Name: activating autophagy by aerobic exercise in mice
Uploaded: 2017-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice at JoVE.com

We thank the Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratoryfor technical support and assistance, and Noboru Mizushima (University of Tokyo) for providing GFP-LC3 transgenic mice. A. R. and C. H. were supported by the startup funds from Northwestern University and the grant from National Institutes of Health (DK094980).

동물과 관련된 모든 절차는 노스 웨스턴 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인 지침에 따라 수행 하였다. 1. 마우스 모델 <ol><li> 운동 훈련에 8~12주 된 마우스를 사용합니다. 생체 내에서 행사에 의한 자식 작용을 감지하기 위해 영상 검사, 생화학 적 분석을위한 C57BL / 6 마우스의 GFP-LC3 형질 전환 마우스 (C57BL / 6 배경)를 사용합니다. </li></ol> 2. 운동에 의한 자식 작용 <ol><li> 러닝 머신 설치 - 강제 운동 <ol><li> 적응 및 2 일 동안 10 ° 오르막 오픈 러닝 머신에서 쥐를 훈련. 1 일에서 5 분 동안 마우스를 운동 8m / min으로하고, 2 일, 10m 또 다른 5 분 뒤에 8m / 분에서 5 분 동안 마우스를 운동 / 10 분. 부드러운 손을 찔러으로 실행하기 위해 쥐를 격려한다. </li><li> 3 번째 날에, 마우스는 10 ° 오르막 디딜 방아, starti에 90 분 동안 실행하는 하나의 한판 승부를 받아야 할10m / 분의 속도로 ng를. 40 분 후, 30 분의 총 1m / 분으로 10 매 분의 속도로 러닝 머신 속도를 증가시키고, 다음의 비율로 속도를 증가 1m /가 될 때까지 매 5 분 분 17m / 분 운동 시간 90 분 거리를 실행 1,070m의 총. </li><li> 낮은 강도 범위 (1.2 Hz에서)에 전기 자극을 설정하고 반복 발 충격을 방지하기 위해 실행하는 마우스 바랍니다. </li><li> 조직 컬렉션의 경우, 즉시 운동 후 자궁 전위 다음 이소 플루 란 흡입 쥐를 안락사. 기타 승인 안락사 방법은 또한 CO2 또는 다른 마취제 IP 주입이 사용될 수있다. 자식 작용의 수준은 안락사의 방법에 의해 영향을받는 것으로 보이지 않는다. </li></ol></li><li> 실행 휠 설정 - 자발적인 운동 <ol><li> 단일 보관 마우스로 케이지 안에 마우스 실행 휠 (11.4 cm 직경)을 놓습니다. </li><li> 자전거 주행 거리계를 사용하여 실행중인 용량을 확인합니다.358에서 [휠의 전체 회전 당 (mm)에 거리] 휠 매개 변수를 설정 (11.4 * π). 24 시간 후 주행 거리를 측정한다. </li><li> 마우스가 실행중인 휠 2 주 동안 자발적으로 실행할 수 있습니다. 조직 컬렉션의 경우, 실행 기간 후 아침에 마우스를 희생. </li></ol></li></ol> 3. 자식 작용 플럭스 평가 <ol><li> 휴식과 운동 조건에서 autophagic 플럭스를 측정하기 위해, 삼일의 자식 작용 억제제 클로로퀸과 쥐를 치료하고 PBS로 처리 된 마우스에 비교합니다. <ol><li> PBS (5 ㎎ / ㎖)에 클로로퀸을 용해하고, 복강 세 일 연속 50 ㎎ / ㎏ / 일의 용량으로 마우스로 클로로퀸을 주입. 쥐를 희생 마지막 주사 후 조직에게 3 시간을 수집합니다. </li><li> 운동 생쥐를 들어 50 ㎎ / ㎏ / 일의 투여 량으로 개의 연속 일 클로로퀸 그들을 전처리. 셋째 날, 후 클로로퀸의 동일한 농도로 마우스를 주입하고,90 분은 그들에게 또 다른 90 분 동안 러닝 머신에서 실행 할 수 있습니다. </li><li> 자궁 경부 전위 다음에 이소 플루 란 흡입 쥐를 안락사. 클로로퀸의 총 배양 시간 제어 (휴식) 마우스 (3 시간)과 동일 있도록 즉시 실행 한 후 조직을 수집합니다. 주 : 또는 마우스 조직에서 자식 작용 플럭스를 결정 클로로퀸의 단일 주입을 사용한다. </li></ol></li></ol> 4. 조직 수확 및 고정 <ol><li> 7.4의 최종 pH에서 PBS에서 : 조직 수확에 앞서 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)와 신선한 4 % 파라 포름 알데히드 (필수 개인 보호 장비 PFA주의)을 준비합니다. 4 ° C에서 두 솔루션을 저장합니다. </li><li> (GFP-LC3 마우스 용) 4 % PFA 20 ㎖ - 15 30 ML의 주사기를 입력합니다. 20 G 카테터 바늘과 주사기를 연결합니다. </li><li> 운동 후, 자궁 경부 전위 다음에, 이소 플루 란 흡입하여 쥐를 안락사. </li><li> 그 바에서 깨끗한 작업 표면에 동물을 배치CK. 잘라 마음을 노출 다이어프램을 절단하여 흉강을 엽니 다. </li><li> 폐와 간은 완전히 창백 설정 될 때까지, 피가 나올 수 있도록 간장에 작은 절개를 확인하고 카테터를 통해 심장의 우심실로 천천히 15 ml의 4 % PFA의 총을 주입. / hr로 90 ㎖로 일정 유량 주사기 펌프를 이용하여 운동 세션 직후 마우스 관류. </li><li> 재관류 후, 바늘을 제거하고 관심 조직 (예 : 뇌 (11)과 골격근)를 수집합니다. 골격근의 경우, 광근 lateralis을 해부하다. 간략하게, 대퇴사 지역화 근육을 노출 뒤쪽 다리의 피부를 당겨 12 대퇴 및 대퇴골의 상부에 부착 된 외부 근육이다 광근 lateralis를 해부. </li><li> 또한 고정 및 탈수를 들어, 4 ° C에서 24 시간 동안 4 % PFA에 GFP-LC3 마우스의 조직을 배치 한 다음 15 %로 전송4 ° C에서 자당 PBS 하룻밤 또는 조직이 정착 될 때까지 다음 밤새 4 ° C에서 30 % 자당 PBS에 이상 저장. 그들은 강한 빛에 민감 할 수 있으므로 가능한 한 많은 어둠 속에서 샘플을 보관하십시오. </li><li> 웨스턴 블롯 분석을 위해 액체 질소에 직접 C57BL / 6 마우스에서 조직을 동결하고, -80 ° C에서 보관 웁니다. </li></ol> GFP-LC3 puncta의 5. 이미징 분석 <ol><li> 조직 프로세스 <ol><li> 같은 레이블이 작은 페트리 접시에 몇 분 동안 &quot;최적의 절단 온도 화합물&quot;OCT ()와 같은 매체를 포함에서 조직 (이전 PFA에 고정 30 % 자당에 저장)을 사전 처리합니다. </li><li> 조직을 충당하기에 충분한 신선한 OCT를 포함하는 표시 cryomold에 조직을 전송합니다. 방향을 cryomold의 아래쪽으로 절편 표면합니다 (광근의 크로스 섹션은 헤미 - 두뇌 근육과 시상 부분을 lateralis). 거품의 형성을 피할 것. </li><li> FREOCT를 흰색으로 바뀔 때까지, 드라이 아이스를 가득 덮여 거품 쿨러에 몇 분 동안 cryomold을 배치하여 샘플을 EZE. 레이블 포일에서 개별 샘플을 감싸 비닐 봉투에 밀봉하고,에서 -80 ° C 하룻밤 이상을 저장할 수 있습니다. </li><li> 슬라이드에 섹션을 10 ㎛의 두께로 샘플 부분을 절단하고, 마운트 그라 이오 스탯을 사용합니다. -20 ° C에서 슬라이드를 저장하고, 항상 가능한 빛으로부터 멀리 슬라이드를 유지합니다. </li></ol></li><li> 슬라이드 준비 <ol><li> 냉동기로부터 슬라이드를 제거하고 실온에서 이들을 해동. DAPI와 매체를 장착 한 방울 조직 절편을 커버. 상단에 적절한 크기의 커버 슬립을 놓고 거품 형성을 피하기. </li><li> , 커버 슬립의 가장자리를 밀봉 매니큐어가 실온에서 어둠 속에서 건조 할 수 있도록 다음 4 ° C에서 빛 밀폐 용기에 슬라이드를 저장하거나 GFP-LC3의 puncta의의 영상 캡쳐를 진행 매니큐어를 사용합니다. </li></ol></li><li> &lt;GFP의 강한&gt; 정량 - 형광 현미경에 의한 LC3의 puncta의 <ol><li> 모든 샘플에 대해 동일한 조건에서 사진 (노출 및 설정)을 캡처, 표면 형광 현미경을 수행합니다. GFP를 들어, 525 나노 미터의 방출 파장을 사용한다; DAPI를 들어, 490 nm의를 사용합니다. 광근 lateralis에 대한 60X 목적과 뇌의 전두엽 피질 영역을 사용하여 샘플 당 10 개 이상의 이미지를 획득. </li><li> 실험군 위해 멀게 통계 분석을 위해 각각의 이미지에서 2,500 ㎛의 (2)의 조직 영역에서의 GFP-LC3 puncta의 수를 정량화. &quot;객체 카운트&quot;자동 측정 기능을 이용하여, 각 샘플의 이미지 (10)의 평균 수를 계산한다. 광근에 대한 설정 근육이 lateralis : 임계 값 L = 10, H = 200; 배는 부드러운; 1X 깨끗하고 뇌의 전두엽 피질에 대한 설정은 다음과 같습니다 임계 값 L = 11, H = 200; 배는 부드러운; 1X 깨끗한. </li></ol></li></ol> 자식 작용 마커 6. 웨스턴 블롯 분석 <ol><li> &lt;강한&gt; 조직 프로세스 <ol><li> 용해 완충액 준비한다 : 50 mM 트리스 - 염산 단계; 150 mM의 NaCl을; 1 mM의 EDTA; 1 % 트리톤 X-100; 프로테아제 억제제 및 포스 파타 아제 억제제 (새로 추가). </li><li> C 스토리지 -80 °에서 C57BL / 6 마우스의 조직을 제거합니다. 다음 공정 전에 면도날 작은 조각으로 근육 조직을 잘라. (헤미 뇌에 대한) 800 μL 또는 샘플에 차가운 용해 버퍼 (광근 lateralis 용) 500 μl를 추가합니다. 중간 속도에서 균질화 4 ° C에서 샘플 균질화. </li><li> 완전 회전 4 ° C에서 1 시간에 다른 30 분 동안 균질 혼합물을 용균. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 12,000 XG에서 균질를 스핀 다운 펠렛을 폐기하고 새로운 튜브에 뜨는를 수집합니다. </li></ol></li><li> 자식 작용 분석 <ol><li> 제조자의 규격에 따른 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 조직 용 해물의 단백질 농도를 결정한다. 각 샘플을 정상화동일한 농도. </li><li> 1에서 2 배 램 믈리 시료 완충액으로 샘플을 결합 : 1의 비율로, 5 ~ 95 ° C에서 끓인다 - 10 분, 및 P62 (항 P62 항체로, 자식 작용에 웨스턴 블롯 분석 (14), (13) 마커를 진행, 1 : 500 희석) 및 LC3 (항 LC3 항체, 1 : 500 희석). 얼음에 이상 배양이 LC3의 여러 성능이 저하 된 밴드를 생성 할 수 있으므로, 즉시 샘플 버퍼를 첨가 한 후 샘플을 끓인다. </li><li> ImageJ에 농도계를 사용하여 분석하여 P62 및 LC3 대역을 정량화하고, 대응 액틴 밴드 값을 정규화. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker.">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).</li><li>Tracy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BNIP3+is+an+RB/E2F+target+gene+required+for+hypoxia-induced+autophagy.">BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy.</a> Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).</li><li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+renovation+of+cells+and+tissues.">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li><li>Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+the+physiology+and+pathology+of+the+central+nervous+system.">Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system.</a> Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).</li><li>Rocchi, A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+autophagy+in+metabolism+and+metabolic+disorders.">Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders.</a> Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).</li><li>Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autophagy+in+cancer.">Role of autophagy in cancer.</a> Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).</li><li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+BCL2-regulated+autophagy+is+required+for+muscle+glucose+homeostasis.">Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis.</a> Nature. 481, 511-515 (2012).</li><li>He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+induces+autophagy+in+peripheral+tissues+and+in+the+brain.">Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain.</a> Autophagy. 8, 4 (2012).</li><li>Kuramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+activation+by+novel+inducers+prevents+BECN2-mediated+drug+tolerance+to+cannabinoids.">Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids.</a> Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).</li><li>Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Treadmill+Fatigue+Test:+A+Simple,+High-throughput+Assay+of+Fatigue-like+Behavior+for+the+Mouse.">The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse.</a> JoVE. , (2016).</li><li>Navone, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+human+and+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells.">Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells.</a> Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li><li>Bj&#248;rk&#248;y, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+12+Monitoring+Autophagic+Degradation+of+p62/SQSTM1.">Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1.</a> Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12, 1-222 (2016).</li><li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+the+Pathogenesis+of+Disease.">Autophagy in the Pathogenesis of Disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duration+of+rapamycin+treatment+has+differential+effects+on+metabolism+in+mice.">Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice.</a> Cell Metab. 17, 456-462 (2013).</li><li>Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoregulatory+functions+of+mTOR+inhibition.">Immunoregulatory functions of mTOR inhibition.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).</li><li>Miller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin-mediated+lifespan+increase+in+mice+is+dose+and+sex+dependent+and+metabolically+distinct+from+dietary+restriction.">Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction.</a> Aging Cell. 13, 10 (2014).</li><li>Grumati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+exercise+stimulates+autophagy+in+normal+skeletal+muscles+but+is+detrimental+for+collagen+VI-deficient+muscles.">Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles.</a> Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).</li><li>Lira, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+exercise+training-induced+skeletal+muscle+adaptation+and+improvement+of+physical+performance.">Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).</li><li>Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+not+required+to+sustain+exercise+and+PRKAA1/AMPK+activity+but+is+important+to+prevent+mitochondrial+damage+during+physical+activity.">Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity.</a> Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).</li><li>Kregel, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resource+book+for+the+design+of+animal+exercise+protocols.">Resource book for the design of animal exercise protocols.</a> American Physiological Society. , 152 (2006).</li><li>Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstrain+variation+in+murine+aerobic+capacity.">Interstrain variation in murine aerobic capacity.</a> Med Sci Sports Exerc. 33, 5 (2001).</li><li>Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximal+metabolic+rates+during+voluntary+exercise,+forced+exercise,+and+cold+exposure+in+house+mice+selectively+bred+for+high+wheel-running.">Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running.</a> The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).</li><li>Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sprint+exercise+on+oxidative+stress+in+skeletal+muscle+and+liver.">Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver.</a> European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).</li><li>Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+high-intensity+intermittent+swimming+on+glucose+transport+in+rat+epitrochlearis+muscle.">Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle.</a> J Appl Physiol. 84, 4 (1998).</li><li>Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+submaximal+oxygen+consumption+during+treadmill+running+in+mice.">Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice.</a> Can J Physiol Pharmacol. 71, 4 (1993).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

자식 작용은 에너지를 제공하고 세포질 구성 요소 나 손상된 세포 소기관의 리소좀 저하에 의해 세포 독성을 감소시키는 이화 과정이다. 자식 작용을 공부하는 것은 세포의 항상성의 조절 및 스트레스 반응의 메커니즘을 이해하는 것이 중요합니다. 새로운 모델과 방법론은 여러 병리학 적 과정 16, 17에 기여하는 방법을 손상 자식 작용 연구, 연구 분야 ...

자식 작용은 기아 저산소증 1, 2와 같은 다양한 스트레스 조건에 응답하여 유도 된 진화 적 보존 열화 경로이다. 자식 작용하는 동안 두 번 막 소포는, 불필요하거나 손상된 세포 내 구성 요소를 통합하고 분해 3 리소좀로 수송, autophagosomes을했다. 기저 자식 작용은 신경 퇴행, 종양 및 2 형 당뇨병 4, 5, 6을 포함하여 많은 질환에 연루되어 세포 기능 및 유기체 개발 및 손상된 기초 자식 작용을 위해 필수적이다. 가장 잘 알려진 생리 자식 작용의 유도는 기아이다. 그러나, 두 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 기아는, 예를 들면, 효과적으로 동물에서 자식 작용을 유도하는 쥐의 음식 제한의 48 시간을 오랜 기간 소요대부분의 기관입니다. 둘째, 기아는 거의 때문에 뇌에서 상대적으로 안정적인 영양 공급, 뇌 자식 작용을 유도한다. 사실, 많은 약물이 혈액 뇌 장벽을 통과 할 수 없기 때문에, 저분자 유도제에 의해 자식 작용 유도를 검출하는 것이 곤란하다. 따라서, 더 좋은 질병 발병 자식 작용 활성의 기능을 분석하기 위해, 최근 운동 시간 7, 8, 9 단기간에 자식 작용을 유도하는보다 강력한 생리 방법임을 발견했다. 기아와 비교할 때, 자식 작용을 효과적으로 디딜 방아 빠른 30 분을 실행하여 유도된다. 따라서, 운동은 의료 혜택을 매개 질병을 예방 자식 작용의 메커니즘을 연구하는 편리하고 강력한 생리 학적 접근 방식이다. LC3 및 P62을 포함 자식 작용 활성의 검출을위한 여러 단백질 마커가있다. LC3 (미세 소관 - 관련 단백질 1A / 1B-빛 Chain 3) 세포질 단백질이다 (LC3-I는 자식 작용의 유도에 따라 PE (포스파티딜 에탄올 아민)에 결합된다)을 형성. PE-LC3 지질 화 (LC3-II 양식) autophagosomal 막에 채용하고 GFP로 표지 때 autophagosomes을 시각화 할 수있다. 현미경에서 autophagosomes의 구조를 반점하는 세포질에서의 전위는 자식 작용 유도의 표시입니다. P62 (예 유비퀴틴 단백질 등) 자식 작용 기판 용화물 수용체이고,도 autophagosomes에 포함된다. 단백질이 autophagosomes 함께 리소좀에서 분해되기 때문에, 그 농도는 자식 작용의 플럭스를 측정하는데 사용될 수있다. 여기에서 우리는 강제 운동 (러닝 머신)과 자발적 운동 (바퀴를 실행)을 포함한 유산소 운동에 의해 유발 된 다른 마우스 조직에서 자식 작용을 정량화하기 위해 이러한 마커를 사용하는 방법을 보여줍니다. 동일한 절차가 다른 유도제의 투여 후 생체 내 자식 작용의 측정에 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Treadmill</td><td>Columbus Instruments</td><td>150-RM Exer 3/6</td><td></td></tr><tr><td>Mouse running wheel</td><td>Super Pet</td><td>100079365</td><td>diameter 11.4 cm</td></tr><tr><td>Odometer</td><td>Bell</td><td>DASHBOARD 100</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Nikon</td><td>Model: inverted microscope ECLIPSE</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 1850UV</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer</td><td>IKA</td><td>003737001 / Model: T10 Basic S1</td><td></td></tr><tr><td>Chloroquine</td><td>CAYMAN CHEMICAL COMPANY</td><td>14194</td><td></td></tr><tr><td>Parafolmaldehye</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P6148</td><td>Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer.</td></tr><tr><td>Mounting media</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>p62 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610833</td><td></td></tr><tr><td>LC3 antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

activating autophagy by aerobic exercise in mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

이 프로토콜은 유산소 운동으로 마우스 조직에서 자식 작용을 유도하는 두 가지 방법을 설명합니다 순응의 두 일까지 진행 다중 차선 러닝 머신에 강제 운동의 90 분의 총; 또는 단일 보관 마우스를 사용하는 실행중인 휠에 자발적 운동 2 주. 각각의 운동 프로토콜에서, 우리는 다양한 기관에서 형광 현미경 및 웨스턴 블롯 분석에 의한 자식 작용 플럭스를 측정 할 수 있습?...

Watch this Scientific Journal Video about Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice at JoVE.com

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

자식 작용의 활성화는 질병의 숫자의 예방에 유용하다. 생리 학적 접근 방법 중 하나는 생체 내에서 자식 작용은 운동이다 유도한다. 여기에서 우리는 유산소 운동으로 자식 작용을 활성화하고 마우스에서 자식 작용의 수준을 측정하는 방법을 보여줍니다.

마우스에 유산소 운동에 의해 자식 작용을 활성화

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

activating-autophagy-by-aerobic-exercise-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K 조회수.  Northwestern University.  자식 작용의 활성화는 질병의 숫자의 예방에 유용하다. 생리 학적 접근 방법 중 하나는 생체 내에서 자식 작용은 운동이다 유도한다. 여기에서 우리는 유산소 운동으로 자식 작용을 활성화하고 마우스에서 자식 작용의 수준을 측정하는 방법을 보여줍니다. 

비디오: Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Assessment of Murine Exercise Endurance Without the Use of a Shock Grid: An Alternative to Forced Exercise

Using laboratory mouse models, the molecular pathways responsible for the metabolic benefits of endurance exercise are beginning to be defined. The most common method for assessing exercise endurance in mice utilizes forced running on a motorized treadmill equipped with a shock grid. Animals who quit running are pushed by the moving treadmill belt onto a grid that delivers an electric foot shock; to escape the negative stimulus, the mice return to running on the belt. However, avoidance behavior and psychological stress due to use of a shock apparatus can interfere with quantitation of running endurance, as well as confound measurements of postexercise serum hormone and cytokine levels. Here, we demonstrate and validate a refined method to measure running endurance in na&#239;ve C57BL/6 laboratory mice on a motorized treadmill without utilizing a shock grid. When mice are preacclimated to the treadmill, they run voluntarily with gait speeds specific to each mouse. Use of the shock grid is replaced by gentle encouragement by a human operator using a tongue depressor, coupled with sensitivity to the voluntary willingness to run on the part of the mouse. Clear endpoints for quantifying running time-to-exhaustion for each mouse are defined and reflected in behavioral signs of exhaustion such as splayed posture and labored breathing. This method is a humane refinement which also decreases the confounding effects of stress on experimental parameters.

A method to assess exercise endurance in laboratory mice without the use of a shock grid is demonstrated. This method is a humane refinement that can decrease the confounding effects of stress on experimental parameters.

충격 그리드를 사용하지 않고 쥐과 운동 지구력의 평가 : 강제 운동에 대한 대안

Using laboratory mouse models, the molecular pathways responsible for the metabolic benefits of endurance exercise are beginning to be defined. The most ...

연구

행동분석학

Supramaximal Intensity Hypoxic Exercise and Vascular Function Assessment in Mice

Exercise training is an important strategy for maintaining health and preventing many chronic diseases. It is the first line of treatment recommended by international guidelines for patients suffering from cardiovascular diseases, more specifically, lower extremity artery diseases, where the patients' walking capacity is considerably altered, affecting their quality of life. 
Traditionally, both low continuous exercise and interval training have been used. Recently, supramaximal training has also been shown to improve athletes' performances via vascular adaptations, amongst other mechanisms. The combination of this type of training with hypoxia could bring an additional and/or synergic effect, which could be of interest for certain pathologies. Here, we describe how to perform supramaximal intensity training sessions in hypoxia on healthy mice at 150% of their maximal speed, using a motorized treadmill and a hypoxic box. We also show how to dissect the mouse in order to retrieve organs of interest, particularly the pulmonary artery, the abdominal aorta, and the iliac artery. Finally, we show how to perform ex vivo vascular function assessment on the retrieved vessels, using isometric tension studies.

High-intensity training in hypoxia is a protocol that has been proven to induce vascular adaptations potentially beneficial in some patients and to improve athletes&#39; repeated sprint ability. Here, we test the feasibility of training mice using that protocol and identify those vascular adaptations using ex vivo vascular function assessment.

Supramaximal 강도 Hypoxic 운동과 쥐에 혈관 기능 평가

Exercise training is an important strategy for maintaining health and preventing many chronic diseases. It is the first line of treatment recommended by ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

수축 성 활동 유도 된 쥐 골격 근육 Phenotypic 적응 연구 만성 자극에의 응용

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

발생학

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is provided to induce sepsis of varying severity in mice using the CLP technique. Autophagy is a fundamental tissue response to stress and pathogen invasion. Two current protocols to assess autophagy in vivo in the context of experimental sepsis are also presented here. (I) Transgenic mice expressing green fluorescence protein (GFP)-LC3 fusion protein are subjected to CLP. Localized enhancement of GFP signal (puncta), as assayed either by immunohistochemical or confocal assays, can be used to detect enhanced autophagosome formation and, thus, altered activation of the autophagy pathway. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formation per unit tissue area (as a marker of autophagy stimulation) can be quantified using electron microscopy. The study of autophagic responses to sepsis is a critical component of understanding the mechanisms by which tissues respond to infection. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the pathogenesis of sepsis, which represents a major problem in critical care medicine.

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method. Current protocols to assess autophagy in vivo in the context of CLP-induced sepsis are presented here: A protocol for measuring autophagy using (GFP)-LC3 mice, and a protocol for measuring autophagosome formation by electron microscopy.

맹장 결찰 및 마우스에서 autophagy에 공부를 모델로 패혈증 관통 유도

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

면역학 및 감염병학

Short Session High Intensity Interval Training and Treadmill Assessment in Aged Mice

High intensity interval training (HIIT) is emerging as a therapeutic approach to prevent, delay, or ameliorate frailty. In particular short session HIIT, with regimens less than or equal to 10 min is of particular interest as several human studies feature routines as short as a few minutes a couple times a week. However, there is a paucity of animal studies that model the impacts of short session HIIT. Here, we describe a methodology for an individually tailored and progressive short session HIIT regimen of 10 min given 3 days a week for aged mice using an inclined treadmill. Our methodology also includes protocols for treadmill assessment. Mice are initially acclimatized to the treadmill and then given baseline flat and uphill treadmill assessments. Exercise sessions begin with a 3 min warm-up, then three intervals of 1 min at a fast pace, followed by 1 min at an active recovery pace. Following these intervals, the mice are given a final segment that starts at the fast pace and accelerates for 1 min. The HIIT protocol is individually tailored as the speed and intensity for each mouse are determined based upon initial anaerobic assessment scores. Additionally, we detail the conditions for increasing or decreasing the intensity for individual mice depending on performance. Finally, intensity is increased for all mice every two weeks. We previously reported in this protocol enhanced physical performance in aged male mice and here show it also increases treadmill performance in aged female mice. Advantages of our protocol include low administration time (about 15 min per 6 mice, 3 days a week), strategy for individualizing for mice to better model prescribed exercise, and a modular design that allows for the addition or removal of the number and length of intervals to titrate exercise benefits.

Short session (&#8804;10 min) high intensity interval training (HIIT) is emerging as an alternative to longer exercise modalities, yet the shorter variants are rarely modeled in animal studies. Here, we describe a 10 min, 3 day a week, uphill treadmill HIIT protocol that enhances physical performance in male and female aged mice.

짧은 세션 높은 강도 간격 훈련과 세 쥐에서 디딜 방 아 평가

High intensity interval training (HIIT) is emerging as a therapeutic approach to prevent, delay, or ameliorate frailty. In particular short session HIIT, ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

근육 줄기 세포에서 Autophagy의 원위치 Immunofluorescent 얼룩

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

생물학

Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

This study aimed to explore the oxidative stress-protective effect of crocetin on H2O2-mediated H9c2 myocardial cells through in vitro experiments, and further explore whether its mechanism is related to the impact of mitophagy. This study also aimed to demonstrate the therapeutic effect of safflower acid on oxidative stress in cardiomyocytes and explore whether its mechanism is related to the effect of mitophagy. Here, an H2O2-based oxidative stress model was constructed and assessed the degree of oxidative stress injury of cardiomyocytes by detecting the levels of lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK), malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GSH Px). Reactive oxygen species (ROS)-detecting fluorescent dye DCFH-DA, JC-1 dye, and TUNEL dye were employed to assess mitochondrial damage and apoptosis. Autophagic flux was measured by transfecting Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirus. Mitophagy-related proteins were then detected via western blotting and immunofluorescence. However, crocetin (0.1-10 &#181;M) could significantly improve cell viability and reduce apoptosis and oxidative stress damage caused by H2O2. In cells with excessive autophagic activation, crocetin could also reduce autophagy flow and the expression of mitophagy-related proteins PINK1 and Parkin, and reverse the transfer of Parkin to mitochondria. Crocetin could reduce H2O2-mediated oxidative stress damage and the apoptosis of H9c2 cells, and its mechanism was closely related to mitophagy.

Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

Based on in vitro experiments, this study revealed the mechanism of crocetin in repairing oxidative stress damage of cardiomyocytes by influencing mitophagy, in which the PINK1/Parkin signaling pathway plays an important role.

PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy를 통한 Crocetin에 의한 산화 스트레스로부터 H9c2 심근 세포 보호

This study aimed to explore the oxidative stress-protective effect of crocetin on H2O2-mediated H9c2 myocardial cells through in vitro experiments, and ...

의학

T2DM 운동 중재 탐색: 생쥐를 위한 정적 훈련 장치

Static Strength Training Method for Type 2 Diabetic Mice

The treatment of type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a major difficulty in improving patient health. Exercise is one of the main interventions for T2DM. Static strength training is one of the key forms of traditional sports in China. Research shows that static strength training is an effective clinical method for T2DM intervention, but there is no experimental device suitable for static training in mice. One of the difficulties in moving from clinical to basic research is to design appropriate experimental devices. In order to further study the mechanism of static training intervention in T2DM, a simple method for making a static training device for mice is introduced in this paper. This device has the advantages of simple operation, cheap material, and high feasibility. Previous studies conducted under this protocol have shown that static training can effectively reduce blood glucose levels and improve the mitochondrial function of skeletal muscle cells in T2DM mice. The purpose of introducing this device is to promote research on the mechanism of traditional exercise in the intervention of T2DM and to lay a foundation for the quantitative intervention of exercise.

저자 스포트라이트: 생쥐의 정적 운동 훈련을 통한 당뇨병 연구 발전

This protocol provides a simple method of making static training equipment for mice. The device maintains the muscle isometric contraction of the limbs of mice so as to verify the intervention effect of traditional exercise on type 2 diabetes (T2DM) and provides new exercise therapy for the clinical treatment of T2DM.

제2형 당뇨병 마우스를 위한 정적 근력 훈련 방법

The treatment of type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a major difficulty in improving patient health. Exercise is one of the main interventions for T2DM. ...

마우스에 유산소 운동에 의해 자식 작용을 활성화

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

충격 그리드를 사용하지 않고 쥐과 운동 지구력의 평가 : 강제 운동에 대한 대안

Supramaximal 강도 Hypoxic 운동과 쥐에 혈관 기능 평가

수축 성 활동 유도 된 쥐 골격 근육 Phenotypic 적응 연구 만성 자극에의 응용

맹장 결찰 및 마우스에서 autophagy에 공부를 모델로 패혈증 관통 유도

짧은 세션 높은 강도 간격 훈련과 세 쥐에서 디딜 방 아 평가

근육 줄기 세포에서 Autophagy의 원위치 Immunofluorescent 얼룩

PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy를 통한 Crocetin에 의한 산화 스트레스로부터 H9c2 심근 세포 보호

제2형 당뇨병 마우스를 위한 정적 근력 훈련 방법

제2형 당뇨병 마우스를 위한 정적 근력 훈련 방법

제2형 당뇨병 마우스를 위한 정적 근력 훈련 방법