ( 예, 시냅스 또는 글라 이알)을 사용하는 특정 유전자 사일런 싱 ( 예 : shRNA 사용) 또는 상향 조절의 효과를 연구 할 수있다 섬유 성 산성단백질 (GFAP)) 프로모터를 포함한다. 따라서, 현재 연구에서, 우리는 성인 생쥐에서 효과적으로 사용할 수있는 소형 subpial 벡터 전달 시스템을 개발하고 검증했다. 유사하게, 이전의 쥐 및 돼지 연구에서와 마찬가지로,이 연구는 쥐에서 단일 - 볼 러스 서브 피알 AAV9 전달 후 척수 실질 전반에 걸쳐 강력한 전이 유전자 발현을 입증한다. 이 접근법의 단순성, subpial AAV9 전달에 주입 된 마우스의 아주 좋은 내성 및 척수 실질에서의 형질 전환 유전자 발현의 높은 효능은이 기술이 실험실 환경에서 효과적으로 수행되고 척추 유전자 발현을 목표로하는 실험에 사용됨을 시사한다.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J Mice</td><td>Jackson Labs</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Lab Standard Stereotaxic for Mice</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-9568</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Spinal Adaptor</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-4811</td><td></td></tr><tr><td>XYZ Manipulator</td><td>Stoelting</td><td>51604</td><td></td></tr><tr><td>Manual Infusion Pump</td><td>Stoelting</td><td>51218</td><td></td></tr><tr><td>34G Beveled Nanofill Needle</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF34BV-2</td><td></td></tr><tr><td>36G Blunt Nanofill needle</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF-36BL-2</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso, Isoflurane</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidine Solution</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>20G Stainless Steel Needle</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>23G Stainless Steel Needle</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>30G Stainless Steel Needle</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicator</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>27426</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillary Beveller&amp;nbsp;</td><td>Narishige International</td><td>SM-25B</td><td></td></tr><tr><td>Slide Microscope Superfrost</td><td>Leica Microsystems</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;mu;L Microsyringe&amp;nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>81242</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic PE-20 Tubing</td><td>Becton, Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic PE-10 Tubing</td><td>Becton, Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>4-0 monofilament suture</td><td>VetOne</td><td>V1D397</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillary Beveller&amp;nbsp;</td><td>Narishige</td><td>Pipet Micro Grinder EG-40&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>5 min Epoxy (Epoxy Clear)</td><td>Devcon</td><td>14310</td><td></td></tr><tr><td>Euthanasia Solution</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>11168</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Inj 1,000 U/mL</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>54254</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Anti NeuN Antibody</td><td>EMD-Millipore</td><td>ABN78</td><td>Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody</td><td>EMD-Millipore</td><td>AB144P</td><td>Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100</td></tr><tr><td>Anti GFP Antibody</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td>Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21207</td><td>Secondary Antibody, 1:1000</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10043</td><td>Secondary Antibody, 1:1000</td></tr><tr><td>Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Jackson Immunoresearch Labs</td><td>703-545-155</td><td>Secondary Antibody, 1:1000</td></tr><tr><td>Donkey Anti-Goat IgG H&amp;amp;L (Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150131</td><td>Secondary Antibody, 1:1000</td></tr><tr><td>Slide Microscope Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss AxioImager M2</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td>Olympus FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Polysciences, Inc</td><td>19411</td><td></td></tr><tr><td>AAV9-UBC-GFP</td><td>UCSD Viral Vector Core Laboratory</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

subpial adeno-associated virus 9 (aav9) vector delivery in adult mice

성인 래트 및 돼지에서 아포 - 관련 바이러스 9 (AAV9) 벡터 전달 기술의 성공적 개발이 이전에보고되었다. AAV9 전달을 위해 subpially-placed 폴리에틸렌 카테터 (PE-10 또는 PE-5)를 사용하여, subpially-injection 척추 분절에서 척수 실질 (흰색 및 회색 물질)를 통한 강력한 형질 도입 유전자 발현이 입증되었습니다. 신경 퇴행성 질환의 광범위한 형질 전환 마우스 모델 때문에 성인 마우스에서 강력한 중추 신경계 (CNS) 표적화 된 벡터 전달 기술의 개발에 대한 강한 열망이 있습니다. 따라서, 본 연구는 성인 C57BL / 6J 마우스에서 안전하고 효과적인 척추 AAV9 전달을 허용하는 척추의 서브 벡터 전달 장치 및 기술의 개발을 기술한다. 척추 고정 및 마취 마우스에서, 피임 장치 (자궁 경부 1 및 척추 1-2 척수 분절 수준)를 XYZ 조작기를 사용하여 날카로운 34G 바늘로 절개 하였다. 두 번째 XYZ manipulator는 그 다음에 둔감한 36G 바늘을 요추 및 / 또는 자궁 경부 지방 공간으로 전진시키는 데 사용되었습니다. 녹색 형광 단백질 (GFP)을 인코딩 AAV9 벡터 (3-5 μL, 1.2 X 10 13 게놈 복사 (gc)) subpially 다음 주입되었다. 주사 후, 신경 학적 기능 (운동 및 감각)을 주기적으로 평가하고, 4 % 파라 포름 알데히드로 AAV9 전달 후 동물을 관류 고정시켰다. 수평 또는 횡단 척수 절편의 분석은 회색 및 흰 물질 모두에서 전체 척수를 통한 전이 유전자 발현을 보였다. 또한, 심한 역행위 매개 GFP 발현은 운동 피질, 핵 ruber, 및 formio reticularis에 내림차순 모터 축삭과 뉴런에서 보였다. 어떤 동물에서도 신경 학적 장애는 관찰되지 않았다. 이 데이터는 대식 성 벡터 전달 기술이 프로 시저 관련 척수 손상을 일으키지 않으면 서 성숙한 생쥐에서 성공적으로 사용될 수 있고 매우 강력한 전이 유전자 발현과 관련이 있음을 보여줍니다척추 신경근을 통한 시온.

<html> 하위 AAV9 주사 분획에서의 강력한 전이 유전자 발현 : AAV9 전달 후 14 일째 척수 절편에서 transgene (GFP) 발현을 분석 한 결과, 척수 실질 전반에 AAV9- 의존성 GFP 발현이 나타났다. 첫째, 요추 하부 공간에 주입 된 AAV9-UBI-GFP의 2 회 양측 3 μL 주사는 전체 흉추 부위의 백색 및 회색 물질의 거의 완전한 감염과 연관되어 상부 흉부 분절까지 확장되었다 ( <strong...

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Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

본 연구의 목적은 성인 생쥐에서 새로운 subpial 유전자 전달 기술을 사용하여 척수 adeno-associated virus 9 (AAV9) 매개 유전자 전달의 효능과 안전성을 개발하고 검증하는 것이었다.

성인 쥐의 Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) 벡터 전달

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

subpial-adeno-associated-virus-9-aav9-vector-delivery-in-adult-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

17.4K 조회수.  University of California, San Diego.  본 연구의 목적은 성인 생쥐에서 새로운 subpial 유전자 전달 기술을 사용하여 척수 adeno-associated virus 9 (AAV9) 매개 유전자 전달의 효능과 안전성을 개발하고 검증하는 것이었다. 

비디오: Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation of gene functions. Their therapeutic potential in the heart can also be determined. There are limited approaches for in vivo molecular intervention in the mouse heart. Recombinant adeno-associated virus (rAAV)-based genome engineering has been utilized as an essential tool for in vivo cardiac gene manipulation. The specific advantages of this technology include high efficiency, high specificity, low genomic integration rate, minimal immunogenicity, and minimal pathogenicity. Here, a detailed procedure to construct, package, and purify the rAAV9 vectors is described. Subcutaneous injection of rAAV9 into neonatal pups results in robust expression or efficient knockdown of the gene(s) of interest in the mouse heart, but not in the liver and other tissues. Using the cardiac-specific TnnT2 promoter, high expression of GFP gene in the heart was obtained. Additionally, target mRNA was inhibited in the heart when a rAAV9-U6-shRNA was utilized. Working knowledge of rAAV9 technology may be useful for cardiovascular investigations.

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

마우스 마음에서 과발현하는 rAAV9의 제조 또는 최저 유전자

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

연구

유전학

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. In recent years, miRNA-mediated gene regulation has shown potential for treatment of neurological disorders caused by a toxic gain of function mechanism. However, efficient delivery to target tissues has limited its application. Here we used a transgenic mouse model for spinal and bulbar muscular atrophy (SBMA), a neuromuscular disease caused by polyglutamine expansion in the androgen receptor (AR), to test gene silencing by a newly identified AR-targeting miRNA, miR-298. We overexpressed miR-298 using a recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype 9 vector to facilitate transduction of non-dividing cells. A single tail-vein injection in SBMA mice induced sustained and widespread overexpression of miR-298 in skeletal muscle and motor neurons and resulted in amelioration of the neuromuscular phenotype in the mice.

Here we describe the delivery of microRNA using a recombinant adeno-associated virus serotype 9 in a mouse model of a neuromuscular disease. A single peripheral administration in mice resulted in sustained miRNA overexpression in muscle and motor neurons, providing an opportunity to study miRNA function and therapeutic potential in vivo.

설치류에 신경 근육 학 질병을 치료 하는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스 Serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한 체계적 전달

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Retrobulbar 주입 기법을 사용한 마우스의 효과적인 전신 전달

Systemic Treatment for Postnatal, Juvenile, and Runted Adult Mice by Retrobulbar Sinus Injection

While tail vein injections are frequently used as a systemic route of delivery in adult mice, retrobulbar injections are an alternative method for systemic delivery with fewer limitations. First, tail vein injections (TVIs) are limited to adult mice where the size of the tail vein is suitable for access. Being restricted to treating adult mice can be problematic when dealing with mouse models that do not survive to adulthood. Second, TVIs are not feasible for mouse models with growth retardation phenotypes where the mice never achieve the size of adult wildtype mice. Therefore, retrobulbar injections can be successfully used to treat both young and small adult mice. Lastly, retrobulbar injections are performed under anesthesia, which is less stressful on the mice than TVIs that are commonly performed without anesthesia. This article presents a protocol and detailed instructions for retrobulbar injections that can be used for systemic delivery to small and young mice.

저자 스포트라이트: 쥐 모델에서 후불 주사를 통한 유기산혈증 유전자 치료의 과제 극복

This article provides a protocol and an accompanying video for the retrobulbar sinus injection of up to a total volume of 150 &#181;L for postnatal, juvenile, and runted adult mice. This procedure is particularly well suited for the injection of small mice (15 g) when tail vein injection is not feasible.

Retrobulbar Sinus 주사에 의한 출생 후, 청소년 및 Runted 성인 마우스에 대한 체계적인 치료

While tail vein injections are frequently used as a systemic route of delivery in adult mice, retrobulbar injections are an alternative method for ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), optogenetics, cre-lox targeting, etc. The purpose of this manuscript is to aid the investigator attempting expansive central nervous system (CNS) gene transfer in the rat via tail vein injection of AAV. Wide-scale expression is relevant for conditions with widespread pathology, and a rat model is significant due to its greater size and physiologic similarities to humans compared to mice. In this example application, a wide-scale neuronal transduction is used to mimic a neurodegenerative disease that affects the entire spinal cord, amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The efficient wide-scale CNS transduction can also be used to deliver therapeutic protein factors in pre-clinical studies. After a post-injection expression interval of several weeks, the effects of the transduction are evaluated. For a green fluorescent protein (GFP) control vector, the amount of GFP in the cerebellum is estimated quickly and reliably by a basic imaging program. For motor disease phenotypes that are induced by the ALS related protein transactive response DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43), the deficits are scored by escape reflex and rotarod. Beyond disease modeling and gene therapy, there are diverse potential applications for the wide-scale gene targeting described here. The expanded use of this method will aid in expediting hypothesis testing in the neurosciences and neurogenetics.

Methods for a wide-scale central nervous system gene delivery in the rat are covered. In this example, the purpose is to mimic a disease that affects the entire spinal cord. The widespread transduction can be used to deliver a therapeutic protein to the CNS from a one-time, peripheral administration.

메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

신경과학

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, and excellent transduction efficacy in the CNS.&#160;Previous studies have demonstrated the therapeutic potency of AAV-delivered gene therapy in neurodegenerative disorders by IT administration. However, high rates of unpredictable failure due to the technical limitation of IT administration in small animals have been reported. Here, we established a scoring system to indicate the success extent of lumbar puncture in small animals by adding 1% lidocaine hydrochloride into the injection solution. We further show that the extent of transient weakness following injection can predict the transduction efficiency of AAV. Thus, this IT injection method can be used to optimize therapeutic trials in mouse models of CNS diseases that afflict wide regions of the CNS.

Here we present a direct intrathecal injection technique using 1% lidocaine hydrochloride in a viral solution to ensure efficient adeno-associated virus delivery to small animals and establish a scoring system to predict transduction efficiency in the central nervous system according to the degree of transient weakness induced by lidocaine.

성인 쥐에 있는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스의 직접 Intrathecal 주입

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Subconjunctival Administration of Adeno-associated Virus Vectors in Small Animal Models

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ease of accessibility via multiple administration routes. Subconjunctival (SCJ) injections offer advantages over other intraocular administration routes as they are simple, safe, and usually performed in an outpatient setting. SCJ injections in small animals usually require the assistance of an operating microscope due to the size of the eye. Previous work has demonstrated that SCJ injection of specific adeno-associated virus (AAV) serotypes is a valid gene delivery strategy for targeted transduction of the ocular surface, eye muscle, cornea, and optic nerve, providing a potential approach for the treatment of many ocular diseases.
Herein, a detailed protocol is presented for SCJ injections in a mouse model using an injection system consisting of a programmable infusion/withdrawal syringe pump (which allows for consistent and precise injection speed and pressure) and a gastight removable syringe coupled with microinjection needles. The injection system is also adaptable for other intraocular administration routes such as intrastromal, intracameral, intravitreal, and subretinal injections in small animals. Although the delivery of adeno-associated viral vectors for ocular gene therapy studies is described, the protocol herein can also be adapted for a variety of ophthalmic solutions in small animal models. The key practical steps in the administration route, setup for the injection platform, preparation of the injection, and tips from direct experience will be discussed in detail. In addition, common validation techniques for AAV delivery confirmation to the desired tissues will also be briefly discussed.

In this manuscript, subconjunctival injection is demonstrated as a valid vector delivery method for ocular tissues in mice using an injection system consisting of an infusion/withdrawal syringe pump and a gastight removable syringe coupled with microinjection needles. This injection system is also adaptable for other intraocular administration routes.

작은 동물 모델에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 결막하 투여

Ocular diseases include a wide range of inherited genetic and acquired disorders that are appealing targets for local drug delivery due to their relative ...

의학

CNS 유전자 치료를 위한 어린 쥐에서 AAV9의 요추 천자 전달

Intrathecal Vector Delivery in Juvenile Rats via Lumbar Cistern Injection

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a toxic gene, or provide a gene whose product can modulate the biology of the disease. The delivery method for the therapeutic vector can take many forms, ranging from intravenous infusion for systemic delivery to direct injection into the target tissue. For neurodegenerative disorders, it is often desirable to skew transduction towards the brain and/or spinal cord. The least invasive approach to target the entire central nervous system involves injection into the cerebrospinal fluid (CSF), allowing the therapeutic to reach a large fraction of the central nervous system. The safest approach to deliver a vector into the CSF is the lumbar intrathecal injection, where a needle is introduced into the lumbar cistern of the spinal cord. This technique, also known as a lumbar puncture, has been widely used in neonatal and adult rodents and in large animal models. While the technique is similar across species and developmental stages, subtle differences in size, structure, and elasticity of tissues surrounding the intrathecal space require accommodations in the approach. This article describes a method for performing lumbar puncture in juvenile rats to deliver an adeno-associated serotype 9 vector. Here, 25-35 &#181;L of vector were injected into the lumbar cistern, and a green fluorescent protein (GFP) reporter was used to evaluate the transduction profile resulting from each injection. The benefits and challenges of this approach are discussed.

저자 스포트라이트: Assessing Intrathecal Gene Therapy Effect in Juvenile Rats

A surgical procedure is described to perform injections into the lumbar cistern of the juvenile rat. This approach has been used for the intrathecal delivery of gene therapy vectors, but it is anticipated that this approach can be used for a variety of therapeutics, including cells and drugs.

Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection(요추 수조 주입을 통한 어린 쥐의 척수강내 벡터 전달)

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a ...

성인 쥐의 Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) 벡터 전달

요약

더 많은 비디오 탐색

마우스 마음에서 과발현하는 rAAV9의 제조 또는 최저 유전자

설치류에 신경 근육 학 질병을 치료 하는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스 Serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한 체계적 전달

Retrobulbar Sinus 주사에 의한 출생 후, 청소년 및 Runted 성인 마우스에 대한 체계적인 치료

Retrobulbar Sinus 주사에 의한 출생 후, 청소년 및 Runted 성인 마우스에 대한 체계적인 치료

Retrobulbar Sinus 주사에 의한 출생 후, 청소년 및 Runted 성인 마우스에 대한 체계적인 치료

메서드 및 Adeno 관련 바이러스를 쥐의 정 맥 관리 및 중앙 신경 전달의 평가 대 한 팁

성인 쥐에 있는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스의 직접 Intrathecal 주입

생산, 정화, 및 Adeno 관련 바이러스 기반 벡터에 대 한 품질 관리

작은 동물 모델에서 아데노 관련 바이러스 벡터의 결막하 투여

Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection(요추 수조 주입을 통한 어린 쥐의 척수강내 벡터 전달)