이 프로토콜은 아미노산 고갈을 통해 초파리 멜라노가스터 유충 지방체에서 자가포식을 유도하는 방법과 돌연변이 클론 간의 자가포식 차이를 분석하는 방법을 설명합니다. 자가포식은 배양 조건에서 영양 가용성에 매우 민감하기 때문에 동일한 조직에서 돌연변이 세포와 야생형 세포를 분석하는 방법인 클론 분석은 자가포식 결함을 해부하는 데 이점이 있습니다. 짝짓기를 위해 섭씨 25도에서 표준 옥수수 가루 또는 당밀 또는 한천 초파리 배지가 담긴 배양 바이알에 수컷 3마리와 암컷 성체 파리 15마리를 넣는 것으로 시작합니다.
유도 후 48시간이 지나면 파리가 기절할 때까지 짝짓기 바이알을 두드리고 바이알 바닥에 있는 배지에 떨어뜨립니다. 짝짓기 바이알의 플러그를 뽑고 플러그를 뽑은 거꾸로 된 배양 바이알에 신선한 배지를 꽂습니다. 그런 다음 바이알을 뒤집고 탭하여 파리를 신선한 배양 바이알로 옮깁니다.
신선한 배양 바이알을 꽂고 오래된 바이알을 버립니다. 신선한 배지에 알을 낳기 위해 섭씨 25도 인큐베이터에 신선한 배양 바이알을 놓습니다. 알을 낳은 지 6 시간 후에 파리를 제거하고 75 % 에탄올이 들어있는 플라스크에 파리를 버려 버립니다.
바이알을 섭씨 37도의 수조에서 1시간 동안 배양하여 플리파제 발현을 유도합니다. 그런 다음 섭씨 25도 인큐베이터에 넣고 배아가 계속 발달하도록 합니다. 실험실 주걱을 사용하여 알을 낳은 후 75시간 후에 발달 중인 유충이 들어 있는 배지를 페트리 접시에 퍼냅니다.
접시에 1X PBS를 넣고 긴 집게를 사용하여 배양 배지와 유충을 부드럽게 분리합니다. 그런 다음 10-15 개의 초기 세 번째 instar 유충을 선택하십시오. 9웰 유리 함몰 스폿 플레이트의 웰을 1X PBS로 채우고 분리된 세 번째 인스타 유충을 긴 집게를 사용하여 웰에 넣습니다.
모든 배지 잔류 물을 제거하기 위해 유충을 철저히 씻으십시오. 빈 바이알에 20 % 자당 용액 5 밀리리터를 넣고 긴 집게를 사용하여이 용액에 깨끗한 세 번째 instar 유충을 넣습니다. 이 바이알을 섭씨 25도 인큐베이터에서 6시간 동안 배양한 후 해부를 위해 수확합니다.
9웰 유리 함몰 스폿 플레이트의 각 웰에 1X PBS를 추가하고 긴 집게를 사용하여 유충을 웰로 옮깁니다. 한 마리의 유충을 등쪽이 위를 향하도록 우물에 넣습니다. 유충 몸통 중앙에 5개의 집게로 유충의 큐티클을 잡고 큐티클을 부드럽게 찢습니다.
노출된 지방체는 다른 유충 내부 조직과 함께 여전히 유충의 사체에 부착됩니다. 내부 장기가 최대한 노출될 정도로 당깁니다. 모든 유충에 대해 이 단계를 반복합니다.
유충 사체를 500 마이크로 리터의 4 % PFA가 들어있는 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기고 튜브를 흔들지 않고 섭씨 25도에서 30 분 동안 배양합니다. 30분 후, PFA 용액을 피펫팅합니다. 500마이크로리터의 1X PBS를 튜브에 추가합니다.
평평한 회전자에서 튜브를 10분 동안 부드럽게 흔든 다음 1X PBS 용액을 버립니다. 이것을 세 번 반복하십시오. 긴 집게를 사용하여 고정 및 세척된 유충 사체를 1X PBS로 채워진 9개의 함몰 지점 플레이트의 우물로 옮깁니다.
5 개의 집게로 모든 비 지방 신체 조직을 제거하십시오. 마지막으로, 장착 매체로 80 % 글리세롤을 사용하여 현미경 슬라이드에 뚱뚱한 몸체 조각을 장착하고 그 위에 커버 슬립을 놓습니다. 돌연변이 1과 돌연변이 2는 X 염색체에 있는 두 개의 독립적인 치명적인 돌연변이이며 동종화된 황백색 FRT 19A 파리가 여기에서 대조군 역할을 합니다.
대조군, 돌연변이 1 또는 돌연변이 2 모자이크 유충 지방체에서 GFP-Atg8a 패턴을 분석하고, 돌연변이 클론 또는 대조군 클론을 RFP에 의해 음성으로 표시하였다. 대조군 클론에서 GFP-Atg8a Puncta의 패턴은 주변 RFP 양성 세포의 패턴과 유사했습니다. 돌연변이체 1 돌연변이 클론에서, GFP-Atg8a Puncta가 크게 감소하였다.
그리고 돌연변이 2개의 돌연변이 클론에서 GFP-Atg8a Puncta의 수와 크기가 증가했습니다. 애벌레 발달 단계는 여기서 중요합니다. 발달 시간과 기아 기간은 각 실험실의 배양 배지 레시피에 따라 수정해야 합니다.
이 절차는 선택적 자가포식을 탐색하는 데 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 미토파지는 형광 단백질을 미토콘드리아 표적화 서열에 부착시킴으로써 파리 지방체에서 모니터링될 수 있다.
