파스퇴르 연구소, INSERM, 직원은 국립 드 공들인 ANR (그랜트 &#39;Lymphopoiesis&#39;), REVIVE 미래를위한 투자 프로그램 및 &quot;contre 르 암 라 리그&quot;에 의해 지원됩니다.

윤리 문 : 모든 실험은 프랑스 농업 장관의 승인을 파스퇴르 연구소 윤리 헌장에 따라 수행하고, 유럽 연합 (EU) 지침에 있었다. 농업의 프랑스 교육부의 인증을 작은 설치류 수술에 대한 교육과 조작은 모든 수술 개입을 수행한다. 주 : 5 단계 계획 순서를 나타내는 부록 표 1 참조. 태아의 1. 선택 <ol><li> 36 C57BL / 6 CD45.2의 여성, 12 여성의 CD45.1 12 C57BL / 6 CD45.1 남성 12 C57BL / 6 CD45.2 남성을 사용합니다. 남성 유전자형 중 하나와 여성을 횡단하는 것은 배아 CD45.1 / 2 및 CD45.1받는 사람 흉선 로브의 소스로 사용 TSP 또는 CD45.2의 소스로 사용 생성합니다. 하우스 개별적으로 모든 남성. </li><li> , E18 TSP 격리를위한 배아를 얻기 이십일일 이식 실험 전에 오후 6시에서 한 남성 CD45.1와 케이지 2 여성을 배치합니다. 정오 전에, 다음날 질 플러그의 존재를 확인합니다. SEPA연결 여성을 평가. </li><li> E14 배아를 얻기 위해하는 것은 TSP 식민지 될 17 일 이식 실험 전에 남성의 CD45.2를 사용하여, (1.2) 위의 절차를 반복합니다. </li><li> E13 TSP를 분리 배아를 얻기 위해 16 일 래프팅 실험 전에, 수컷 C57BL / 6 CD45.1를 사용하여, (1.2) 상기 절차를 반복한다. </li></ol> 수평 층류 후드에서 태아의 해부 (2) 참고 : 이식 실험 전에 두 일. <ol><li> 포화 밀폐 된 챔버 내에서 적어도 5 분 동안 자궁 전위에 의해 또는 CO 2 가스의 진보적 인 투여에 의해 임신 한 여성을 희생. 심장 - 호흡 운동의 결정적인 체포에 의해 죽음을 확인합니다. 70 % 에탄올로 복부 젖은. </li><li> 중간 선 복부의 피부에 세로 절개를 따로 따로 피부를 잡아 당겨 엽니 다. 소화 기관을 건드리지 않고 집게와 가위로 복막을 엽니 다. 이열 터의를 꺼냅니다우리는 가위로 질에서 분리합니다. </li><li> 40 ~ 50 ml의 DPBS를 포함하는 90 X 15mm 페트리 접시에 자궁를 놓고 각 배아의 탈락 사이에 횡 방향으로 절단. </li><li> 좋은 팁이 위의 쌍 미세 집게로, 자궁의 근육 막을 제거 태반과 난황 사이를 절단하여 배아를 꺼내와 배아를 유지하는 amnios을 제거합니다. </li><li> 페트리 접시에 배아를 배치 HBSS + 1 % 소 태아 혈청을 함유하는 90 X 15mm (FCS). E15보다 배아 나이가 들어 더 해부 전에 가위로 머리를 제거합니다. </li></ol> 흉선 3. 분리 <ol><li> 양안 확대 렌즈에서 젖은 거즈 침대에 누운 위치 (복부보기)에 누워, 배아를 놓습니다. </li><li> , 길이 방향으로 흉골의 연골을 따라 집게를 삽입 끼와 흉부 그리드를 엽니 다. 곡선 집게로, T를 시각화하기 위해 옆으로 흉부 벽을 당겨기관의 각 측면에 hymic 로브. </li><li> 조심스럽게 미세 집게로 아래 곤란하여 각 로브를 개최하고 1 ml의 HBSS + 1 % FCS를 포함하는 페트리 접시에 배치합니다. 로브를 분리하고 캡슐에 손상을주지 않고, 두 1ml를 주사기 + 26 G ⅜ &quot;바늘 주위의 결합 조직을 제거합니다. </li><li> 혈액 세포를 제거하기 위해 HBSS + 1 % FCS 3 ㎖에 로브를 씻는다. 참고 : E15 전에, 흉선 로브는 양방향 엽성 기관을 구성하는 중간에 기관 나중에 퓨즈의 각 측면에 있습니다. </li></ol> 4. 세포 현탁액 <ol><li> HBSS + 1 % FCS 1 ml를 주사기에 장착 된 두 개의 26 G 바늘로, 양안 확대 렌즈 아래 로브 떨어져 애타게. 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 필터. </li></ol> 형광 항체와 세포 정렬 5. 염색 참고 : 모든 항체는 이전에 인구의 최적의 정의 (titrat를 얻기 위해 적정있다이온) 항체의 배치에 따라 달라질 수 있습니다. <ol><li> 혈통 양성 세포를 염색하는 비오틴 항체의 칵테일의 100 μL와 4 ° C에서 15 ~ 30 분 동안 흉선 세포 (E13 또는 E18)을 품어 (항 CD19, 안티 GR1, 안티 Ter119, 안티 NK1.1 , 안티의 CD11c, 항 CD3, 안티 CD4, CD8 방지, 항 CD25). </li><li> 항체가 7 분 동안 280 XG에 4 ml의 HBSS + 1 % FCS와 튜브를 스핀 다운의 거리를 초과 씻어, 상층 액을 제거하고 다시 중단 신선한 HBSS + 1 % FCS의 펠렛을. 원심 분리를 반복합니다. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 스트렙 타비 딘 마이크로 비드와 E18 비오틴 표지 세포를 품어 두 번 HBSS 1 % FCS에서 세포를 씻는다. 2 ㎖의 HBSS + 1 % FCS에 세포를 다시 일시. 대부분의 E13의 흉선 세포는 혈통 음 때문에 셀 정렬하기 전에 맥 농축이 필요하지 않습니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라, LS 컬럼상에서 세포를 전달. 모든 세포 현탁액 입력하면 열은 2 ㎖의 HBSS + 1 % FCS를 추가한다. 복구칼럼 4 ml를 280 x g에서 7 분 동안 세포를 원심 분리를 통해 흐르게. </li><li> 다시 중단 고갈 E18 또는 TSP 항체 믹스의 50 μL (항 CD117 APC, 안티 CD135 PE, 안티 CD127 PECy7, 항 CD24 FITC, 항 CD44 APCCy7과 스트렙 타비 딘 퍼시픽 블루 총 E13의 흉선 세포 중 하나의 펠렛을 )과 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 품어. </li><li> 4 ㎖의 HBSS + 1 % FCS와 함께 세포를 씻어 1 ㎖의 HBSS에 요오드화 프로피 듐과 + 1 % FCS를 세포를 다시 일시. </li><li> 정렬의 TSP 린 - 200 μL 완전 배지 + 20 % FCS를 포함하는 1.5 ml의 튜브 상 (4 레이저와) 외과에서 CD44 + CD117 + CD24 낮은 CD127 + CD135 + 세포. 금융위원회와 SSC 채널 크기와 입도에 따라 게이트 먼저 세포. (요오드화 프로피 듐 염색) 죽은 세포, 게이트 밖으로 이중선을 제거 지수 저울에 형광 점수. 약 100 또는 600의 TSP는 하나 또는 하나 E13 E18 흉선, respectiv로부터 얻을 수있다엘리. </li></ol> 조상 6. 식민 E14의 흉선 로브 : 매달려 드롭 기술 <ol><li> (30 회색 = 30 Gy를) CD45.2 배아에서 E14 흉선 로브, 문화 전 3 시간을 조사. 참고 : E14 또는 E15 흉선 로브가 성공적으로 T 세포 전구 세포의 수신자로 사용되어왔다. 이전 임신 일에서 흉선 로브가 제대로 개발하는 동안 아마도 상피 세포의 불완전한 발달로 인해 기관의 더 큰 크기로 조기 괴사에 나중에 임신 일 결과를받는 사람 흉선 로브를 사용. </li><li> 원심 분리기의 TSP 재 일시 세포 배양 배지 (10 % FCS와 OPTI-MEM 완전 배지, 페니실린 (50 유닛 / ㎖), 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ㎖), 2β 머 캅토 에탄올 (50 μM))를 정렬되도록 35 μL 500 TSP가 포함되어 있습니다. </li><li> 60 잘 테라 사키 판의 다른 모든 잘 세포 현탁액의 35 μL 드롭 놓습니다. 주 :이 연속 우물에 배치하는 경우 35 μL 방울을 융합 할 수 있습니다. </li><li> 각 방울의 표면에 하나 조사 로브를 놓습니다. 테라 사키 판을 닫고 세포가 중력에 의해 드롭의 혀끝 극에 도달 할 수 있도록 거꾸로 판을 켭니다. </li><li> 히트 부드럽게 반전 플레이트의 상부는 드롭의 혀끝의 가장자리로 밀어 로브를 강제로. 37 ° C ~ + 5 % CO 2에서 48 시간 동안 가습 인큐베이터에서 반전 테라 사키 판을 품어. 받는 사람 성인 마우스 (8)의 신장 캡슐에서 식민지, 중 문화 E14의 FTOC 7 thymi, 또는 이식 후. </li></ol> 7. 태아 흉선 장기 문화 <ol><li> 35mm 페트리 접시에 전체 매체의 3 ㎖를 놓습니다. 매체에 떠있는 isopore 멤브레인 필터를 놓습니다. 포셉 (한 막에 이하 8 로브)와 멤브레인의 가장자리에 재구성 로브를 놓습니다. </li><li> 식 수용 2 ㎖를 포함, 커버없이, 35mm 요리와 함께, 90mm 페트리 접시 안에 흉선 로브를 포함하는 배양 접시를 놓습니다R, 최적의 습도를 보장합니다. 37 ° C ~ + 5 % CO 2에서 십이일 품어. </li></ol> 무균 조건에서 신장 캡슐에서 8 이식 참고 : 신장 실질이 캡슐을 형성하는 결합 조직으로 둘러싸여 있습니다. 서브 캡슐 지역은 피함으로써 이식의 개발을위한 적합한 환경 (예 흉선 로브, 췌장 또는 신생아의 마음)을 제공하는 림프 혈관에 특히 풍부하다. 이 오른쪽 신장보다 더 접근하기 때문에 이식은 일반적으로 왼쪽 신장에서 수행된다. CD3 - / - 생쥐 수컷 E15 전에 성 결정이 용이하지 않기 때문에 수신자가 이에 의한 Y 염색체에 링크 부 조직 적합성 항원 이식편 대 숙주 반응을 피하기로 하였다. <ol><li> 기구를 소독하고 수술에 따른 멸균 장갑을 착용하십시오. 케타민 10 ㎎ / ㎖ + 크 실라 1의 Mg 용액의 복강 내 주사하여 마우스를 마취 /ml의 PBS 중에 희석 (10 g의 체중 당 50 내지 100 μL), 1 mL를 주사기를 사용. 인터 반사의 부족을 확인하여 마취를 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 각각의 눈에 수력 Optimune 젤 한 방울을 놓습니다. 참고 :이 솔루션은 즉흥적 준비하고 주입하기 전에 실온에서 예열한다. 마취는 적어도 20 분 동안 지속됩니다. 마취의 정도는 모든 수술 따라 조절되어야한다. 마취는 매 20 분 투여 량의 절반 복강 내 주사에 의해 연장 될 수있다. </li><li> 수평 얇은 흐름 후드 아래, 우측에 마우스를 놓습니다. 70 % 에탄올 및 10 % 요오드 용액으로 피부에 관한 수술 부위를 소독. 집게 부분으로 바로 뒷다리의 관절 위 2cm의 길이를 따라 마우스 머리. 수술 영역을 면도. </li><li> 메스와 가위가 근육 조직을 절단 한 다음에, 첫 번째, 피부 조직의 절개 1.5 cm 길이를 확인합니다. 절개의 양쪽에 약간의 압력을가, 복강에서 신장을 강제 것이다. </li><li> 촉촉한 신장을 유지하는면 버드와 식염수를 적용합니다. 당신이 장기 노출에 어려움이있는 경우, 신장이 부착 된 주변의 지방 세포 조직을 꺼내 평평한 집게를 사용합니다. 기관 아래에 배치 면봉에 의해 복막 캐비티 중 신장을 유지한다. </li><li> 이 미세 집게로, (출혈을 방지하기 위해 실질에 손이 닿지 않도록) 캡슐에서 2~3mm의 구멍을. 전체 수술 중 지속적으로 적신 노출 신장 캡슐을 유지합니다. </li><li> 연 캡슐의 벽을 유지함으로써, 신장 캡슐에서 조심스럽게 로브를 삽입하고 가장자리 극으로 캡슐에서 이식을 밀어 넣습니다. 신장 당 6 로브까지 놓습니다. </li><li> 역 복강의 신장을 교체합니다. 근육 aponeuroses, 개별 외과 매듭 후 피부를 봉합. 10 % 포비돈 요오드 용액으로 상처 젖은. 가열 된 PA에 마우스를 놓습니다37 ° C에서 D. </li><li> 심장, 호흡과 수염 운동, 자기가 볼 총 복구 움직임을 포함 할 때까지 점막 색상의 제어에 의해 마취에서 완전히 회복 될 때까지 이식 한 마우스를 조사. 참고 : 우리는 단지 수술 후 진통제 솔루션 (Buprenorphin, 0.1 ㎎ / ㎏) 내 근육 주사를 추천 2 일 수술 후 통증을 방지하기 위해 수술을 다음과 같습니다. </li><li> 완전히 회복 될 때까지 격리에서 운영하는 동물을 유지합니다. 확인하고 감염을 방지하기 위해 매일에게 상처의 바늘을 검사합니다. 이 절차에 따라 창상 감염을 관찰하지 마십시오. 참고 : CD3에서 말초 혈액 세포의 주간 분석 - / - 이식 생쥐 우리가 파생 인구가 CD45 allotypic 마커 및 T 세포 계보 특이 항체 (그림 3)를 사용하여 E13 또는 E18 전구 세포 하나에서 유래 흉선을 감지 할 수 있습니다. </li></ol> 유동 세포 계측법에 의한 TSP의 자손 9. 분석 <ol><l난&gt; 단일 세포 현탁액을 (프로토콜 (4) 참조) 얻기 위해 개별적으로 FTOCs을 애무 해줘. </li><li> 항체 혼합물 CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 퍼시픽 블루, Vγ5 FITC, Vδ1 체육을 인식하는 항체를 포함하고 제 5 절에 설명 된대로 품어 개별 로브에서 얼룩 세포 현탁액. </li><li> HBSS에 + 1 % FCS + 프로피 디움 요오드화물을 세포를 다시 중단하고 (그림 2의 결과를 참조) 사이토 흐름을 분석 할 수 있습니다. </li></ol>

<ol>
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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

두 가지 주요 분석은 T 세포의 생체 외 분화를 분석하는데 사용될 수있다. 가장 최근에보고 된 1 또는 4 내지 12 등 Noth1의 리간드, 델타 표현 BM 간질 세포 OP9 조혈 전구 세포의 공 배양된다.이 2-D 분석은에서 분석을 가능하게 고효율 민감한 수행하기 쉬운 단일 세포 수준. 그러나, 어느 쪽도 흉선 상피 세포와 직접 상호 작용을 필요로 둘 (DP)의 무대도 γδ DETC (13)의 생성, 이후 T...

T 림프구는 αβ 또는 γδ T 세포 수용체 (TCR)를 담지, 전문 기관에서 흉선 차별화. 완전히 개발 흉선은 두 가지 영역으로 구성되어 생산적 TCR의 β와 α 체인 유전자를 재 배열 흉선 세포가 프로그램의 죽음 (긍정적 인 선택으로 알려져있는 과정)에서 구출되는 흉선 조상 개발 피질, 그리고; 자기 리간드에 너무 강한 반응성과 흉선 세포를 선택한 수질은 (음 선택) 1, 2 삭제됩니다. 흉선 나중에 간엽 세포 (3)에 의해 둘러싸여 제 인두 파우치 내배엽 층에서 유래. 그것은 그 후, 연속 채용 정상 T 세포의 발달을 위해 요구되는 4 배아 일 E12과, 기점 조혈 전구 세포 식민지된다. 흉선 이민자들은 긴밀하게 규제 프로그램, 시작과 마이에 의해 조율 된, 연속적인 발달 단계를 통해 진화4처럼 그 리간드와의 상호 작용에 따라 흉선 세포의 노치 신호 전달 경로의 활성화, 델타에 의해 ntained, 흉선 상피 세포 (TEC는)에 표현 된 5. 흉선 세포 개발은 소위 CD4 시작 - CD8 - 더블 네거티브 (DN) 단계. , DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) 및 DN4 (CD25 - CD44 -) - DN의 흉선 세포는 더 DN1 (CD44 + CD25)에 CD25 및 CD44의 발현에 따라 세분화 될 수있다. CD24 (HSA)와 CD117 (C-kit)은 더 DN1a와 b는 초기 흉선 전구 세포 (ETP)에 해당하는 5 부분 집합에 DN1 함을 세분화. 흉선 세포는 DN 단계에서 TCR δ, β와 α 사슬을 재 배열 및 사전 TCR 선택 (DN3-DN4 단계)를 거쳐. TCR (α) 체인은 긍정과 부정 실리 이전에 재 배열 CD4 + CD8 + 더블 긍정적 인 (DP) 구획에 그들은 더 통과ction의. 이 단계에서 가장 흉선이 제거되고, 단지 작은 백분율 (3~5%)는 ​​CD4 + 또는 CD8 + 도달가 T 세포를 격실 성숙. 림프 분화 경로는 다 능성 전구 세포 (MPP) 및 적혈구와 거핵 세포 6 잠재력을 잃어 림프-준비하는 다 능성 전구 세포 (LMPP)를 생성 조혈 모세포의 단계를 통해 진행한다. , 형 c-Kit (CD117)의 발현, 무서-1 및 FLT3 / Flk2 (CD135) 및 인터루킨의 검출 가능한 수준의 부재 (- LMPP는 표현형 (리니지 부정적인 린) 분화 혈액 세포 마커의 부재에 의해 정의 된 IL) -7 체인 α 수용체 (IL-7rα 또는 CD127). LMPPs 더욱 그 단계에서 골수 세포를 생성하는 능력을 상실했다고 공통 림프구 전구 세포 (CLP) 7로 분화. CLP는 림프구 (B와 T 세포), NK 세포, DC 및 선천성 림프 세포 (ILC)의 잠재력을 유지하고, CD1의 발현에 의해 LMPP 다를27 무서-1의 높은 수준의 부재. 흉선 정착 선조 (TSP)의 특성은 광범위 8 논의되었지만, 최근에 개발 된 것은 분명 9 TSP 걸쳐 변화 표현형 분화 잠재력과 기능은. 우리는 E13 (제 1 파) 또는 E18 (초 파) 중 하나에서 정렬 외과 세포에 의해 격리 TSP를 특성화하기 위해 생체 외 및 생체 내 분석을 수행. 동일 E13 및 E18 전구 세포의 수, 다른 allotypic 마커가 부착 된 식민지 유사한 개발 환경에서 그들의 자손 다음 허용 조상의 두 가지 유형의 사이에 다른 세포 고유 특성을 밝혀 조사 흉선 로브와 태아 흉선 기관 배양 (FTOC). E13 또는 E18 TSP 중 하나의 식민지 흉선 로브 인해 두 전구 세포 사이의 경쟁으로 선택하지 않고 개발을 허용했다. 식민지 흉선 로브의 생체 내 이식 더 보여 주었다 또한 T그는 E13의 성숙 자손과 E18 TSP는 생체 내에서 서로 다른 생물학적 특성을 갖는다. 제 웨이브에서 TSP를 빠르게 T 세포를 생성하고 있지만, αβ γδ T 세포의 낮은 숫자 일으킨다. 후자 중 우리는 불변 TCR, 그들은 상처 치유의 기능을 발휘하고 만 배아 발달 10시에 발생하는 표피로 마이그레이션이 Vγ5Vδ1 수지상 상피 T 세포 (DETC)를 발견했습니다. 대조적으로, TSP는 제 웨이브에서 TCR + T 세포의 높은 번호를 생성하는 시간이 오래 걸릴 DETC를 생성 할 수 없습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes.</td>
			<td>TPP</td>
			<td>T93100/T9340</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak.</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300015</td>
			<td>Cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces.</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>03-100/32</td>
			<td>Filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%.</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83801.36</td>
			<td>Sterility Actions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodide Povidone 10% (Betadine)&#160;</td>
			<td>MEDA Pharma</td>
			<td>314997.8</td>
			<td>Sterility Actions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 100mg/ml (stock solution)</td>
			<td>MERIAL</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Anesthesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X1251-1G</td>
			<td>Anesthesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution</td>
			<td>AXIENCE</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Morphinic analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin)</td>
			<td>Schering-Plough Animal Health</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Eyes protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+ CaCl2, MgCl2)</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>14040-174</td>
			<td>to isolate embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS Hanks&#39; Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>24020-091</td>
			<td>to wash out the blood and dissect the embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>51985-026</td>
			<td>Medium for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F&#339;tal Calf serum</td>
			<td>EUROBIO</td>
			<td>CVFSVF00-0U</td>
			<td>additive for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin and Streptomycin</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>15640-055</td>
			<td>Antibiotics for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 b mercapto ethanol</td>
			<td>GIBCO Life Technology</td>
			<td>31350010</td>
			<td>additive for cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEICA MZ6 Dissection microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>MZ6 10445111</td>
			<td>Occular W-Pl10x/23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold lamp source</td>
			<td>SCHOTT VWR</td>
			<td>KL1500 compact</td>
			<td>Two goose neck fibers adapted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Dissecting Pad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spoon, round and perforated</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-18</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Iris Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11253-25</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two pairs of fine straight watchmakers&#8217; forceps Dumont #5 11 cm fine tips.</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-20</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyamid thread with needle 6-0&#160;&#160; C-3 3/8c</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>F2403</td>
			<td>for sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle-holder</td>
			<td>MORIA/F.S.T.</td>
			<td>12060-02</td>
			<td>for sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100229-100</td>
			<td>To maintain mouse temperature during anesthesy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Isopore RTTPO2500</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>44210</td>
			<td>For FTOC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terasaki 60 wells plates</td>
			<td>FISHER</td>
			<td>1x270 10318801</td>
			<td>For hanging drop technique</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm</td>
			<td>Hydrex</td>
			<td>11522</td>
			<td>To apply disinfecting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence or biotin labelled antibodies</td>
			<td>BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences&#160;</td>
			<td>Clone Number see table below</td>
			<td>Staining cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Columns/Streptavidin Microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401/130-048-101</td>
			<td>Cell depletion&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs&#160; (CD45.2)</td>
			<td>C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2</td>
			<td>Source of cells and thymic lobes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>CDTA Orl&#233;ans, France</td>
			<td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td>
			<td>&#160;Grafting experiment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of thymic settling progenitors in the mouse embryo using in vivo and in vitro assays

흉선 정착 전구 세포를 특성화하는 lymphopenic 환자에서 T 세포의 교체를위한 전략을 고안하는 것이 필수적, T 세포의 발달 단계 전 흉선을 이해하는 것이 중요하다. 우리는 체외에서 보완이에 의해 쥐의 배아 일 13, 18 thymi에서 전구 세포를 정착 흉선을 공부하고 생체 기술에 모두 &quot;매달려 드롭&quot;방법에 따라. 이 방법은 E13 및 / 또는 E18 그들의 자손 다음 따라서 CD45 allotypic 마커에 의해 구별 흉선 조상을 조사 태아 흉선 로브를 식민지화 허용했다. 인구 중 하나와 식민지가 가능한 경쟁력있는 선택적 압력을 제거하는 동안 혼합 인구 식민는 전구 세포의 생물학적 특성 세포 자치 차이를 분석하는 허용한다. 식민 흉선 로브는 또한 t의 인구 역학 생체 내 성숙 된 T 세포의 자손의 수 분석 면역 결핍받는 수컷 마우스에 이식 할 수있다그는 면역 체계와 다른 조직과 장기의 식민지를 주변. 태아 흉선 기관 배양 E13 전구 세포 모두에 빠른 속도로 개발 CD3 + 세포를 성숙 것으로 나타났다 및 수지상 상피 T 세포로 알려진 표준 γδ T 세포 하위 집합에 상승했다. 이에 비해, E18 전구 세포는 분화가 지연 및 수지상 상피 성 T 세포를 생성 할 수 없었다. - / - 흉선 이식 CD3의 말초 혈액의 모니터링 마우스는 더 E18의 흉선 정착 전구 세포는, 시간에 따라, 단기적 태아 흉선에서 감상 할 수없는 기능을 자신의 E13에 비해 성숙한 T 세포의 큰 번호를 생성하는 것으로 나타났다 기관 배양.

식민지화 선조의 가장 개발을 허용 내인성 흉선 세포의 흉선 로브를 고갈시키는 방법을 선택하기 위해, 우리는 방사선 조사 후 식민 흉선 로브에서 T 세포 재구성의 수준 또는 5 일 데 옥시 구아노 신 (D-GUA) 치료를 비교 하​​였다. 결과 배양 9 일째에 아무런 차이가 없을 때, 방사 로브 따라서 일 12시, 조사 후 T 세포의 발달을 얻었다 D-구아 처리보다 더 바람직하고, 또한 D-구아 처리보다 더 T 세포...

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Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

8.2K 조회수.  Institut Cochin. This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny. 

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Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

연구

발생학

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

조류 배아 배아 Cardiomyocytes의 생체 내 주입에 대 한 microinjection 기반 시스템

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Spatiotemporal Subcellular Manipulation of the Microtubule Cytoskeleton in the Living Preimplantation Mouse Embryo using Photostatins

The microtubule cytoskeleton forms the framework of a cell and is fundamental for intracellular transport, cell division, and signal transduction. Traditional pharmacological disruption of the ubiquitous microtubule network using, for instance, nocodazole can have devastating consequences for any cell. Reversibly photoswitchable microtubule inhibitors have the potential to overcome the limitations by enabling drug effects to be implemented in a spatiotemporally-controlled manner. One such family of drugs is the azobenzene-based photostatins (PSTs). These compounds are inactive in dark conditions, and upon illumination with UV light, they bind to the colchicine-binding site of &#946;-tubulin and block microtubule polymerization and dynamic turnover. Here, the application of PSTs in the 3-dimensional (3D) live preimplantation mouse embryo is set out to disrupt the microtubule network on a subcellular level. This protocol provides instructions for the experimental setup, as well as light activation and deactivation parameters for PSTs using live-cell confocal microscopy. This ensures reproducibility and enables others to apply this procedure to their research questions. Innovative photoswitches like PSTs may evolve as powerful tools to advance the understanding of the dynamic intracellular microtubule network and to non-invasively manipulate the cytoskeleton in real-time. Furthermore, PSTs may prove useful in other 3D structures such as organoids, blastoids, or embryos of other species.

Typical microtubule inhibitors, used widely in basic and applied research, have far-reaching effects on cells. Recently, photostatins emerged as a class of photoswitchable microtubule inhibitors, capable of instantaneous, reversible, spatiotemporally precise manipulation of microtubules. This step-by-step protocol details the application of photostatins in a 3D live preimplantation mouse embryo.