Name: study of protein-protein interactions in autophagy research
Uploaded: 2017-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research at JoVE.com

이 작품은 과학 및 터키 과학 기술 연구 위원회 (TUBITAK) 1001 그랜트 107T153, Sabanci 대학교에 의해 지원 되었다. 세 브와 NMK 박사 연구 TUBITAK BIDEB 2211 장학금에 의해 지원 됩니다.

1. 면역 형광 DMEM 높은 포도 당 매체, <ol><li>유지 HEK293T 인간 미 발달 신장 세포 및 N2A 마우스 neuroblast 셀 DMEM 낮은 포도 당 중간, 5% CO 2-37 ° c.에 습도 인큐베이터 10% 태아 소 열 비활성화 (FBS) 혈 청, 문화 미디어 보충 (50 U/mL 페니실린, 50 µ g/mL 스), 항생제 및 L-글루타민 (2mm).</li>
	<li>는 0.25 %trypsin 사용 하 여 셀을 분리 합니다. 먼저 세포 배양의 미디어 제거 다음 셀 10 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 되는 염 (PBS)을 세척 하 고, 트립 신 2 mL DMEM 매체를 추가 하 여 5 분 비활성화 트립 신에 대 한 37 ° C에서의 1 mL와 함께 품 어.</li>
	<li>Pipetting에 의해 잘 접시를 세척. 셀 솔루션의 10 µ L을 제거 하 고 10 µ L trypan 파랑의 혼합. hemocytometer를 사용 하 여 라이브 셀의 수를 계산 하.</li>
	그러나 <li>모두 HEK293T와 N2A 부착 세포,, HEK293T 셀 쉽게 접시에서 분리. 따라서, 작동 HEK293T 셀 라인, 코트와 살 균 coverslides 필터링 0.01% 폴 리-L-리 신 셀을 뿌리기 전에.
	<li>10 cm 배양 접시에에서 장소 살 균 coverslides <ol>. 각 coverslide에 폴 리-L-리 신 솔루션의 적절 한 금액을 추가 합니다. 10 분에 대 한 폴 리-L-리 신 솔루션 coverslides를 품 어</li>
		<li>폴 리-L-리 신 솔루션 제거. 
		참고: 폴 리-L-리 신은 재사용 가능한; 그것은 수집 하 여 추가 실험을 위해 재사용 옵션입니다. 폴 리-L-리 신 독성 때문에, 모두는 coverslides에 솔루션의 완전히 증발 될 때까지 기다립니다 그리고 폴 리-L-리 신 다음 복구.</li>
		<li>세척 살 균 PBS 가진 coverslides.</li>
	</ol></li> <li>1 mL DMEM 12-잘 접시의 각 음에 추가. 각 잘에서 한 coverslide 장소.</li>
	<li>씨앗 20000 셀/글쎄, 드롭 들러는 coverslides 셀의 균일 분포에 대 한 동시에 접시를 떨고 있는 동안. 셀에에서 계속 CO 2 인큐베이터 37 ° C에서 고 약을 추가 총 보육 시간 48 h를 초과 하지 않는, 즉, 3 h Torin 치료에 대 한 추가 약 45 h 게시물 시드에.
	<ol>RACK1-LC3 <li>상호 작용 연구, Torin 1, rapamycin, 그리고 기아 autophagy inducers로 사용 되었다. 셀은 알을 품 Torin 1 3 h (250 nM 최종 농도 겠어요); rapamycin 16 h (200 nM 최종 농도 겠어요);에 대 한와 함께 그리고 얼 &#39; s 균형 소금 솔루션 (EBSS) 세포를 굶 어 하려면 2 h. 
		참고: 10 %FBS 제어 조건으로 사용 된 DMEM 부 화.</li>
	</ol></li> <li>총 보육 시간의 48 h 후에 coverslides 미디어를 제거 하 고 1 mL PBS와 함께 그들을 씻어.</li>
	<li>셀을 해결 하기 위해 품 어 1 mL 얼음 차가운 살 균 필터링 된 4 %paraformaldehyde (PFA) 어떤 동요 없이 실 온에서 20 분의 1 x PBS (pH 7.4)에 있는 셀. 
	PFA 빛에 민감한 때문에, 계속 (중요 한) 접시 어둠 속에서 부 화 기간; 알루미늄 호 일 접시를 덮고 도울 수 있습니다. 또한, PFA 독성, 따라서, 증기 두건에서 셀을 수정 하는 동안 작업. 
	참고: 고정 단계 면역 형광 실험에서 유의 최적화 해야 합니다, 특정 항 체는 최고의 조건과 다른 고정 에이전트를 사용 하 여 작업 수 있습니다.</li>
	<li>PFA 부 화 후 20 분 먼저는 coverslides에 PFA 솔루션을 제거 하 고 각 샘플 3 번 1 mL 균 필터링 된 PBS로 세척. At이이 단계, (중요 한) 세척을 말리 우물 하나. 이후 후속 반응 셀의 방해 하 고 세포 형태를 변경, 일반적인 신호를 증가 것입니다 그것을 건조 하지 마십시오.</li>
	<li>세척이 완료 되 면 계속 1 ml PBS 얼음에 샘플</li>
	<li>차단 솔루션 준비: 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 0.1% 사포닌과 PBS.</li>
	<li>는 파라핀 영화 6 잘 플레이트 커버. 플레이트 하단 파라핀 영화 취재 후 부드러운 인지 확인 합니다. 6 잘 플레이트 라벨.</li>
	<li>핀셋을 사용 하 여, 전송은 coverslides 12-잘 접시 6 잘 플레이트에 파라핀 필름으로 커버.</li>
	<li>는 Coverslides에 PBS를 삭제 하 고 차단 하는 permeabilization에 대 한 각 coverslide에 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 30 분에 대 한 얼음에 샘플을 품 어</li>
	<li>는 솔루션을 차단에 1 차적인 항 체를 준비 합니다. 실험을 하기 전에 얼룩에 대 한 최상의 작업 농도 정의 하기 위해 항 체 희석 최적화. 
	참고: 예를 들어 LC3 항 체 솔루션을 차단에 1: 100 희석에 사용 됩니다.</li>
	<li>30 분 부 화 후 차단 솔루션을 삭제 하 고 부드럽게 1 mL의 PBS로 샘플을 한 번 씻어.</li>
	<li>추가 100 µ L 각 coverslide에 대 한 1 차적인 항 체 해결책의. 대 한 통에 1 시간 실 온에서 샘플을 품 어. 
	참고: 1 차적인 항 체 외피 시간 최적화 되어야 합니다. 항 체에 따라 4 ° C에서 하룻밤 인큐베이션 바람직 있을 수 있습니다. 통에 품 어 부드럽게 하는 것이 좋습니다 (100 회전/분)는 coverslides에 항 체를 똑같이 배포.</li>
	<li>1 차적인 항 체를 가진 외피 후 샘플 개별적으로, 3 회로 씻어 1 mL PBS.</li>
	<li>준비 1: 500 이차 항 체 (이차 항 체의 희석의 최적화 필요할 수 있습니다) 솔루션을 차단에. 여기, 안티-토끼 IgG 알 렉 사 Fluor 568 보조 안티 토끼 항 체로 사용 되었다.
	<ol><li>샘플 통에 실 온에서 1 h를 위한 이차 항 체 해결책의 100 µ L 품 어. 이후 fluorophore 표시 된 이차 항 체는 빛에 민감한, (중요 한) 어둠 속에서 솔루션을 계속. 이차 항 체 외피 전후 동안 어둠 속에서 샘플을 배치.</li>
	</ol></li> <li>이차 항 체 부 화 후 3 회 PBS 가진 접시 세척. 
	참고: 사용 경험에 따라, 일부 항 체는 PBS에 의해 제거 될 수 없는 높은 배경 신호 세척. 같은 항 체, 단계 1.21, 후 처리 하는 경우 6 h 4 ° C에서 PBS에 샘플을 유지 도울 수 있습니다.
	<ol><li>필요한 경우 얼룩 Hoechst, 핵 표시 같은 DNA 바인딩 염료와 셀.</li>
	</ol></li> <li>더 이상의 단백질 얼룩, 적용 단계 1.16 두 번째 단백질에서에서 시작 하는 동일한 절차.
	<ol>확인 <li>하나 이상의 항 체 (예, 사용 마우스와 토끼 항 체)로 얼룩을 수행할 때 항 체 사이 아무 종 반응이 다는 것. 
		참고: 여기에서, RACK1은 스테인드 두 번째 단백질으로 안티-RACK1 주 항 체와 반대로 마우스 IgG 알 렉 사 Fluor 488 이차 항 체 위에서 언급 한 같은 농도 사용 하 여 사용 하 여.</li>
	</ol></li> <li>장착 솔루션 준비: 50% 글리세롤 1 x PBS에. 22 µ m 필터를 통해 필터.</li>
	<li>에탄올 보풀 지우기를 사용 하 여 슬라이드를 닦 고 10 µ L 장착 솔루션 각 슬라이드에 추가. 트위터를 사용 하 여 셀으로 측면 장착 매체와 직접 접촉에 있는 각 dropso에는 coverslides를 놓습니다. 부드럽게 보풀 물티슈를 사용 하 여 초과 장착 솔루션 삭제.</li>
	<li>인감 투명 매니큐어와 coverslides. 먼저,는 coverslides 4 가장자리에 매니큐어의 방울을 추가 하 여 안정과 다음 완전히 그들을 봉인.</li>
	<li>형광 신호 수 있습니다 몇 시간 후 표 백제 이후 가능한 한 빨리 형광 또는 confocal 현미경 샘플을 분석.</li>
</ol> 2. Immunoprecipitation <ol><li>분리 및 수로 셀 1.2와 1.3 단계에서 설명한.</li>
	<li>는 HEK293T 셀을 사용 하는 경우 15 cm 배양 접시에서 각 조건에 대 한 4 백만 셀 씨. N2A 세포를 사용 하는 경우 15 cm 배양 접시에 5 백만 셀 씨. 37 ° C에서 CO 2 배양 기에서 세포 실험의 끝까지 품 어.</li>
	<li>치료 관련 약물 또는 정의 된 기간에 대 한 조건 셀을 셀의 총 보육 시간 48 h.를 초과 하지 않는 
	참고:이 연구에서 immunoprecipitation 테스트에 대 한 세포 치료 Torin 1 3 h (250 nM), rapamycin 16 h (200 nM), 및 EBSS 가진 2 h. 10 %FBS 컨트롤로 셀에 추가 된 DMEM.</li>
	<li>후 48 h 총 보육 시간, 미디어를 제거 하 고 세포를 수확. HEK293T 셀 접시에서 쉽게 분리, 이후 얼음 접시 세척 차가운 PBS 수 있습니다 수확에 적합. 그러나, N2A 셀은 더 강한 분리; 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 수확 하는 데 도움이.
	<ol><li>Microcentrifuge 튜브에 있는 모든 셀을 수집.</li>
	</ol></li> <li>4 ° C. 삭제는 상쾌한 세척 다시 pipetting으로 일시 중단 하 여 1 mL PBS 가진 펠 릿에서 15 분 동안 16000 x g에서 원심 분리기 샘플.</li>
	<li>원심 분리기 단계를 반복 하지만 15 분에 4 ° C에서 높은 원심 분리기 속도에 상쾌한 삭제.</li>
	<li>실험을 시작 하기 전에 준비 라디오 면역-강 수 분석 결과 (RIPA) 버퍼. 
	참고: RIPA 버퍼;의 3 종류가 있습니다. (아래 수식 참조) 하는 것을 조사 되 고 단백질의 상호 작용 강도 따라 선택 합니다.
	<ol><li>강한 단백질-단백질 상호 작용은, 정규 RIPA 버퍼를 선택 하십시오.</li>
		<li>상호 작용은 약한 경우 가벼운 RIPA 또는 온화한 RIPA 선택. 
		참고: 이러한 버퍼 조리법 다음 단계에 있습니다. Immunoprecipitation 테스트에 사용 되는 모든 버퍼 protease 억제제와 함께 보충 해야 합니다.
		<ol><li>50 mM Tris pH 8에에서 1 %NP-40, 150 mM NaCl, 0.5% 나트륨 deoxycholate, 및 0.1% 나트륨 라우릴 황산 염을 사용 하 여 일반 RIPA 버퍼 준비.</li>
			<li>50 mM Tris pH 7.5에에서 1 %NP-40, 150 mM NaCl, 및 0.25% 나트륨 deoxycholate를 사용 하 여 가벼운 RIPA 버퍼 준비.</li>
			<li>50 mM Tris pH 7.4에에서 1% 트리톤 X 100, 137 mM NaCl, 1% 글리세롤과 1mm 나트륨 orthovanadate를 사용 하 여 온화한 RIPA 버퍼 준비.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>적절 한 RIPA 버퍼를 선택한 후 보충 protease 억제제 (RIPA +)와 버퍼. 다음, RIPA + 셀 펠 릿의 볼륨 x 3 세포를 lyse.</li>
	<li>소용돌이 15에 대 한 서 스 펜 션 5 분 소용돌이 장식 5 번 반복 하 고 다음 15 분 동안 16000 x g에서 샘플 4 원심 s. 얼음에 그것을 계속 ° c.</li>
	<li>깨끗 한 microcentrifuge 튜브와 나머지 세포 파편을 제거 하는 원심 분리기에는 상쾌한 전송. 깨끗 한 튜브에 상쾌한 전송.</li>
	<li>단백질 lysates 1시 50분을 희석 하 고 빈와 표준 96 잘 접시를 준비 합니다. 샘플 희석.
	20: <ol><li>브래드와 혼합 샘플 솔루션 1. 어둠 속에서 15 분 동안 품 어.</li>
		<li>595 nm 파장에서 광학 밀도 측정합니다. 각 샘플에 대 한 흡 광도 값을 사용 하 여 단백질 농도 계산.</li>
	</ol></li> <li>셀, 수확 전에 하루는 관심사의 단백질에 항 체와 단백질 A 플러스 구슬 커플.
	<ol><li>커트가 위를 사용 하 여 200 µ L 팁의 가장자리 및 비드 슬러리에서 25 µ L를 사용 하 여 각 조건에 대 한.</li>
		<li>1 mL PBS와 함께 한 번, 한 번 1 mL RIPA 버퍼와 함께 한 번 1 mL RIPA + 구슬 세척. 3300 x g, 1 분에 4 ° C에 세척 단계 수행</li>
		<li>마지막 세척 후 구슬에 RIPA + 300 µ L을 추가 하 고 1.5 µ g 항 체에 내려 오게 될 단백질에 관련 된 추가.</li>
		<li>품 어 회전 (20 회전/분)에 4 ° C에서 하룻밤 튜브. 
		참고: 여기에서, ATG5는 특정 안티-ATG5 항 체를 사용 하 여 immunoprecipitated.</li>
	</ol></li> <li>항 체와 구슬의 하룻밤 배양 후 씻어 PBS와 한 번, 한 번 RIPA와 함께 한 번 RIPA + 구슬 2.12.2 단계에서 설명한 대로.</li>
	<li>추가 2 mg 단백질 각 구슬에 lysate의 조건 하 고 총 볼륨 RIPA + 버퍼/튜브와 300 µ L. 4에는 회전자에 하룻밤 튜브를 품 어 ° c.</li>
	<li>는 부 화 후 앞에서 설명한 구슬 (단계 2.12.2) 세척.
	<ol><li>마지막 세척 후 사용 하 여 작은 피펫으로 팁 구슬 건드리지 않고 모든 상쾌한 제거.</li>
		<li>염료 로드 x 3의 추가 10 µ L: 6 %SDS, 30% 글리세롤, 16% β-Mercaptoethanol, 및 1 M Tris HCl pH 6.8에서에서 0.1 %Bromophenol 블루.</li>
	</ol></li> <li>각 조건에 대해 적어도 100 µ g 단백질 lysate를 사용 하 여 입력된 컨트롤을 준비. 물을 사용 하 여 샘플 볼륨을 균일화 하 고 염료를 로드 x 3의 적절 한 볼륨 추가.</li>
	<li>10 분 동안 95 ° C에서 종 샘플 
	참고: 일반적으로 샘플을 끓는 때 튜브의 캡 수 저절로 열고 샘플 손실 됩니다. 특정 모자 차단제와 모자를 눌러이 문제를 방지.</li>
	<li>스핀 샘플 및 표준 프로토콜을 사용 하 여 그들의 크기에 따라 단백질을 SDS 페이지 젤에 부하. 
	참고:이 연구에서 RACK1 및 ATG5에, 샘플 12 %polyacrylamide 젤 80 V 30 분 그리고 약 90 분 동안 120 V에서 통해 실행 했다. 그러나, LC3 같은 작은 단백질에 대 한 15 %polyacrylamide 젤을 사용 하 여 더 적당 하다.</li>
	<li>젤 실행 완료 한 후 니트로 또는 PVDF 막 중 습식 또는 세미 드라이 전송 방법을 사용 하 여 단백질을 전송 합니다. 그런 다음 0.05%와 PBS에서 5% 비-지방 우유에 외피에 의해 세포 막 차단 트윈 20 (PBST) 1 h. 세척 세포 막에 대 한 실 온에서 3 시간 5 분에 대 한 PBST와</li>
	<li>실 온에서 1 h에 대 한 작동 농도에서 1 차 항 체를 막 품 어. 1 차적인 항 체 희석에 대 한 사용 빨간 솔루션을 포함 하는 BSA (5% BSA Cohn V 분수, PBST, pH 7.5;에 0.02% 나트륨 아 지 드 페 놀 레드 산도 표식으로 추가 추가) 항 체의 재사용을 허용 하도록. 
	참고: 예를 들어 빨간색 솔루션에서 ATG5 항 체 2000 x 희석.
	<ol><li>보육 시간의 끝에, PBST와 3 번 막 세척.</li>
	</ol></li> <li>HRP 활용 된 이차 항 체 5% 비-지방 우유 솔루션에서 준비 했다와 막 품 어 (여기, 안티-토끼 IgG 1:10.000에서 사용 되었다). 다음 씻어 막 3 5 분에 대 한 PBST x</li>
	<li>만들 ECL 솔루션: 25mm luminol, 9 mM coumaric 산, 70 mM Tris HCl pH 8.8에에서 3 x 10 -4% H 2 O 2. 각 실험에 대 한 신선한 H 2 O 2를 사용 하 여. 
	참고: 반응 시작 후 H 2 O 2 추가 하 고 그것은 약 20 분 동안 계속.
	<ol><li>멤브레인을 품 어 고 ECL에 20 분에 대 한 영화를 x-선. 개발 하 고 어두운 방에 수정.</li>
	</ol></li> <li>닫기 또는 중복 분자 무게 단백질의 co immunoprecipitation를 확인, 그것은 막 벗기는 버퍼에서 30 분 동안 60 ° C에서 배양 하 여 세포 막에서 항 체를 제거 해야 할 수 있습니다: (25mm Tris HCl pH 2와 1 %SDS).</li>
	<li>반복 단계 2.20 2.23 공동-immunoprecipitation 다른 항 체를 사용 하 여 확인. 예를 들어 다음 ATG5 검출과 세포 막의 스트립, RACK1 단백질 안티-RACK1 1 차 항 체 (1:1, 000) 및 2 차 항 체 (1:10, 000)을 사용 하 여 동일한 막에 시험 되었다. Β-말라 로드 제어;로 사용 IgG 신호 immunoprecipitated 샘플 로드 제어로 사용 되었다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+and+pathological+significance+of+the+molecular+cross-talk+between+autophagy+and+apoptosis.">Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis.</a> Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).</li><li>Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIR376A+is+a+regulator+of+starvation-induced+autophagy.">MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy.</a> PLoS One. 8, e82556 (2013).</li><li>Itah, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+cavitation+kills+prostate+cells+and+ablates+benign+prostatic+hyperplasia+tissue.">Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue.</a> Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).</li><li>Gozuacik, D., Kimchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+as+a+cell+death+and+tumor+suppressor+mechanism).">Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism).</a> Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).</li><li>Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+IBMPFD-related+P97/VCP+mutation+with+differential+binding+pattern+and+subcellular+localization.">A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).</li><li>Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy-related+gene,+TdAtg8,+in+wild+emmer+wheat+plays+a+role+in+drought+and+osmotic+stress+response.">Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response.</a> Planta. 236, 1081-1092 (2012).</li><li>Longatti, A., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+trafficking+and+autophagosome+formation.">Vesicular trafficking and autophagosome formation.</a> Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).</li><li>Erbil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RACK1+Is+an+Interaction+Partner+of+ATG5+and+a+Novel+Regulator+of+Autophagy.">RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy.</a> J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).</li><li>Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticancer+use+of+nanoparticles+as+nucleic+acid+carriers.">Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers.</a> J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).</li><li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+methods+for+detection+and+analysis.">Protein-protein interactions: methods for detection and analysis.</a> Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).</li><li>Uetz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+analysis+of+protein-protein+interactions+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 403, 623-627 (2000).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Immunoprecipitation 및 면역 형광 기법 단백질 단백질 상호 작용의 연구에 대 한 중요 한 있습니다. 이러한 두 가지 기술을 일반적으로 사용 되 고 잘 설립, 비록 몇 가지 기준은 이러한 기법을 사용 하는 동안 실험의 품질을 정의 하 고려 되어야 한다.
이 테스트에서 사용 되는 첫 번째, 1 차 항 체는 관심사의 단백질에 특정 해야 합니다. 을 보장 하기 위해이 테스트에 항 체의 특이?...

Macroautophagy (autophagy, 여기) 대량 세포질, 단백질과 autophagic vesicles 라는 이중 막 소포에서 세포의 격리에 의해 특징입니다 세포 스트레스 메커니즘입니다. 이중 막의 외부 층의 융합을 통해 autophagic 소포 및 그들의 화물 리소좀에 배달 되 고 거기에1저하. Autophagy 모든 세포 유형 및 단백질 저하 등 (예, 미토 콘 드리 아) 세포 기관이 회전율 homeostatic 기능을 수행 하는 모든 유기 체에 낮은 기저 수준에서 발생 합니다. 기아, 같은 세포질 긴장에 지도 하는 조건 하에서 autophagy 빠르게 upregulated 이며 기본 대사1,2,3에너지 레벨을 유지 하기 위해 셀 수 있습니다.
누 룩에서 복제 되어 약 30 autophagy 유전자와 단백질 제품 autophagic 과정, 소포 nucleation, 확장, 늦은 endosome/리소좀, 및 화물 저하 기 퓨전 등의 다양 한 단계에서 역할을 표시 했다 4 , 5.이 유전자의 대다수의 Orthologs 확인 되었습니다 및 그들의 세포질 기능6의 보존을 확인 하는 다양 한 유기 체에 연구. 지난 10 년간에서 연구 보여주었다 여러 autophagy 관련 단백질 복합물 및 단백질-단백질 상호 작용 및 그들은 복잡 하 고 제어 방식 autophagy 통로 지배. 교차로, 백업, 피드백, 피드 포워드 메커니즘 존재, 그리고 다른 관련된 이벤트 (예: 기공을 분 비, 리소좀 속, endosomal 정렬 및 전송7, 등)와 autophagy 조정 셀 수 미끼로 autophagy 단백질 ATG5를 사용 하 여 편견된 효 모 2 잡종 스크린에서 (ATG5는 기아에서 LC3 lipidation 중재 e 2와 같은 conjugating 시스템에 관련 된 주요 autophagy 단백질 유도 autophagy), 수용 체 활성화 확인 했습니다 C-키 1 (RACK1; GNB2L1) 강한 interactor 및 소설 autophagy 구성 요소8. 중요 한 것은, 화면이 보였다 ATG5 RACK1 상호 작용 autophagy 클래식 inducers (즉, 기아와 mTOR 억제)에 의해 autophagy 유도 불가결 이었다.
면역 형광 검사 기반 방법 일반적으로 단백질 단백질 상호 작용을 모니터링 하는 데 사용 됩니다. 이 기술은 주로 항 체 기반 하 고 상호 작용을 시각화 하 고 세포질 지 방화를 확인 하는 데 도움이. 이 기술에서는, 형광 태그 활용 된 항 체 관련 된 관심사의 단백질은 일반적으로 특정 얼룩에 사용 됩니다. 각 단백질 다른 형광 성 염료를 결합 하는 항 체와 함께 표시 될 수 있습니다. 단백질-특정 항 체를 사용 하 여 이미지 병합 되 면 신호에 겹치는 confocal 현미경 검사 법에서 단백질의 공동 지역화를 나타냅니다. 기술은 셀 이나 심지어 조직에 적용 됩니다. 면역 형광 검사 기술을 상호 역학에 대 한 단서를 제공 하 고 크기와 다른 조건9에서 세포 형태학에 있는 일반적인 변화를 추적 하는 동안 단백질 복합물의 분포를 식별 하는 데 도움이. Immunoprecipitation는 다른 일반적으로 사용 되 항 체 기반 기술 상호 작용의 분석에 대 한 수 사이 주어진 단백질10. 이 기술을 사용 하 여, 관심사의 단백질 격리 된 셀에서 또는 조직 추출 단백질 복잡 한 또는 관심사의 단백질 접촉의 강 수의 결과로 특정 항 체를 사용 하 여. 공동-immunoprecipitation, 단백질 및 그것의 공동 interactor는 검색 뿐만 아니라 두 개의 단백질 사이 상호 작용을 보여 하지만 다른 상황11에서 상호 작용의 그것의 힘을 측정할 수 있습니다.
이 프로토콜은 확인 하 고 특성을 ATG5-RACK1 및 RACK1 LC3 상호 작용 하는 데 사용 된 세부 핵심 기술에 설명 합니다. 초점은 중요 한 단계 및 함정 autophagy 연구로 해결의 강조와 함께 면역 형광 및 immunoprecipitation 기술에 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Trypsin EDTA Solution A</td><td>Biological Industries&amp;nbsp;</td><td>BI03-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GE Healthcare</td><td>SH-30256.01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (high glucose)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>5671</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (low glucose)</td><td>Sigma</td><td>5546</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Sigma</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>coverslides</td><td>Jena Bioscience</td><td>CSL-103</td><td></td></tr><tr><td>slides</td><td>Isolab</td><td>I.075.02.005</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Torin</td><td>Tocris</td><td>4247</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>VWRSAD2650</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Biological Industries&amp;nbsp;</td><td>BI02-010-1A</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>15812-7</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;A4503</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>LC3 Antibody</td><td>Sigma</td><td>L7543</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568</td><td>&amp;nbsp;Invitrogen</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>RACK1 Antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>&amp;nbsp;sc-17754</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488</td><td>&amp;nbsp;Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Applichem</td><td>A16694.0250</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Applichem</td><td>A9242.5000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td><td>Biochemika</td><td>A2572</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>4975</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>ATG5 Antibody</td><td>Sigma</td><td>A0856</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Applichem</td><td>A4453</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1108.0250</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A3640.0005</td><td></td></tr><tr><td>Non-Fat milk</td><td>Applichem</td><td>A0830</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Riedel de Haen</td><td>13412</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>114537-5G</td><td></td></tr><tr><td>anti-rabbit IgG , HRP conjugated</td><td>Jackson Immuno.&amp;nbsp;</td><td>1110305144</td><td></td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Fluka</td><td>9253</td><td></td></tr><tr><td>Coumeric Acid</td><td>Sigma</td><td>C9008</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Merck</td><td>K35522500604</td><td></td></tr><tr><td>anti mouse IgG, HRP conjugated</td><td>Jackson Immuno.</td><td>115035003</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-Actin Antibody</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>Normal rabbit serum</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2027</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;R0395</td><td></td></tr><tr><td>Protein A-Agarose Beads</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2001</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin solution</td><td>Biological Industries&amp;nbsp;</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>Biological Industries&amp;nbsp;</td><td>BI03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Solution</td><td>Sigma</td><td>6916</td><td></td></tr><tr><td>Nitocellulose membrane</td><td>GE Healthcare</td><td>A10083108</td><td></td></tr><tr><td>X-ray Films</td><td>Fujifilm</td><td>47410 19289</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr></tbody></table>

study of protein-protein interactions in autophagy research

단백질 단백질 상호 작용 이해 셀룰러 신호 폭포 및 식별 소설 통로 구성 요소 단백질 역학 중요 하다. 세포 활동의 대부분 필요 단백질 사이 육체적 인 상호 작용. 분석 하 고 이러한 상호 작용 지도, 다양 한 실험적인 기술 뿐만 아니라 생물 정보학 도구 개발 되었다. Autophagy는 영양 부족, 화학 물질 및 산소를 포함 하 여 다른 스트레스에 대처 하기 위해 셀 수 있도록 메커니즘을 재활용 휴대. Autophagy 관련 신호 이벤트를 더 잘 이해 하 고 단백질 복합물에서 autophagy 조절 하는 새로운 요소를 발견, 우리는 단백질 단백질 상호 작용 화면을 수행. 이러한 심사 결과의 유효성 검사에는 면역 형광 및 immunoprecipitation 기술을 사용을 해야합니다. 이 시스템에서 우리가 발견 특정 autophagy 관련 된 단백질-단백질 상호 작용은 Neuro2A에서 테스트 되었습니다 (N2A) 및 HEK293T 세포 라인. 이 시각된 실험 종이에 사용 되는 기술 절차의 세부 사항 설명 합니다.

그림 1 공동 지역화의 예제에서에서이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 결과 표시 됩니다. 우리의 최근 종이에서 그림8을표시 됩니다. 여기, 내 생 RACK1 단백질은 녹색, 스테인드 생 LC3 빨간색으로 얼룩진 했다 하는 동안. 병합 된 사진에서 관찰 되는 노란색 점 녹색과 적색 신호 사이 오버랩의 사이트를 나타냅니다. 따라서 노란색 점 들이 두 가지 단백질의 부분 ...

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Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

여기는 두 항 체 기반 단백질-단백질 상호 작용 연구 기법 제시: 면역 형광 및 immunoprecipitation. 이 기술은 물리적 상호작용 단백질 세포질 신호 통로의 소설 구성 요소의 발견 및 이해 단백질 역학 공부 위해 적당 하다.

단백질 단백질 상호 작용 Autophagy 연구에서의 연구

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

study-of-protein-protein-interactions-in-autophagy-research

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K 조회수.  Sabanci University. 여기는 두 항 체 기반 단백질-단백질 상호 작용 연구 기법 제시: 면역 형광 및 immunoprecipitation. 이 기술은 물리적 상호작용 단백질 세포질 신호 통로의 소설 구성 요소의 발견 및 이해 단백질 역학 공부 위해 적당 하다. 

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Exploring the Regulation of Lipid Droplet Catabolism through Lipophagy

Macroautophagy, commonly referred to as autophagy, is a highly conserved cellular process responsible for the degradation of cellular components. This process is particularly prominent under conditions such as fasting, cellular stress, organelle damage, cellular damage, or aging of cellular components. During autophagy, a segment of the cytoplasm is enclosed within double-membrane vesicles known as autophagosomes, which then fuse with lysosomes. Following this fusion, the contents of autophagosomes undergo non-selective bulk degradation facilitated by lysosomes. However, autophagy also exhibits selective functionality, targeting specific organelles, including mitochondria, peroxisomes, lysosomes, nuclei, and lipid droplets (LDs). Lipid droplets are enclosed by a phospholipid monolayer that isolates neutral lipids from the cytoplasm, protecting cells from the harmful effects of excess sterols and free fatty acids (FFAs). Autophagy is implicated in various conditions, including neurodegenerative diseases, metabolic disorders, and cancer. Specifically, lipophagy -- the autophagy-dependent degradation of lipid droplets -- plays a crucial role in regulating intracellular FFA levels across different metabolic states. This regulation supports essential processes such as membrane synthesis, signaling molecule formation, and energy balance. Consequently, impaired lipophagy increases cellular vulnerability to death stimuli and contributes to the development of diseases such as cancer. Despite its significance, the precise mechanisms governing lipid droplet metabolism regulated by lipophagy in cancer cells remain poorly understood. This article aims to describe confocal imaging acquisition and quantitative imaging analysis protocols that enable the investigation of lipophagy associated with metabolic changes in cancer cells. The results obtained through these protocols may shed light on the intricate interplay between autophagy, lipid metabolism, and cancer progression. By elucidating these mechanisms, novel therapeutic targets may emerge for combating cancer and other metabolic-related diseases.

Lipophagy is a selective form of autophagy that involves the degradation of lipid droplets. Dysfunctions in this process are associated with cancer development. However, the precise mechanisms are not yet fully understood. This protocol describes quantitative imaging approaches to better understand the interplay between autophagy, lipid metabolism, and cancer progression.

Lipophagy를 통한 지질 방울 이화작용의 조절 탐구

Macroautophagy, commonly referred to as autophagy, is a highly conserved cellular process responsible for the degradation of cellular components. This ...

연구

암 연구학

<meta charset="utf8"></head><body>리소좀 융합이 손상된 자가포식에서 LC3-II-양성 EV 방출 평가

Evaluation of LC3-II Release via Extracellular Vesicles in Relation to the Accumulation of Intracellular LC3-positive Vesicles

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf cytoplasmic contents, subsequently fusing with lysosomes for degradation. Beyond the canonical role, autophagy-related genes also modulate a secretory pathway involving the release of inflammatory molecules, tissue repair factors, and extracellular vesicles (EVs). Notably, the process of disseminating pathological proteins between cells, particularly in neurodegenerative diseases affecting the brain and spinal cord, underscores the significance of understanding this phenomenon. Recent research suggests that the transactive response DNA-binding protein 43 kDa (TDP-43), a key player in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration, is released in an autophagy-dependent manner via EVs enriched with the autophagosome marker microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B-II (LC3-II), especially when autophagosome-lysosome fusion is inhibited.
To elucidate the mechanism underlying the formation and release of LC3-II-positive EVs, it is imperative to establish an accessible and reproducible method for evaluating both intracellular and extracellular LC3-II-positive vesicles. This study presents a detailed protocol for assessing LC3-II levels via immunoblotting in cellular and EV fractions obtained through differential centrifugation. Bafilomycin A1 (Baf), an inhibitor of autophagosome-lysosome fusion, serves as a positive control to enhance the levels of intracellular and extracellular LC3-II-positive vesicles. Tumor susceptibility gene 101 (TSG101) is used as a marker for multivesicular bodies. Applying this protocol, it is demonstrated that siRNA-mediated knockdown of syntaxin-6 (STX6), a genetic risk factor for sporadic Creutzfeldt-Jakob disease, augments LC3-II levels in the EV fraction of cells treated with Baf while showing no significant effect on TSG101 levels. These findings suggest that STX6 may negatively regulate the extracellular release of LC3-II via EVs, particularly under conditions where autophagosome-lysosome fusion is impaired. Combined with established methods for evaluating autophagy, this protocol provides valuable insights into the role of specific molecules in the formation and release of LC3-II-positive EVs.

<meta charset="utf8"></head><body>세포 내 LC3 양성 소포의 축적과 관련하여 세포외 소포를 통한 LC3-II 방출 평가

Here, we present the methodology for concisely assessing autophagosome marker LC3-II levels in extracellular vesicles (EVs) by immunoblotting. Analysis for LC3-II levels in EVs, autolysosome formation, and omegasome formation suggests the new role of STX6 in the release of LC3-II-positive EVs when autophagosome-lysosome fusion is inhibited.

세포 내 LC3 양성 소포의 축적과 관련하여 세포외 소포를 통한 LC3-II 방출 평가

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf ...

생화학

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

생물학

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Autophagy activation is beneficial in the prevention of a number of diseases. One of the physiological approaches to induce autophagy in vivo is physical exercise. Here we show how to activate autophagy by aerobic exercise and measure autophagy levels in mice.

마우스에 유산소 운동에 의해 자식 작용을 활성화

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via the lysosome and are recycled. During autophagy, cytoplasmic LC3 protein is lipidated and recruited to the autophagosomal membranes. The autophagosome then fuses with the lysosome to form the autolysosome, where the breakdown of the autophagosome vesicle and its contents occurs. The ubiquitin-associated protein p62, which binds to LC3, is also used to monitor autophagic flux. Cells undergoing autophagy should demonstrate the co-localization of p62, LC3, and lysosomal markers. Immunofluorescence microscopy has been used to visually identify LC3 puncta, p62, and/or lysosomes on a per-cell basis. However, an objective and statistically rigorous assessment can be difficult to obtain. To overcome these problems, multispectral imaging flow cytometry was used along with an analytical feature that compares the bright detail images from three autophagy markers (LC3, p62 and lysosomal LAMP1) and quantifies their co-localization, in combination with LC3 spot counting to measure autophagy in an objective, quantitative, and statistically robust manner.

Here, multispectral imaging flow cytometry with an analytical feature that compares bright detail images of 3 autophagy markers and quantifies their co-localization, along with LC3 spot counting, was used to measure autophagy in an objective, quantitative, and statistically robust manner.

Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. The malfunction of autophagy is associated with aging and multiple human diseases. The autophagy machinery is highly conserved-from yeast to humans.&#160;The larval fat body of Drosophila melanogaster, an analog for vertebrate liver and adipose tissue, provides a unique model for monitoring autophagy in vivo. Autophagy can be easily induced by nutrient starvation in the larval fat body. Most autophagy-related genes are conserved in Drosophila. Many transgenic fly strains expressing tagged autophagy markers have been developed, which facilitates the monitoring of different steps in the autophagy process. The clonal analysis enables a close comparison of autophagy markers in cells with different genotypes in the same piece of tissue. The current protocol details procedures for (1) generating somatic clones in the larval fat body, (2) inducing autophagy via amino acid starvation, and (3) dissecting the larval fat body, aiming to create a model for analyzing differences in autophagy using an autophagosome marker (GFP-Atg8a) and clonal analysis.

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

The present protocol describes the induction of autophagy in the Drosophila melanogaster larval fat body via nutrient depletion and analyzes changes in autophagy using transgenic fly strains.

Drosophila melanogaster 유충 지방체에서 기아로 인한 자가포식 분석

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

단백질 단백질 상호 작용 Autophagy 연구에서의 연구

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고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

마우스에 유산소 운동에 의해 자식 작용을 활성화

Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동

Drosophila melanogaster 유충 지방체에서 기아로 인한 자가포식 분석