이 방법은 다른 형광 단백질로부터 신호를 관찰하기 위해 용이하게 적응할 수 있거나 다른 성인의 축축을 이미지화하는 데 사용될 수 있으며 이 기술의 주요 장점은 축축과 말단 식목의 우수한 3차원 재구성 및 시각화를 용이하게 한다. 70%에탄올로 유리 멀티웰 플레이트에 적절한 수의 우물을 채우는 것으로 시작합니다. 브러시를 사용하여 모든 연령 또는 성별의 이산화탄소 마취 파리 15~20개를 각 우물에 추가하고 완전히 물에 잠길 때까지 파리를 에탄올에 부드럽게 두드려 주세요.
1분 이상 후, 시동당 최소 10분 동안 인산염 완충식식염에 0.3% 비이온 계면활성제 세제용액으로 파리를 세 번 헹굴한다. 마지막 세척 후, 집게를 사용하여 흉부 세그먼트 또는 다리를 손상시키지 않고 각 플라이의 머리와 복부를 제거하고 미세 집게 한 쌍의 끝을 사용하여 코카 흉부 접합에 압력을 부드럽게 바르지만 단단히 가하여 흉부 세그먼트에서 한 쪽 다리를 분리합니다. 갓 준비된 4%파라포름알데히드가 들어있는 새로운 멀티웰 플레이트의 한 웰에 다리를 놓고 밤새 4도의 배양을 합니다.
다리를 고정 된 다리를 얻기 위해 떠두지 않고 고정 버퍼에 다리를 부드럽게 밀어 넣는 것이 중요합니다. 다음 날, 신선한 0.3 % 비 이온 계면 활성제 세제 용액으로 다리를 5 번 세척하여 세척 당 20 분 동안 씻습니다. 마지막 세척 후 세제를 장착 매체로 교체하고 다리를 장착 매체에 24시간 이상 유지하십시오.
다음 날, 유리 현미경 슬라이드의 코팅 된 끝 옆에 70 % 글리세롤의 약 20 마이크로 리터를 추가하고 22 by 22 mm 커버 슬립으로 글리세롤을 덮습니다. 다음으로, 커버슬립의 오른쪽에 약 10 마이크로리터 라인의 장착 매체를 추가하고 10 마이크로리터 라인의 오른쪽에 장착 매체의 두 번째 30 마이크로리터 라인을 적용한다. 미세한 집게를 사용하여, 중간 크기의 멀티웰 플레이트에서 외부 측 또는 아래 방향으로 장착 매체의 10 마이크로리터 스트립으로 한 쪽 다리를 옮길 수 있습니다.
6~8개의 다리가 장착되고 정렬될 때까지 반복하고 두 번째 커버슬립이 첫 번째 커버슬립에 약간 놓이도록 다리 위에 두 번째 커버슬립을 놓습니다. 그런 다음 커버립의 각 모서리에 매니큐어를 사용하여 제자리에 고정하십시오. 다리를 이미지화하려면 488 나노미터 레이저와 두 개의 검출기를 동시에 사용하여 GFP 및 큐티클 자동 형광을 모두 얻기위한 첫 번째 트랙을 설정합니다.
20~25배 오일 침지 목표를 선택하고 해상도를 12비트 깊이로 1024xx로 설정하고 z 간격을 하나의 마이크로미터로 설정합니다. 슬라이드를 현미경 단계에 로드하고 두 검출기에 대해 동일한 레이저 전력을 사용하여, 제1 검출기의 게인을 조정하여 밝은 GFP 신호를 얻고 두 번째 검출기를 조정하여 큐티클 신호가 높은 일부 영역이 검출기에서 포화 신호를 생성하도록 합니다. 그런 다음 타일 또는 위치 옵션을 사용하여 다리를 이미지하여 다리가 확장되거나 너무 커서 단일 프레임으로 이미지화할 수 없을 경우 전체 다리를 캡처합니다.
이미지 처리를 위해 ImageJ Fiji의 공초점 스택을 열고 Bio-Formats 플러그인을 사용하여 TIFF 형식이 아닌 이미지를 엽니다. 채널을 분할하려면 이미지, 색상 및 분할 채널을 선택합니다. GFP 신호에서 큐티클 신호를 빼려면 프로세스 및 이미지 계산기를 열고 검출기 에서 스택을 이미지 하나로 선택합니다.
수술 창에서, 내인성 GFP 신호만 얻을 수 있도록 검출기 2에서 트랙을 이미지 2로 선택하고 선택한다. 내인성 GFP 신호에 대한 최대 강도 프로젝션을 생성하려면 이미지, 스택, Z 프로텍션을 사용합니다. 밝기 제어 창의 컨트롤을 사용하여 밝기와 대비를 조정합니다.
그런 다음 큐티클에 대한 평균 강도를 생성한 다음 이미지, 색상 및 병합 채널을 사용하여 GFP 스택을 검출기 2에서 획득한 큐티클 전용 스택과 병합합니다. 이것은 조직 특정 GFP 신호와 다리 세그먼트 내의 축삭 아버를 식별하는 데 도움이되는 큐티클 신호로 구성된 RGB 이미지를 초래할 것이다. 매크로를 사용하려면 공초점 스택을 열고 이미지, 조정 및 밝기/대비를 클릭합니다.
그런 다음 플러그인 및 매크로 실행을 클릭하여 매크로를 실행하고 지침을 따릅니다. 이미지 계산기 창에서 작업을 지정하라는 메시지가 표시됩니다. 작업 창에서 빼기 선택을 합니다.
이미지 2를 스택 2로 선택합니다. 대비를 조정하라는 메시지가 표시되면 밝기 제어 창의 컨트롤을 사용하여 GFP의 최대 투영 이미지와 큐티클의 평균 투영의 밝기 대비를 조정하여 녹색의 GFP와 회색의 큐티클을 보여주는 두 신호의 RGB 병합 이미지를 생성합니다. 그런 다음 스택 1의 결과를 병합하고 다음 단계에서 사용할 수 있는 결합된 GFP 및 큐티클 스택을 생성하기 위해 2개의 스택을 누른다.
다리를 3차원으로 시각화하려면 적절한 3D 소프트웨어 프로그램에서 RGB 스택을 엽니다. 팝업 대화 창에서 모드 변환 섹션의 모든 채널을 선택하고 이전 분석에서 얻은 복셀 의 크기를 입력합니다. 채널 1 모듈에서 디스플레이 및 볼렌을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 선택합니다.
그런 다음 볼렌 모듈을 클릭합니다. 속성 섹션에서는 고급 을 클릭하고 DDR을 선택합니다. 그런 다음 감마 값을 조정하여 큐티클 배경을 봅타입니다.
채널 두 모듈에서 Volren 표시를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 선택합니다. 그런 다음 볼렌 모듈을 클릭하고 편집하고 volrenGreen.col을 선택합니다. 이 절차를 사용하여, 큐티클에서 신호는 다리 내의 축삭의 위치를 식별하기 위해 GFP 신호와 결합 될 수있다.
잘 고정된 다리를 얻는 것이 매우 중요합니다. 제대로 고정 된 다리에서 다리 내의 내부 구조는 균일 한 색상으로 표시되며 어두운 기관도 보입니다. 제대로 고정된 다리에서는 타르수스와 경골에 어두운 물질이 존재하며 대퇴골과 콕사에서는 기관 계통이 명확하게 보이지 않습니다.
여기에서 설명한 절차는 고해상도를 가진 두껍고 자동 형광 큐티클을 통해 모터 뉴런 축삭에서 형광 발현을 검출하는 도전을 극복합니다. 따라서 얻은 깨끗하고 상세한 형광 신호는 3D 이미징 프로그램을 사용하여 축축아 소거의 3차원 특징을 시각화하고 양화할 수 있게 해 주어 있습니다. 따라서 이 기술은 성인 Drosophila를 모델로 사용하여 운동 뉴런의 발달을 연구할 뿐만 아니라 ERAS와 같은 퇴행성 질환이 통합된 운동 시스템에 미치는 영향을 이해할 수 있도록 합니다.
