Name: developing hipsc derived serum free embryoid bodies for the interrogation of 3-d stem cell cultures using physiologically relevant assays
Uploaded: 2017-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
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기사를 교정 해 주신 Elizabeth Benevides에게 감사드립니다. 우리는 Drs. John Hussman과 Gene Blatt가 도움이되는 토론과 의견을 전했습니다.

1. 신경 전구 세포의 생성 <ol><li> 저분자가 보충 된 인간 iPSC 배지에서 γ- 조사 마우스 배아 피더 (MEF) 세포층상의 6 웰 플레이트에서 섬유 아세포 및 PBMC로부터 유래 된 hiPSC를 유지한다 (물질 표 참조). 참고 : 매일 유지 보수는 이전에보고 절차 (1), (16)의 수정 된 버전입니다. <ol><li> 플레이트 300 μL / 잘 권장 매체 (제조 업체의 프로토콜에 따라)에 6 잘 조직 문화 등급 플레이트의 각 우물에 플레이트 6 X 10 5 MEFs. </li><li> 48 시간 후, hiPSCs를 첨가하기 전에 MEFs 배지를 300μL / 웰 hiPSC 배지로 1 시간 동안 대체한다. </li><li> 37 ° C 수조에서 hiPSC를 빠르게 녹이고 천천히 1 mL의 hiPSC 배지를 적가한다. hiPSCs와 매체를 15 mL 원추형 튜브로 옮긴다. 총 부피가 5 mL가되도록 매체를 넣으십시오. 129 X에서 4 분 동안 원심 분리기, supernata을 대기음1 : 1,000 농도에서 ROCK 억제제가있는 1 mL hiPSC 배지에서 펠렛을 부드럽게 재현 탁하십시오. </li><li> 플레이트를 세포 현탁액 (일반적으로 300,000 세포 / 잘시) MEF 세포 레이어와 37 ° C, 5 % CO 2 , 95 %의 습도에서 품어. </li><li> 광학 현미경을 사용하여 iPSC 배양을 면밀히 모니터링하십시오. 48 시간 후, 가장자리가 고르지 않은 배양 물을 제거하고, 광학 현미경 하에서 낭성과 같은 형태 또는 황갈색의 형태로 자라서 자발적 분화를 최소화한다. 참고 : 7-10 일 후, hiPSC 콜로니가 형성되어야합니다. 식민지는 경계가 명확하고 세포 밀도가 균일해야하며 둥근 모양이어야하며 느슨하게 포장 된 불균일 한 세포가 없어야합니다. </li><li> 자발적으로 분화 된 세포의 문화를 취소 라운드 hiPSC의 식민지를 수동으로 선택합니다. 새 MEF 층에 식민지를 놓습니다. 콩쿠리 근처에있는 배양액이 얼어 붙을 때마다 1 : 3 간격으로 펼쳐보십시오 ( 1 , 16) . </li></ol></li><li> 확장 및 냉동 세포 (백업을위한) 후 50-75 % 합류에 도달 할 때까지 플레이트에 hiPSC 식민지를 자랍니다. </li><li> 7 일 후 도금 후, 신경 전구 세포 분화를위한 hiPSCs를 수확하고 준비하기 위해 온화한 효소 처리 (효소 용액 300 μL로 5-10 분) 및 부드러운 분쇄 (1,000 μL 피펫으로 2-4 회)를 사용하십시오. </li><li> 세포 현탁액을 129 xg에서 4 분간 원심 분리하고, 상층 액을 흡인하고, 5 mL 인간 iPSC 배지에서 펠렛을 재현 탁한다. 37 ° C에서 1 시간 동안 0.1 % 젤라틴 코팅 5cm 세포 배양 접시에 세포 현탁액을 옮기고 MEFs를 제거하고 hiPSC 수율을 최대화합니다. 다른 5cm 젤라틴 코팅 접시로 매체 (비 부착 세포)를 전송하십시오. </li><li> 전송 피펫을 사용하여 15 ML 원심 분리기 튜브에 비 접착 세포를 전송합니다. 부드럽게 3 ML 매체와 플레이트를 씻어 15 ML 튜브에 추가하십시오. </li><li> 4 분 동안 129 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기, 대기음을 대기음원심 분리하고 부드럽게 매체에 펠렛을 resuspend. 자동 셀 카운터를 사용하여 세포 수를 결정하십시오. 96- 웰 저 밀착 V- 바닥 플레이트에 9,000 세포 / 웰 플레이트. </li><li> 플레이트를 163 xg에서 3 분간 원심 분리하십시오. 37 ° C, 95 % 습도 및 5 % CO 2 에서 플레이트를 품어. 피펫을 사용하여 배지의 절반을 제거하고이를 화학적으로 정의 된 새로운 분화 배지 1 (DM1; Figure 1 ; Table of Materials) 로 14 일 동안 대체하여 매일 50 % 배지를 교환하십시오. </li></ol> 2. 무 혈청 배아 체 (SFEB) 유도 ( 그림 2 ) <ol><li> 6 잘 접시에 삽입 40 μm의 세포 배양 삽입 및 집계의 추가 적어도 1 시간 전에 1 ML DM1 매체를 추가합니다. </li><li> 14 일째, 40 μm의 세포 배양 삽입물에 200 μL 넓은 입 끝을 사용하여 20 μL 배지로 응집체를 옮기고 배지를 DM2로 바꿉니다. <br/&gt; 참고 : 세포 배양 삽입물은 우물 바닥에서 약간 떨어져서 플라스틱 프레임을 가로 질러 매달려있는 폴리 테트라 플루오르 에틸렌 막으로 구성되어 있습니다. 이 멤브레인은 생체 적합성을 지니고 있으며 상단에 놓인 SFEB로 영양분과 산소 전달을 효율적으로 유지할 수 있습니다. 그들은 일반적으로 마우스 또는 쥐 7 , 17 , 18 에서 촬영 organotypic hippocampal 슬라이스 문화와 함께 사용됩니다. <ol><li> 하나의 세포 배양 삽입물에 4-6 개의 응집체를 옮기고 응집체 사이에 충분한 공간을 확보하십시오. 미세 피펫 팁 ( 예 : 200 μL 팁)을 사용하여 최대한 많은 과량의 용액을 제거하십시오. 참고 : SFEB 주위에서 제거 된 용액으로 세포 배양 삽입물을 움직일 때 SFEB를 잠시 방해하는 것은 허용됩니다. </li><li> 37 ° C, 95 % 습도 및 5 % CO 2 DM2 1 ML에서 문화를 유지. 피펫을 사용하여 75 %매체의 3/4을 제거하고 4 분의 3의 새로운 매체로 교체하여 격일로 배지. 예를 들어, 750 μL의 배지를 제거하고 750 μL의 새로운 배지를 첨가하십시오. </li></ol></li><li> 문화의 14 일 후, 다른 하루와 다른 16 일 동안 75 % 매체 변화와 DM3 매체로 전환합니다. </li><li> 30 일이 넘는 세포 배양 삽입물에 SFEB를 유지하려면 60, 90 및 120 일 동안 배지를 매일 교체하십시오. 참고 : SFEB는 직경이 약 1,000 μm까지 성장하며 일반적으로 100-150 μm 두께입니다 1 . </li></ol> 3. SFEB 구성 결정 <ol><li> 200 μL 와이드 입 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 매체를 pipetting하여 삽입에서 SFEBs를 분리하십시오. SFEB를 옮기려면 넓은 입 피펫 팁을 사용하여 몸체를 피펫 팁으로 부드럽게 흡입하십시오. SFEB를 pipet tip에 넣은 후 부드럽게 12-well plates에 옮기고 300μL phosphate buffered saline(PBS)로 1 웰당. 참고 : SFEB는 12- 웰 플레이트에서 용액으로 현탁 될 것이다. 고정액, 블로킹 용액 및 항체를 완전히 침투시키는 것이 중요합니다. 얼룩을지게하기 위해 여러 개의 SFEB를 사용하는 경우, 12 개의 웰 플레이트에 최대 10 개의 SFEB를 추가 할 수 있습니다. 이렇게하면 용액과 항체가 보존됩니다. </li><li> 30 ~ 45 분 동안 상온에서 4 % 파라 포름 알데히드 당 300 μL로 SFEB를 고정시킨다. 300μL PBS로 고정 SFEB를 두 번 씻고 3-5 분마다 씻으십시오. 주의 : 파라 포름 알데히드를 취급 할 때는 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 참고 : 표 2 참조 1, 16를 참조하십시오 추가 마커, 500 : 닭 Tuj1 1에서 사용 된이 연구에서 신경 세포를 마킹 성숙, 세포 유형 등을 결정하기 위해 마커로 면역 반응에 대한 조사. </li><li> 0.1 % Triton-X100 (PBS 및 10 % 정상적인 당나라 세럼) (blocking solution; 300 μL)로 실온에서 1 시간 동안 처리 하였다. </li><li> 차단 용액을 제거하고 차단 용액에서 1 차 항체 300 μL로 SFEB를 처리하십시오. 4 ° C에서 밤새 품어 둡니다. 0.1 % 트리톤 X를 함유 한 300 μL PBS로 SFEB를 세 번 세척 (3-5 분 / 세척)하십시오. </li><li> 2 차 항체를 블로킹 용액에 1 : 1000으로 준비한다. 2 차 항체와 실온에서 1 시간 SFEBs를 품어. SFEB를 300 μL PBS로 3 ~ 5 분씩 각각 씻으십시오. 참고 :이 단계에서 SFEB는 이미징을 준비 할 수 있습니다. </li><li> 이미지하려면, 와이드 보어 피펫을 사용하여 슬라이드 슬라이드에 피펫 SFEBs. 부드러운 흡입을 사용하여 SFEB 주변의 과도한 용액을 제거하십시오. 참고 : 유사한 염색 조건의 경우 여러 SFEB를 동일한 유리 슬라이드에 둘 수 있습니다. </li><li> SFEB에 장착 매체 한 방울을 넣고 유리 커버 슬립을 놓고 가볍게 눌러 기포가 없는지 확인하십시오. 장착 매체를 굳히고 이미징 및 부량 화 (단계 3.8)로 진행하십시오. <br/&gt; 참고 : 장착 매체가 단단 해지면 SFEB를 이미징 할 수 있습니다. </li><li> 표준 공 촛점 현미경 (standard confocal microscope)에서 각 ROI를 통해 최대 투영 이미지와 결합 된 z- 스택을 사용하여 SFEB에서 여러 관심 영역 (ROI)을 가져 와서 참고 1 , 16에 설명 된대로 세포 정량화를 수행하십시오. 참고 : 전체 SFEB는 이미지 기반 타일링을 사용하여 정량화 할 수 있습니다 (자세한 내용은 참조 1 , 16 참조). SFEB가 약 100 μm로 얇기 때문에 조직에 빛의 산란이 최소화되므로 2- 광자 현미경 검사가 필요하지 않습니다. 섬유 아세포 유래 iPSCs 프로토콜이 이전 사용은 CGE 및 전방 전뇌 운명 1 16 닮은 전사 정체성의 interneurons의 개체군과 복잡하고 다양한 구조를 드러냈다 SFEB 운명 맵을 생성. </sup&gt; </li></ol> 4. MEAs를 사용하여 SFEBs의 연결 활동을 기록 <ol><li> 제조 업체의 지침에 따라 12 잘 MEA 플레이트를 준비합니다. </li><li> 무균 조건 하에서 2 O 깨끗하게 멸균 H 5 분간 MEA 플레이트를 3 회 반복한다. 75 % 에탄올로 5 분간 씻은 다음 100 % 에탄올로 세척하여 플레이트를 멸균하십시오. </li><li> 50 ° C에서 4 ~ 5 시간 동안 오븐에서 접시를 거꾸로 굽혀 살균 과정을 완료하십시오. </li><li> 각 우물에 500 μL 0.2 % polyethyleneimine 솔루션 (PEI)을 추가하고 실온에서 1 시간 품어. PEI를 대기음으로 멸균 증류수 H 2 O로 4 번 씻으십시오. </li><li> L15 배지에 laminin 20 μL / ML 솔루션을 준비하고 각 우물의 중심에 10 μL laminin를 추가합니다. 참고 : 주변 참조 및 접지 전극을 코팅하지 마십시오. </li><li> 매체 또는 라미닌 증발을 방지하기 위해 주변 저수지에 멸균 dH 2 O를 추가하십시오.37 ° C에서 1 시간 동안 플레이트를 품어 라. </li><li> 부드럽게 그들을 넓은 입 피펫 팁으로 흡입하여 그들을 전송하여 laminin 코팅 MEA 플레이트에 SFEBs (섹션 1 및 2 참조)를 추가하고 그들을 전송합니다. 각 우물에 200 μL DM2 매체를 추가하고 37 ° C, 95 % 습도 및 5 % CO 2 에서 밤새 품어. </li><li> 24 시간 후에 추가로 200 μL 매체를 추가하고, 플레이트를 읽기 전에 37 ° C, 95 % 습도, 5 % CO 2에서 30 분 동안 회복 할 수있다. </li><li> MEA 플레이트를 플레이트 판독기 (37 ° C로 예열 됨)에 놓아서 연결 활동을 기록하십시오. 관련 MEA 레코딩 소프트웨어로 10 분 동안 활동을 기록하십시오. 자세한 내용은 참조 19 를 참조하십시오. </li><li> 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터 - 연속 스트림 및 연결 활동의 래스터 도표를 생성합니다 19 . 참고 : MEA 녹음은 SFEB 도금 7 일 후 촬영됩니다. 이 연구에서는 네트워크 버스트 활동을 감지하기 위해 10 분 동안 녹화를 수행했으며,뾰족한 자취 및 래스터 플롯이 있습니다. SFEB는 MEA 플레이트에서 장기간 유지 될 수 있으며 환경 적으로 통제 된 조건을 사용하여 장기간에 걸쳐 기록 될 수 있습니다 ( 그림 6 ). </li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells.">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).</li><li>Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+embryoid+bodies+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+means+to+assess+pluripotency.">Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency.</a> Stem Cells Int. , 738910 (2012).</li><li>Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochasticity+and+Spatial+Interaction+Govern+Stem+Cell+Differentiation+Dynamics.">Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics.</a> Sci Rep. 5, 12617 (2015).</li></ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없습니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 hiPSC 소스를 정면 피질의 초기 발달 단계를 반복하는 3 차원 구조로 차별화하기위한 조건을 제공합니다. 이 절차는 전기 생리학에 대해 조사 할 수있는 구조를 만들어내는 동시에 현미경 검사를 받아 들일 수 있습니다. SFEB의 최종 형태는 organotypic 두뇌 슬라이스 문화의 그것과 유사하고 고품질의 상세한 공 촛점 이미징을 허용합니다. 이 프로토콜은 fibroblast 및 말초 혈?...

우리는 이전에 초기 대뇌 피질의 네트워크 개발 1의 일부 측면을 되풀이되었습니다 환자 유래 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)에서 생성 된 3-D 모델 시스템을보고했다. 혈청없는 배아 체 (SFEB) 인이 3-D 모델은 이전의 단순 응집 hiPSC 모델 2 , 3을 향상시킵니다. 우리의 SFEB와 같은 3D 구조가 2 차원 (2-D) / 단일 층 hiPSC 모델 4 , 5 에서 관찰 된 것보다 더 일찍 생체 내 에서 관찰 된 신경 발달의 대략적인 양상을 드러내고있다. 초기 연구는 생리 학적 복잡성을 입증하지 않고 3 차원 신체의 자기 조직화 복잡성에 초점을 두었습니다 2 . 여기에 설명 된 프로토콜은 섬유 아세포에서 유래 undifferentiated hiPSCs에 사용되었습니다<html> 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC). 이 세포는 γ 선발 마우스 배아 기 (MEFs)에서 유지됩니다. 이러한 hiPSC 콜로니를 자발적으로 분화 된 세포에서 수동으로 세척하고, 효소 적으로 수확하고, Rho 키나제 억제제 Y-27632 (ROCKi)를 함유하는 배지에 재현 탁한다. 미분화 hiPSC는 96 웰 저 접착 V 바닥 플레이트로 옮기기 전에 해리 및 원심 분리를 거친다. 도금 후, 앞쪽 전두엽의 뇌신경 - 운명 계통 6 을 구동하기 위해 이중 SMAD 억제 (dickkopf 1 (DKK-1)와 함께 SB431542 및 LDN193189)를 사용하여 신경 유도를 개시한다. 14 일 후, SFEB는 6- 웰 플레이트의 세포 배양 삽입물로 옮겨진다. 전달 된 라운드 SFEBs는 유사한 세포 배양 삽입물 1 , 2 , 3을 사용하여 해마 기관 체적 슬라이스 배양 조제 물에서 종종 관찰되는 바와 같이 국부적 인 네트워크 연결을 유지하면서 퍼지고 얇아지기 시작한다 .ss = &quot;xref&quot;&gt; 7. 이 형식의 SFEB 기반 3-D 플랫폼의 사용은 단일 세포 기록 또는 다중 전극 배열 (MEA)과 같은 칼슘 이미징 또는 전기 생리 학적 분석과 같은 세포 기반 생리 학적 분석을 사용하여 조사 할 수있는 대뇌 피질 네트워크의 효율적 생산에 적합합니다 ) 1 . 3-D 시스템이 초기 피질 발달 지표를 지니고 있지만, 다른 연구들에 의하면 이러한 3-D 몸체는 본질적으로 인간 조직 발달 속도가 느려지도록 더 긴 배양 시간을 필요로 할 수 있습니다 8 . 이 SFEB 프로토콜은 피질의 초기 발달 양상을 파악하는 미분화 된 hiPSC로부터 3 차원 SFEB를 성공적으로 생성합니다. SFEB가 신경계 장애에서 네트워크 수차를 모델링 할 수있는 가능성은이 시스템의 강점입니다. 환자 조직으로부터 유래 된 hiPSCs는 엉덩이에 영향을받는 신경계의 세포로 성장할 수있다세포 생물학뿐만 아니라 수반되는 유전자 발현과 관련이있다. 인간 iPSCs은 자폐증 스펙트럼 장애 (ASD), 정신 분열증 9 레트 증후군 (10), 및 알츠하이머 병 (11), (12) 복소 병인으로 신경계 장애를 변화와 개인의 큰 그룹의 유전 적 프로파일을 확인하기 위해 사용되고있다. 최근까지 iPSC 모델은 전형적으로 분자 상호 작용을 평가하는 데 능숙한 반면 생체 내에서 관찰 되는 복잡한 세포 상호 작용을 해독하는 데는 부적합한 단일 층 준비물이었습니다. 동물 모델은 전체 기관 플랫폼을 재생성하기위한 기본 대체품이었습니다. 이 동물 모델은 결과의 빈약 한 번역에 의해 괴롭혀지고, 대규모 유전 스크리닝 연구에 의해 확인 된 인간 유전 프로파일을 복제하는 능력이 제한되어있다. 따라서, iPSC로부터 3-D 시스템을 개발하면 인간에게 필요한 복잡성 계층이 추가됩니다질병 모델링 13 , 14 . 3D hiPSC 플랫폼 다음 단계는 세포 기반 분석법을 이용하여 스크리닝 15 처리량의 큰 규모의 요구 사항을 수용하기위한 것이다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>0-5835</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)</td><td>GlobalStem</td><td>GSM-2001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DM1 Media Components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1</td><td>Invitrogen</td><td>10565018</td><td>385 mL</td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>20% 100 mL</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td>900 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DM2 Media Components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1</td><td>Invitrogen</td><td>10565018</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x), liquid</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DM3 Media Components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEUROBASAL Medium (1x), liquid</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Small Molecules&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010-10</td><td>1:1,000 (10 &amp;mu;M)</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Stemgent</td><td>04-0024</td><td>1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074-10</td><td>250 nM</td></tr><tr><td>Y27632 (ROCKi)</td><td>Stemgent</td><td>04-0012-10</td><td>10 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Recombinant Protiens&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DKK-1</td><td>Peprotech</td><td>120-30</td><td>200 ng/mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Components/Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture inserts 0.4 &amp;mu;M, 30mm Diameter</td><td>Millicell</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6301G</td><td></td></tr><tr><td>96 well V bottom w/Lids</td><td>Evergreen</td><td>222-8031-01V</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>ThermoFisher</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Labs</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15 Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>11415114</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>DRAQ5 (Nuclear Marker)</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0880-96</td><td></td></tr><tr><td>MEA Plates</td><td>Axion Biosystems</td><td>M768-GL1-30Pt200</td><td></td></tr><tr><td>6 well flat bottom</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibody&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td></td></tr><tr><td>Brn-2</td><td>Protein tech</td><td>14596-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>VGLUT1</td><td>Synaptic Systems</td><td>135 303</td><td></td></tr><tr><td>Pax6</td><td>abcam</td><td>ab5790</td><td></td></tr><tr><td>Calretinin</td><td>abcam</td><td>ab702</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin</td><td>abcam</td><td>ab11426</td><td></td></tr><tr><td>CoupTFII</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>PPH714700</td><td></td></tr><tr><td>Nkx 2.1</td><td>abcam</td><td>ab12650</td><td></td></tr><tr><td>Tuj1</td><td>abcam</td><td>ab41489</td><td></td></tr><tr><td>Reelin</td><td>Millipore</td><td>MAB5364</td><td></td></tr><tr><td>Tbr1</td><td>Millipore</td><td>MAB2261</td><td></td></tr><tr><td>NFH</td><td>Dako</td><td>M0762</td><td></td></tr></tbody></table>

developing hipsc derived serum free embryoid bodies for the interrogation of 3-d stem cell cultures using physiologically relevant assays

많은 in vitro 질병 모델이 hiPSCs를 사용하여 개발되었지만, 한 가지 제한점은 이러한 2 차원 (2-D) 시스템이 의심되는 질병 변이를 가진 감염된 개인의 기본 세포질 및 기능적 복잡성을 나타내지 않을 수 있다는 것입니다. 기존의 2D 모델은 생체 내 유사 구조의 불완전한 표현으로 남아 있으며 뇌의 복잡성을 적절히 포착하지 못합니다. 따라서, 생체 내 시스템 에서 보이는 세포 상호 작용 및 기능을보다 잘 나타낼 수있는 3-D hiPSC- 기반 모델에 대한 필요성이 대두되고있다. 여기서는 무 혈청 배아 체 (SFEB)에 기초한 미분화 된 hiPSCs로부터 3-D 시스템을 개발하기위한 프로토콜을보고한다. 이 3-D 모델은 발달중인 신피질의 양상을 반영하고, 이동하는 신경 세포 및 이동성, 연결성, 통신 및 매트와 같은 손상되지 않은 조직에 필수적인 기능에 대한 연구를 허용합니다uration. 특히 우리는 우리의 프로토콜을 사용하는 SFEB가 칼슘 이미징과 같은 생리 학적으로 관련성이 높은 고농축 세포 기반 분석법 및 cryosectioning없는 다중 전극 배열 (MEA) 기록을 사용하여 조사 될 수 있음을 입증합니다. MEA 기록의 경우, 우리는 SFEB가 장기간 배양하는 동안 스파이크 활동과 네트워크 수준 파열 활동을 증가 시킨다는 것을 입증합니다. 이 SFEB 프로토콜은 초기 대뇌 피질 발달의 양상을 포착하는 3-D 모델에서 네트워크 형성을 개발하는 연구를위한 견고하고 확장 가능한 시스템을 제공합니다.

우리의 기술을 사용하여 성장한 SFEBs는 초기 Tuj1 양성 뉴런뿐만 아니라 신경 progenitors ( 그림 3A ) 가득한 초기 개발 피질 subventricular 영역을 닮은 형태학 특성과 조직을 굴복. SFEB ( 그림 3B )의 바깥 쪽 층과 내부 층에는 수 많은 발육 피질 로제가 관찰되었습니다. SFEB의 바깥 쪽 가장자리는 퇴행 후 뉴런을 포함하는 발달중인 피질 ...

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Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

여기 우리는 무 혈청 배아 체 (SFEB)라고 불리는 인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)로부터 3 차원 (3-D) 시스템을 개발하기위한 프로토콜을보고합니다. 이 3-D 모델은 인간 피질 발달을 모델로하고 신경 회로를 개발하는 생리 학적 심문을 위해 장기 유형의 슬라이스 문화처럼 사용될 수 있습니다.

생리 학적으로 적합한 분석법을 사용하여 3 차원 줄기 세포 배양 물의 심문을위한 HiPSC 파생 혈청 무 세포 배아 체 개발

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

developing-hipsc-derived-serum-free-embryoid-bodies-for-interrogation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K 조회수.  The Hussman Institute for Autism.  여기 우리는 무 혈청 배아 체 (SFEB)라고 불리는 인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)로부터 3 차원 (3-D) 시스템을 개발하기위한 프로토콜을보고합니다. 이 3-D 모델은 인간 피질 발달을 모델로하고 신경 회로를 개발하는 생리 학적 심문을 위해 장기 유형의 슬라이스 문화처럼 사용될 수 있습니다. 

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Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

3D 섬유소의 준비는 줄기 세포 배양 용도 공사장 공중 발판

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

연구

생체공학

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

다능성 줄기 세포에서 3차원 인간 간구의 혈청 무료 생산

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

발생학

2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older centriole during the G1/G0 phase of the cell cycle, while they disassemble as the cells re-enter the cell cycle at the G2/M phase boundary. They function as signal hubs, by detecting and transducing extracellular signals crucial for many cell processes. Similar to most cell types, all neocortical neural stem and progenitor cells (NSPCs) have been shown harboring a PC allowing them to sense and transduce specific signals required for the normal cerebral cortical development. Here, we provide detailed protocols to generate and characterize two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cell-based models from human induced pluripotent stem cells (hIPSCs) to further dissect the involvement of PC during neocortical development. In particular, we present protocols to study the PC biogenesis and function in 2D neural rosette-derived NSPCs including the transduction of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway. To take advantage of the three-dimensional (3D) organization of cerebral organoids, we describe a simple method for 3D imaging of in toto immunostained cerebral organoids. After optical clearing, rapid acquisition of entire organoids allows detection of both centrosomes and PC on neocortical progenitors and neurons of the whole organoid. Finally, we detail the procedure for immunostaining and clearing of thick free-floating organoid sections preserving a significant degree of 3D spatial information and allowing for the high-resolution acquisition required for the detailed qualitative and quantitative analysis of PC biogenesis and function.

We present detailed protocols for the generation and characterization of 2D and 3D human induced pluripotent stem cell (hIPSC)-based models of neocortical development as well as complementary methodologies enabling qualitative and quantitative analysis of primary cilium (PC) biogenesis and function.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older ...

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell cultures. The clinostat mimics an environment where cells can assemble as highly reproducible spheroids with low shear forces and active nutrient diffusion. We demonstrate that both cancer and non-cancer hepatocytes (HepG2/C3A and THLE-3 cell lines) require 3 weeks of growth prior to achieving functionalities comparable to liver cells. This protocol highlights the convenience of utilizing incubators for 3D cells with cameras monitoring the cell growth, as snapshots can be taken to count and measure spheroids upon treatment. We describe the comparison of THLE-3 and HepG2/C3A cell lines, showing how non-cancerous cell lines can be grown as well as immortalized cancer cells. We demonstrate and illustrate how proteomics experiments can be conducted from a few spheroids, which can be collected without perturbing cell signaling, i.e., no trypsinization required. We show that proteomics analysis can be used to monitor the typical liver phenotype of respiratory chain metabolism and the production of proteins involved in metal detoxification and describe a semi-automated system to count and measure the spheroid's area. Altogether, the protocol presents a toolbox that comprises a phenotypic characterization via image capture and a proteomics pipeline to experiment on 3D cell culture models.

We present a protocol for growing high-reproducible spheroids and their phenotypic characterization using image capture and proteomics.

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

생화학

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

폴 리 비닐 알코올-Co-Itaconic 산 Hydrogels 이종 없는 조건 하에서 다양 한 강성에 인간의 Pluripotent 줄기 세포 문화

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

조직 수준 역학을 제어하기 위해 준수 기판에 인간 배아 줄기 세포 식민지의 기하학적 패터닝

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We recently published a cost-effective strategy for the massive expansion of hiPSC-CMs in two dimensions (2D). Two major limitations are cell immaturity and a lack of three-dimensional (3D) arrangement and scalability in high-throughput screening (HTS) platforms. To overcome these limitations, the expanded cardiomyocytes form an ideal cell source for the generation of 3D cardiac cell culture and tissue engineering techniques. The latter holds great potential in the cardiovascular field, providing more advanced and physiologically relevant HTS. Here, we describe an HTS-compatible workflow with easy scalability for the generation, maintenance, and optical analysis of cardiac spheroids (CSs) in a 96-well-format. These small CSs are essential to fill the gap present in current in vitro disease models and/or generation for 3D tissue engineering platforms. The CSs present a highly structured morphology, size, and cellular composition. Furthermore, hiPSC-CMs cultured as CSs display increased maturation and several functional features of the human heart, such as spontaneous calcium handling and contractile activity. By automatization of the complete workflow, from the generation of CSs to functional analysis, we increase intra- and inter-batch reproducibility as demonstrated by high-throughput (HT) imaging and calcium handling analysis. The described protocol allows modeling of cardiac diseases and assessing drug/therapeutic effects at the single-cell level within a complex 3D cell environment in a fully automated HTS workflow. In addition, the study describes a straightforward procedure for long-term preservation and biobanking of whole-spheroids, thereby providing researchers the opportunity to create next-generation functional tissue storage. HTS combined with long-term storage will substantially contribute to translational research in a wide range of areas, including drug discovery and testing, regenerative medicine, and the development of personalized therapies.

Presented here is a set of protocols for the generation and cryopreservation of cardiac spheroids (CSs) from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured in a high-throughput, multidimensional format. This three-dimensional model functions as a robust platform for disease modeling, high-throughput screenings, and maintains its functionality after cryopreservation.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심장 스페로이드의 생성, 고처리량 스크리닝 및 바이오뱅킹

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

무 혈청 전체 배아 배양 시스템에서 마우스 배아 개발

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

생물학

iPSC에서 효율적인 인간 장 오가노이드 생성을 위한 매트릭스 비교

Comparative Study of Basement-Membrane Matrices for Human Stem Cell Maintenance and Intestinal Organoid Generation

Extracellular matrix (ECM) plays a critical role in cell behavior and development. Organoids generated from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are in the spotlight of many research areas. However, the lack of physiological cues in classical cell culture materials hinders efficient iPSC differentiation. Incorporating commercially available ECM into stem cell culture provides physical and chemical cues beneficial for cell maintenance. Animal-derived commercially available basement membrane products are composed of ECM proteins and growth factors that support cell maintenance. Since the ECM holds tissue-specific properties that can modulate cell fate, xeno-free matrices are used to stream up translation to clinical studies. While commercially available matrices are widely used in hiPSC and organoid work, the equivalency of these matrices has not been evaluated yet. Here, a comparative study of hiPSC maintenance and human intestinal organoids (hIO) generation in four different matrices: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB), and VitroGel (Matrix 4-XF) was conducted. Although the colonies lacked a perfectly round shape, there was minimal spontaneous differentiation, with over 85% of the cells expressing the stem cell marker SSEA-4. Matrix 4-XF led to the formation of 3D round clumps. Also, increasing the concentration of supplement and growth factors in the media used to make the Matrix 4-XF hydrogel solution improved hiPSC expression of SSEA-4 by 1.3-fold. Differentiation of Matrix 2-AB -maintained hiPSC led to fewer spheroid releases during the mid-/hindgut stage compared to the other animal-derived basement membranes. Compared to others, the xeno-free organoid matrix (Matrix 4-O3) leads to larger and more mature hIO, suggesting that the physical properties of xeno-free hydrogels can be harnessed to optimize organoid generation. Altogether, the results suggest that variations in the composition of different matrices affect stages of IO differentiation. This study raises awareness about the differences in commercially available matrices and provides a guide for matrix optimization during iPSC and IO work.

저자 스포트라이트: iPSC를 사용한 약물 개발을 위한 오가노이드 생성 발전

Organoids have become valuable tools for disease modeling. The extracellular matrix (ECM)&#160;guides cell fate during organoid generation, and using a system that resembles the native tissue can improve model accuracy. This study compares the generation of induced pluripotent stem cells-derived human intestinal organoids in animal-derived ECM and xeno-free hydrogels.

인간 줄기세포 유지와 장 오가노이드 생성을 위한 기저막 매트릭스의 비교 연구

Extracellular matrix (ECM) plays a critical role in cell behavior and development. Organoids generated from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) ...

생리 학적으로 적합한 분석법을 사용하여 3 차원 줄기 세포 배양 물의 심문을위한 HiPSC 파생 혈청 무 세포 배아 체 개발

요약

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인간 줄기세포 유지와 장 오가노이드 생성을 위한 기저막 매트릭스의 비교 연구

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