성분과 기능화된 표면의 간단한 혼합으로, 이 프로토콜은 액틴 어셈블리에 의해 구동되는 세포의 중요한 기능, 움직임을 재현합니다. 힘 생산의 생화학 적 및 생물 물리학 적 메커니즘은 성분 혼합과 기능화 된 표면의 특성을 변화시킴으로써 평가할 수 있습니다. 이 프로토콜의 가장 큰 장점은 모든 성분을 구입할 수 있으므로 단백질 정제에 대한 전문 지식이 필요하지 않다는 것입니다.
이를 통해 비전문가는이 시스템을 연구 도구로 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 학부 수준의 교육 모듈을 제공하여 학생들에게 단백질을 조작하고 현미경으로 자체 준비된 생물학적 시스템을 관찰하는 실습 경험을 제공합니다. 시스템 매개 변수를 제어하고 변경할 수 있습니다.
Langmuir 방정식과 같은 물리적 분석은 궤적에서 실행할 수 있습니다. 동결 건조 된 단백질을 재현탁하여 시작하십시오. 섭씨 4도에서 펄스 원심 분리하여 튜브 바닥의 고체를 수집합니다.
그런 다음 제조업체의 지침에 따라 물을 넣고 얼음 위에서 최소 15분 동안 배양합니다. 피펫팅으로 부드럽게 섞습니다. 얼음 위에 15 분 더 보관하고 다시 섞는다.
원심 분리로 튜브 바닥에 용액을 모으십시오. 리믹스하고 얼음에 분취하십시오. 동결건조 및 동결 중에 형성된 액틴 올리고머를 해중합하려면 추가 ATP, DTT 및 10% 표지된 액틴으로 스파이크된 G-완충액에 재현탁된 액틴의 분취량을 8배 희석합니다.
단백질 농도를 측정하기 전에 적어도 며칠에서 일주일 동안 가끔 혼합하여 얼음에서 해중합되도록 하십시오. 재현탁 단백질의 단백질 농도를 측정하려면 먼저 BSA 희석 시리즈를 준비합니다. 원고에 설명 된대로 2 밀리리터 및 1.5 밀리리터 튜브를 랙에 배치하여 시작하십시오.
15 밀리리터 원추형 튜브를 Bradford 시약으로 채우고 얼음 위에 놓습니다. 200마이크로리터의 Bradford 시약을 가져다가 원뿔형 튜브로 다시 꺼내 피펫 팁을 적십니다. 용액의 점성이 있으므로 용액이 거품을 만들지 않고 팁에 완전히 들어가고 떠날 수 있도록 천천히 피펫을 돌립니다.
그런 다음 사전 습식 팁을 사용하여 200 마이크로리터의 Bradford 시약을 랙의 각 1.5 밀리리터 튜브에 피펫팅합니다. 그리고 15 밀리리터 원추형 튜브의 나머지 내용물을 병에 되돌립니다. 1열, 3열, 5열의 두 밀리리터 튜브에 물을 계량합니다.
원고에 설명된 대로 보정된 BSA 스톡 용액을 희석하여 BSA 희석 시리즈를 준비합니다. 그런 다음 각 용액 900 마이크로 리터를 다음 튜브로 옮겨 연속 희석하십시오. 블랭크용 Bradford 시약 튜브에 800마이크로리터의 물을 추가하고 타이머를 시작합니다.
준비된 튜브에 800마이크로리터의 각 BSA 표준물질과 200마이크로리터의 브래드포드 시약을 혼합합니다. 일회용 큐벳에서 Bradford 시약 또는 각 표준물질과 혼합한 후 5분 이내에 600나노미터에서 흡광도를 읽습니다. 얻어진 흡광도 값을 공지된 BSA 농도의 함수로서 그래프로 나타내고 0.99의 R 값으로 선형 상관관계를 구한다.
2000 마이크로 리터의 물이 들어있는 튜브에서 원고에 설명 된대로 재 용해 된 단백질을 부드럽게 희석하십시오. 준비된 Bradford 시약에 800 마이크로 리터의 각 용액을 즉시 첨가하고 혼합하십시오. 5 분 이내에 분광 광도계의 흡광도를 읽으십시오.
이전에 구성된 표준 곡선을 사용하여 단백질 농도를 계산합니다. 비드 코팅의 경우 원심분리기를 섭씨 4도까지 사전 냉각합니다. 50 마이크로 리터의 Xb 버퍼를 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 피펫팅합니다.
vortexing에 의해 4.5 마이크로 미터 직경의 비드 현탁액을 완전히 혼합하고 Xb 버퍼가 들어있는 튜브에 9 마이크로 리터의 현탁액을 첨가하십시오. 샘플을 섭씨 4도에서 10 분 동안 20, 000 G에서 원심 분리합니다. 비드를 코팅하려면 비드를 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 제거하고 부드럽게 피펫팅하여 Xb 완충액 중 2개의 마이크로몰 SpVCA의 40 마이크로리터에 비드 펠릿을 재현탁합니다.
이제 건조 블록의 비드를 섭씨 18도에서 20분 동안 1000RPM으로 교반합니다. 다음으로, 코팅된 비드를 원심분리하여 세척한다. 상청액을 제거하고, 비드를 1%BSA로 50 마이크로리터의 차가운 Xb에 재현탁시킨다.
비드를 세척한 후, 코팅된 비드 펠릿을 120 마이크로리터의 차가운 Xb, 1%BSA에 재현탁시킨다. 냉장고 또는 차가운 방에서 얼음 위에 보관하십시오. 원고에 기재된 바와 같이 운동성 반응 혼합물을 준비한다.
반응을 빠르게 혼합하고 타이머를 시작하십시오. 슬라이드에서 전체 운동성 반응 혼합물을 발견합니다. 18mm x 18mm 커버슬립으로 덮고 작은 붓을 사용하여 녹인 VALAP으로 커버슬립을 밀봉합니다.
전체 비드 모집단에 대한 평균 변위 속도를 얻으려면 전체 슬라이드를 스캔하여 시간 경과에 따른 위상차 또는 형광 정지 이미지를 기록합니다. 혜성 길이를 손으로 측정하고 값을 기록합니다. 혜성 길이 대 시간을 플로팅합니다.
선형 피팅의 기울기는 평균 성장 속도입니다. 위상차 현미경에서 타임랩스 동영상을 선택하여 개별 비드 속도를 평가합니다. 비드 속도와 필요한 해상도에 따라 1-10초마다 프레임을 가져옵니다.
이미지 처리 프로그램의 추적 도구를 사용하여 비드 속도와 궤적을 얻으십시오. BSA 표준물질을 브래드포드 시약과 혼합하면 등급이 매겨진 청색 색조의 용액을 얻을 수 있습니다. 흡광도 값은 표준 단백질 농도와 비교하여 플롯되고 선형 상관 관계는 재현탁 단백질 농도를 결정하는 데 사용됩니다.
SPVCA 코딩 비드와 캡핑 단백질을 포함하는 운동성 배지를 혼합하면 몇 분 안에 액틴 구름이 형성됩니다. 구름 편광은 약 5 분에 발생하고 혜성 생성은 15-20 분에 발생합니다. 액틴 혜성은 여러 시간 동안 계속 늘어나지만 일정한 속도는 유지되지 않습니다.
그래서 비드 운동성은 1시간 이내에 평가된다. 캡핑 단백질 또는 젤솔린과의 운동성 혼합은 유사한 방식으로 혜성을 제공합니다. 액틴 구름은 반응의 처음 20 분 동안 혜성을 형성하기 위해 편광되고 혜성은 시간이 지남에 따라 길어집니다.
시간이 지남에 따라 측정 된 혜성 길이의 평가는 변위 속도를 계산하는 데 사용됩니다. 캡핑 활동이 없으면 액틴 구름이 구슬 주위에 형성되지만 혜성 형성은 발생하지 않습니다. 단백질의 신중한 취급 및 피펫팅은 운동성 혼합을 만들 때뿐만 아니라 Bradford 분석으로 단백질 농도를 측정할 때도 이 절차의 성공에 필수적입니다.
이 프로토콜로 얻은 혜성 형성 및 비드 궤적은 연질 물질 및 통계 물리학 분석 및 힘 측정 및 미세 조작을 포함한 생물 물리학 실험을 사용하여 이동의 물리적 메커니즘을 이해할 수있게합니다.
