기사를 교정 해 주신 Elizabeth Benevides에게 감사드립니다. 우리는 Drs. John Hussman과 Gene Blatt가 도움이되는 토론과 의견을 전했습니다.

1. 신경 전구 세포의 생성 <ol><li> 저분자가 보충 된 인간 iPSC 배지에서 γ- 조사 마우스 배아 피더 (MEF) 세포층상의 6 웰 플레이트에서 섬유 아세포 및 PBMC로부터 유래 된 hiPSC를 유지한다 (물질 표 참조). 참고 : 매일 유지 보수는 이전에보고 절차 (1), (16)의 수정 된 버전입니다. <ol><li> 플레이트 300 μL / 잘 권장 매체 (제조 업체의 프로토콜에 따라)에 6 잘 조직 문화 등급 플레이트의 각 우물에 플레이트 6 X 10 5 MEFs. </li><li> 48 시간 후, hiPSCs를 첨가하기 전에 MEFs 배지를 300μL / 웰 hiPSC 배지로 1 시간 동안 대체한다. </li><li> 37 ° C 수조에서 hiPSC를 빠르게 녹이고 천천히 1 mL의 hiPSC 배지를 적가한다. hiPSCs와 매체를 15 mL 원추형 튜브로 옮긴다. 총 부피가 5 mL가되도록 매체를 넣으십시오. 129 X에서 4 분 동안 원심 분리기, supernata을 대기음1 : 1,000 농도에서 ROCK 억제제가있는 1 mL hiPSC 배지에서 펠렛을 부드럽게 재현 탁하십시오. </li><li> 플레이트를 세포 현탁액 (일반적으로 300,000 세포 / 잘시) MEF 세포 레이어와 37 ° C, 5 % CO 2 , 95 %의 습도에서 품어. </li><li> 광학 현미경을 사용하여 iPSC 배양을 면밀히 모니터링하십시오. 48 시간 후, 가장자리가 고르지 않은 배양 물을 제거하고, 광학 현미경 하에서 낭성과 같은 형태 또는 황갈색의 형태로 자라서 자발적 분화를 최소화한다. 참고 : 7-10 일 후, hiPSC 콜로니가 형성되어야합니다. 식민지는 경계가 명확하고 세포 밀도가 균일해야하며 둥근 모양이어야하며 느슨하게 포장 된 불균일 한 세포가 없어야합니다. </li><li> 자발적으로 분화 된 세포의 문화를 취소 라운드 hiPSC의 식민지를 수동으로 선택합니다. 새 MEF 층에 식민지를 놓습니다. 콩쿠리 근처에있는 배양액이 얼어 붙을 때마다 1 : 3 간격으로 펼쳐보십시오 ( 1 , 16) . </li></ol></li><li> 확장 및 냉동 세포 (백업을위한) 후 50-75 % 합류에 도달 할 때까지 플레이트에 hiPSC 식민지를 자랍니다. </li><li> 7 일 후 도금 후, 신경 전구 세포 분화를위한 hiPSCs를 수확하고 준비하기 위해 온화한 효소 처리 (효소 용액 300 μL로 5-10 분) 및 부드러운 분쇄 (1,000 μL 피펫으로 2-4 회)를 사용하십시오. </li><li> 세포 현탁액을 129 xg에서 4 분간 원심 분리하고, 상층 액을 흡인하고, 5 mL 인간 iPSC 배지에서 펠렛을 재현 탁한다. 37 ° C에서 1 시간 동안 0.1 % 젤라틴 코팅 5cm 세포 배양 접시에 세포 현탁액을 옮기고 MEFs를 제거하고 hiPSC 수율을 최대화합니다. 다른 5cm 젤라틴 코팅 접시로 매체 (비 부착 세포)를 전송하십시오. </li><li> 전송 피펫을 사용하여 15 ML 원심 분리기 튜브에 비 접착 세포를 전송합니다. 부드럽게 3 ML 매체와 플레이트를 씻어 15 ML 튜브에 추가하십시오. </li><li> 4 분 동안 129 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기, 대기음을 대기음원심 분리하고 부드럽게 매체에 펠렛을 resuspend. 자동 셀 카운터를 사용하여 세포 수를 결정하십시오. 96- 웰 저 밀착 V- 바닥 플레이트에 9,000 세포 / 웰 플레이트. </li><li> 플레이트를 163 xg에서 3 분간 원심 분리하십시오. 37 ° C, 95 % 습도 및 5 % CO 2 에서 플레이트를 품어. 피펫을 사용하여 배지의 절반을 제거하고이를 화학적으로 정의 된 새로운 분화 배지 1 (DM1; Figure 1 ; Table of Materials) 로 14 일 동안 대체하여 매일 50 % 배지를 교환하십시오. </li></ol> 2. 무 혈청 배아 체 (SFEB) 유도 ( 그림 2 ) <ol><li> 6 잘 접시에 삽입 40 μm의 세포 배양 삽입 및 집계의 추가 적어도 1 시간 전에 1 ML DM1 매체를 추가합니다. </li><li> 14 일째, 40 μm의 세포 배양 삽입물에 200 μL 넓은 입 끝을 사용하여 20 μL 배지로 응집체를 옮기고 배지를 DM2로 바꿉니다. <br/&gt; 참고 : 세포 배양 삽입물은 우물 바닥에서 약간 떨어져서 플라스틱 프레임을 가로 질러 매달려있는 폴리 테트라 플루오르 에틸렌 막으로 구성되어 있습니다. 이 멤브레인은 생체 적합성을 지니고 있으며 상단에 놓인 SFEB로 영양분과 산소 전달을 효율적으로 유지할 수 있습니다. 그들은 일반적으로 마우스 또는 쥐 7 , 17 , 18 에서 촬영 organotypic hippocampal 슬라이스 문화와 함께 사용됩니다. <ol><li> 하나의 세포 배양 삽입물에 4-6 개의 응집체를 옮기고 응집체 사이에 충분한 공간을 확보하십시오. 미세 피펫 팁 ( 예 : 200 μL 팁)을 사용하여 최대한 많은 과량의 용액을 제거하십시오. 참고 : SFEB 주위에서 제거 된 용액으로 세포 배양 삽입물을 움직일 때 SFEB를 잠시 방해하는 것은 허용됩니다. </li><li> 37 ° C, 95 % 습도 및 5 % CO 2 DM2 1 ML에서 문화를 유지. 피펫을 사용하여 75 %매체의 3/4을 제거하고 4 분의 3의 새로운 매체로 교체하여 격일로 배지. 예를 들어, 750 μL의 배지를 제거하고 750 μL의 새로운 배지를 첨가하십시오. </li></ol></li><li> 문화의 14 일 후, 다른 하루와 다른 16 일 동안 75 % 매체 변화와 DM3 매체로 전환합니다. </li><li> 30 일이 넘는 세포 배양 삽입물에 SFEB를 유지하려면 60, 90 및 120 일 동안 배지를 매일 교체하십시오. 참고 : SFEB는 직경이 약 1,000 μm까지 성장하며 일반적으로 100-150 μm 두께입니다 1 . </li></ol> 3. SFEB 구성 결정 <ol><li> 200 μL 와이드 입 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 매체를 pipetting하여 삽입에서 SFEBs를 분리하십시오. SFEB를 옮기려면 넓은 입 피펫 팁을 사용하여 몸체를 피펫 팁으로 부드럽게 흡입하십시오. SFEB를 pipet tip에 넣은 후 부드럽게 12-well plates에 옮기고 300μL phosphate buffered saline(PBS)로 1 웰당. 참고 : SFEB는 12- 웰 플레이트에서 용액으로 현탁 될 것이다. 고정액, 블로킹 용액 및 항체를 완전히 침투시키는 것이 중요합니다. 얼룩을지게하기 위해 여러 개의 SFEB를 사용하는 경우, 12 개의 웰 플레이트에 최대 10 개의 SFEB를 추가 할 수 있습니다. 이렇게하면 용액과 항체가 보존됩니다. </li><li> 30 ~ 45 분 동안 상온에서 4 % 파라 포름 알데히드 당 300 μL로 SFEB를 고정시킨다. 300μL PBS로 고정 SFEB를 두 번 씻고 3-5 분마다 씻으십시오. 주의 : 파라 포름 알데히드를 취급 할 때는 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 참고 : 표 2 참조 1, 16를 참조하십시오 추가 마커, 500 : 닭 Tuj1 1에서 사용 된이 연구에서 신경 세포를 마킹 성숙, 세포 유형 등을 결정하기 위해 마커로 면역 반응에 대한 조사. </li><li> 0.1 % Triton-X100 (PBS 및 10 % 정상적인 당나라 세럼) (blocking solution; 300 μL)로 실온에서 1 시간 동안 처리 하였다. </li><li> 차단 용액을 제거하고 차단 용액에서 1 차 항체 300 μL로 SFEB를 처리하십시오. 4 ° C에서 밤새 품어 둡니다. 0.1 % 트리톤 X를 함유 한 300 μL PBS로 SFEB를 세 번 세척 (3-5 분 / 세척)하십시오. </li><li> 2 차 항체를 블로킹 용액에 1 : 1000으로 준비한다. 2 차 항체와 실온에서 1 시간 SFEBs를 품어. SFEB를 300 μL PBS로 3 ~ 5 분씩 각각 씻으십시오. 참고 :이 단계에서 SFEB는 이미징을 준비 할 수 있습니다. </li><li> 이미지하려면, 와이드 보어 피펫을 사용하여 슬라이드 슬라이드에 피펫 SFEBs. 부드러운 흡입을 사용하여 SFEB 주변의 과도한 용액을 제거하십시오. 참고 : 유사한 염색 조건의 경우 여러 SFEB를 동일한 유리 슬라이드에 둘 수 있습니다. </li><li> SFEB에 장착 매체 한 방울을 넣고 유리 커버 슬립을 놓고 가볍게 눌러 기포가 없는지 확인하십시오. 장착 매체를 굳히고 이미징 및 부량 화 (단계 3.8)로 진행하십시오. <br/&gt; 참고 : 장착 매체가 단단 해지면 SFEB를 이미징 할 수 있습니다. </li><li> 표준 공 촛점 현미경 (standard confocal microscope)에서 각 ROI를 통해 최대 투영 이미지와 결합 된 z- 스택을 사용하여 SFEB에서 여러 관심 영역 (ROI)을 가져 와서 참고 1 , 16에 설명 된대로 세포 정량화를 수행하십시오. 참고 : 전체 SFEB는 이미지 기반 타일링을 사용하여 정량화 할 수 있습니다 (자세한 내용은 참조 1 , 16 참조). SFEB가 약 100 μm로 얇기 때문에 조직에 빛의 산란이 최소화되므로 2- 광자 현미경 검사가 필요하지 않습니다. 섬유 아세포 유래 iPSCs 프로토콜이 이전 사용은 CGE 및 전방 전뇌 운명 1 16 닮은 전사 정체성의 interneurons의 개체군과 복잡하고 다양한 구조를 드러냈다 SFEB 운명 맵을 생성. </sup&gt; </li></ol> 4. MEAs를 사용하여 SFEBs의 연결 활동을 기록 <ol><li> 제조 업체의 지침에 따라 12 잘 MEA 플레이트를 준비합니다. </li><li> 무균 조건 하에서 2 O 깨끗하게 멸균 H 5 분간 MEA 플레이트를 3 회 반복한다. 75 % 에탄올로 5 분간 씻은 다음 100 % 에탄올로 세척하여 플레이트를 멸균하십시오. </li><li> 50 ° C에서 4 ~ 5 시간 동안 오븐에서 접시를 거꾸로 굽혀 살균 과정을 완료하십시오. </li><li> 각 우물에 500 μL 0.2 % polyethyleneimine 솔루션 (PEI)을 추가하고 실온에서 1 시간 품어. PEI를 대기음으로 멸균 증류수 H 2 O로 4 번 씻으십시오. </li><li> L15 배지에 laminin 20 μL / ML 솔루션을 준비하고 각 우물의 중심에 10 μL laminin를 추가합니다. 참고 : 주변 참조 및 접지 전극을 코팅하지 마십시오. </li><li> 매체 또는 라미닌 증발을 방지하기 위해 주변 저수지에 멸균 dH 2 O를 추가하십시오.37 ° C에서 1 시간 동안 플레이트를 품어 라. </li><li> 부드럽게 그들을 넓은 입 피펫 팁으로 흡입하여 그들을 전송하여 laminin 코팅 MEA 플레이트에 SFEBs (섹션 1 및 2 참조)를 추가하고 그들을 전송합니다. 각 우물에 200 μL DM2 매체를 추가하고 37 ° C, 95 % 습도 및 5 % CO 2 에서 밤새 품어. </li><li> 24 시간 후에 추가로 200 μL 매체를 추가하고, 플레이트를 읽기 전에 37 ° C, 95 % 습도, 5 % CO 2에서 30 분 동안 회복 할 수있다. </li><li> MEA 플레이트를 플레이트 판독기 (37 ° C로 예열 됨)에 놓아서 연결 활동을 기록하십시오. 관련 MEA 레코딩 소프트웨어로 10 분 동안 활동을 기록하십시오. 자세한 내용은 참조 19 를 참조하십시오. </li><li> 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터 - 연속 스트림 및 연결 활동의 래스터 도표를 생성합니다 19 . 참고 : MEA 녹음은 SFEB 도금 7 일 후 촬영됩니다. 이 연구에서는 네트워크 버스트 활동을 감지하기 위해 10 분 동안 녹화를 수행했으며,뾰족한 자취 및 래스터 플롯이 있습니다. SFEB는 MEA 플레이트에서 장기간 유지 될 수 있으며 환경 적으로 통제 된 조건을 사용하여 장기간에 걸쳐 기록 될 수 있습니다 ( 그림 6 ). </li></ol>

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X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochasticity+and+Spatial+Interaction+Govern+Stem+Cell+Differentiation+Dynamics.">Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics.</a> Sci Rep. 5, 12617 (2015).</li></ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없습니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 hiPSC 소스를 정면 피질의 초기 발달 단계를 반복하는 3 차원 구조로 차별화하기위한 조건을 제공합니다. 이 절차는 전기 생리학에 대해 조사 할 수있는 구조를 만들어내는 동시에 현미경 검사를 받아 들일 수 있습니다. SFEB의 최종 형태는 organotypic 두뇌 슬라이스 문화의 그것과 유사하고 고품질의 상세한 공 촛점 이미징을 허용합니다. 이 프로토콜은 fibroblast 및 말초 혈?...

우리는 이전에 초기 대뇌 피질의 네트워크 개발 1의 일부 측면을 되풀이되었습니다 환자 유래 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)에서 생성 된 3-D 모델 시스템을보고했다. 혈청없는 배아 체 (SFEB) 인이 3-D 모델은 이전의 단순 응집 hiPSC 모델 2 , 3을 향상시킵니다. 우리의 SFEB와 같은 3D 구조가 2 차원 (2-D) / 단일 층 hiPSC 모델 4 , 5 에서 관찰 된 것보다 더 일찍 생체 내 에서 관찰 된 신경 발달의 대략적인 양상을 드러내고있다. 초기 연구는 생리 학적 복잡성을 입증하지 않고 3 차원 신체의 자기 조직화 복잡성에 초점을 두었습니다 2 . 여기에 설명 된 프로토콜은 섬유 아세포에서 유래 undifferentiated hiPSCs에 사용되었습니다<html> 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC). 이 세포는 γ 선발 마우스 배아 기 (MEFs)에서 유지됩니다. 이러한 hiPSC 콜로니를 자발적으로 분화 된 세포에서 수동으로 세척하고, 효소 적으로 수확하고, Rho 키나제 억제제 Y-27632 (ROCKi)를 함유하는 배지에 재현 탁한다. 미분화 hiPSC는 96 웰 저 접착 V 바닥 플레이트로 옮기기 전에 해리 및 원심 분리를 거친다. 도금 후, 앞쪽 전두엽의 뇌신경 - 운명 계통 6 을 구동하기 위해 이중 SMAD 억제 (dickkopf 1 (DKK-1)와 함께 SB431542 및 LDN193189)를 사용하여 신경 유도를 개시한다. 14 일 후, SFEB는 6- 웰 플레이트의 세포 배양 삽입물로 옮겨진다. 전달 된 라운드 SFEBs는 유사한 세포 배양 삽입물 1 , 2 , 3을 사용하여 해마 기관 체적 슬라이스 배양 조제 물에서 종종 관찰되는 바와 같이 국부적 인 네트워크 연결을 유지하면서 퍼지고 얇아지기 시작한다 .ss = &quot;xref&quot;&gt; 7. 이 형식의 SFEB 기반 3-D 플랫폼의 사용은 단일 세포 기록 또는 다중 전극 배열 (MEA)과 같은 칼슘 이미징 또는 전기 생리 학적 분석과 같은 세포 기반 생리 학적 분석을 사용하여 조사 할 수있는 대뇌 피질 네트워크의 효율적 생산에 적합합니다 ) 1 . 3-D 시스템이 초기 피질 발달 지표를 지니고 있지만, 다른 연구들에 의하면 이러한 3-D 몸체는 본질적으로 인간 조직 발달 속도가 느려지도록 더 긴 배양 시간을 필요로 할 수 있습니다 8 . 이 SFEB 프로토콜은 피질의 초기 발달 양상을 파악하는 미분화 된 hiPSC로부터 3 차원 SFEB를 성공적으로 생성합니다. SFEB가 신경계 장애에서 네트워크 수차를 모델링 할 수있는 가능성은이 시스템의 강점입니다. 환자 조직으로부터 유래 된 hiPSCs는 엉덩이에 영향을받는 신경계의 세포로 성장할 수있다세포 생물학뿐만 아니라 수반되는 유전자 발현과 관련이있다. 인간 iPSCs은 자폐증 스펙트럼 장애 (ASD), 정신 분열증 9 레트 증후군 (10), 및 알츠하이머 병 (11), (12) 복소 병인으로 신경계 장애를 변화와 개인의 큰 그룹의 유전 적 프로파일을 확인하기 위해 사용되고있다. 최근까지 iPSC 모델은 전형적으로 분자 상호 작용을 평가하는 데 능숙한 반면 생체 내에서 관찰 되는 복잡한 세포 상호 작용을 해독하는 데는 부적합한 단일 층 준비물이었습니다. 동물 모델은 전체 기관 플랫폼을 재생성하기위한 기본 대체품이었습니다. 이 동물 모델은 결과의 빈약 한 번역에 의해 괴롭혀지고, 대규모 유전 스크리닝 연구에 의해 확인 된 인간 유전 프로파일을 복제하는 능력이 제한되어있다. 따라서, iPSC로부터 3-D 시스템을 개발하면 인간에게 필요한 복잡성 계층이 추가됩니다질병 모델링 13 , 14 . 3D hiPSC 플랫폼 다음 단계는 세포 기반 분석법을 이용하여 스크리닝 15 처리량의 큰 규모의 요구 사항을 수용하기위한 것이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1173">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:573px;">SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>0-5835</td>
			<td>250ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)</td>
			<td>GlobalStem</td>
			<td>GSM-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DM1 Media Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">10565018</td>
			<td>385ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Knockout Serum Replacement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">10828028</td>
			<td>20% 100ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">15140122</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glutamax 200mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">35050061</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X), liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">11140050</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">21985023</td>
			<td>900ul</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DM2 Media Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">10565018</td>
			<td>500ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glutamax 200mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">35050061</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">15140122</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">N-2 Supplement (100X), liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">17502048</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DM3 Media Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">NEUROBASAL Medium (1X), liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">21103049</td>
			<td>500ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">B-27 Supplement Minus Vitamin A (50X), liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">12587010</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glutamax 200mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">35050061</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td align="right">15140122</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Small Molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Thiazovivin</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0017</td>
			<td>2uM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">SB431542</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0010-10</td>
			<td>1:1000 (10uM)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Dorsomorphin</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0024</td>
			<td>1uM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">LDN-193189</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0074-10</td>
			<td>250nM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Y27632 (ROCKi)</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0012-10</td>
			<td>10uM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Recombinant Protiens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DKK-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-30</td>
			<td>200ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Components/Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cell Culture inserts 0.4uM, 30mm Diameter</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Mouse Embryonic Fibroblasts</td>
			<td>GlobalStem</td>
			<td>GSC-6301G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">96 well V bottom w/Lids</td>
			<td>Evergreen</td>
			<td>222-8031-01V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TritonX-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">85111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">10010023</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">11415114</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DRAQ5 (Nuclear Marker)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65-0880-96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">MEA Plates</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td>M768-GL1-30Pt200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">6 well flat bottom</td>
			<td>Falcon</td>
			<td align="right">353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nestin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brn-2</td>
			<td>Protein tech</td>
			<td>14596-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VGLUT1&#160;</td>
			<td>Synaptic Systems&#160;</td>
			<td>135 303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pax6</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab5790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calretinin&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calbindin</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab11426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoupTFII</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>PPH714700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nkx 2.1</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab12650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tuj1</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab41489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reelin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tbr1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NFH</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M0762</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

developing hipsc derived serum free embryoid bodies for the interrogation of 3-d stem cell cultures using physiologically relevant assays

많은 in vitro 질병 모델이 hiPSCs를 사용하여 개발되었지만, 한 가지 제한점은 이러한 2 차원 (2-D) 시스템이 의심되는 질병 변이를 가진 감염된 개인의 기본 세포질 및 기능적 복잡성을 나타내지 않을 수 있다는 것입니다. 기존의 2D 모델은 생체 내 유사 구조의 불완전한 표현으로 남아 있으며 뇌의 복잡성을 적절히 포착하지 못합니다. 따라서, 생체 내 시스템 에서 보이는 세포 상호 작용 및 기능을보다 잘 나타낼 수있는 3-D hiPSC- 기반 모델에 대한 필요성이 대두되고있다. 여기서는 무 혈청 배아 체 (SFEB)에 기초한 미분화 된 hiPSCs로부터 3-D 시스템을 개발하기위한 프로토콜을보고한다. 이 3-D 모델은 발달중인 신피질의 양상을 반영하고, 이동하는 신경 세포 및 이동성, 연결성, 통신 및 매트와 같은 손상되지 않은 조직에 필수적인 기능에 대한 연구를 허용합니다uration. 특히 우리는 우리의 프로토콜을 사용하는 SFEB가 칼슘 이미징과 같은 생리 학적으로 관련성이 높은 고농축 세포 기반 분석법 및 cryosectioning없는 다중 전극 배열 (MEA) 기록을 사용하여 조사 될 수 있음을 입증합니다. MEA 기록의 경우, 우리는 SFEB가 장기간 배양하는 동안 스파이크 활동과 네트워크 수준 파열 활동을 증가 시킨다는 것을 입증합니다. 이 SFEB 프로토콜은 초기 대뇌 피질 발달의 양상을 포착하는 3-D 모델에서 네트워크 형성을 개발하는 연구를위한 견고하고 확장 가능한 시스템을 제공합니다.

우리의 기술을 사용하여 성장한 SFEBs는 초기 Tuj1 양성 뉴런뿐만 아니라 신경 progenitors ( 그림 3A ) 가득한 초기 개발 피질 subventricular 영역을 닮은 형태학 특성과 조직을 굴복. SFEB ( 그림 3B )의 바깥 쪽 층과 내부 층에는 수 많은 발육 피질 로제가 관찰되었습니다. SFEB의 바깥 쪽 가장자리는 퇴행 후 뉴런을 포함하는 발달중인 피질 ...

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Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

여기 우리는 무 혈청 배아 체 (SFEB)라고 불리는 인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)로부터 3 차원 (3-D) 시스템을 개발하기위한 프로토콜을보고합니다. 이 3-D 모델은 인간 피질 발달을 모델로하고 신경 회로를 개발하는 생리 학적 심문을 위해 장기 유형의 슬라이스 문화처럼 사용될 수 있습니다.

생리 학적으로 적합한 분석법을 사용하여 3 차원 줄기 세포 배양 물의 심문을위한 HiPSC 파생 혈청 무 세포 배아 체 개발

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

developing-hipsc-derived-serum-free-embryoid-bodies-for-interrogation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K 조회수.  The Hussman Institute for Autism.  여기 우리는 무 혈청 배아 체 (SFEB)라고 불리는 인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)로부터 3 차원 (3-D) 시스템을 개발하기위한 프로토콜을보고합니다. 이 3-D 모델은 인간 피질 발달을 모델로하고 신경 회로를 개발하는 생리 학적 심문을 위해 장기 유형의 슬라이스 문화처럼 사용될 수 있습니다. 

비디오: Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

손상 3 - D 뇌 회로의 타겟팅 바이러스성을위한 확장 가능한 유체 인젝터 배열

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

연구

신경과학

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

Neuroblast 분석 : 유동세포계측법을 사용하여 차별화 신경 줄기 세포에서 자손의 연결 전구 세포의 생성과 강화에 대한 분석

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

줄기의 네트워크 문화 생물 신경 독소의 기능 평가 중추 신경계 신경 세포가 유래

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

신경 줄기 세포의 열거 클론 세이를 이용하여

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions in newborn infants. While mosquitos are the main route of viral transmission, it has also been shown to spread via sexual contact and vertical mother-to-fetus transmission. In this latter case of transmission, due to the unique viral tropism of ZIKV, the virus is believed to predominantly target the neural progenitor cells (NPCs) of the developing brain.
Here a method for modeling ZIKV infection, and the resulting microcephaly, that occur when human cerebral organoids are exposed to live ZIKV is described. The organoids display high levels of virus within their neural progenitor population, and exhibit severe cell death and microcephaly over time. This three-dimensional cerebral organoid model allows researchers to conduct species-matched experiments to observe and potentially intervene with ZIKV infection of the developing human brain. The model provides improved relevance over standard two-dimensional methods, and contains human-specific cellular architecture and protein expression that are not possible in animal models.

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

This protocol describes a technique used to model Zika virus infection of the developing human brain. Using wildtype or engineered stem cell lines, researchers may use this technique to uncover the various mechanisms or treatments that may affect early brain infection and resulting microcephaly in Zika virus-infected embryos.

대뇌 Organoids 파생 Zika 바이러스 감염 개발 인간의 두뇌에는 생체 외에서 줄기 세포를 사용 하 여 모델링

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

신경계 발달 중 축산 성장과 행동을 분석하는 3-D 콜라겐 기반 하이드로겔 생성

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.