Microscopia in questo lavoro è stato condotto presso l'Istituto di Transformative Bio-molecole (WPI-ITbM) dell'Università di Nagoya e supportata dal Giappone Advanced Plant Science Network. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Japan Science and Technology Agency (progetto ERATO T.H. e M.U.) e la Japan Society per la promozione della scienza: una sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 e JP15H05955 per M.U. e Nos. JP16H06465, JP16H06464 e JP16K21727 per Tartaglia), una sovvenzione per giovani scienziati (B, Nos. JP24770045 e JP26840093 per M.U.) e una sovvenzione per impegnativa ricerca esplorativa (No. JP16K14753 per M.U.).

1. preparazione del terreno di coltura In Vitro dell'ovulo <ol><li>rendono il mezzo liquido per la coltura in vitro di ovulo (&#34; N5T medio &#34;) contenenti 1 x Nitsch tecnica basale miscela di sale, 5% (p/v) trealosio diidrato, 0.05 % (p/v) 2-(N-morfolino) ethanesulfonic acido (MES)-KOH (pH 5,8) e 1 x Gamborg &#39; soluzione di vitamine di s.</li>
	<li>Aggiustare il pH a 5,8 con KOH.</li>
	<li>Sterilizzare il mezzo in autoclave (121 ° C, 20 min) o filtrandola attraverso un filtro da 0,22 µm. 
	Nota: Il mezzo sterilizzato può essere memorizzato a 4 ° C per 2-3 mesi.</li>
</ol> 2. Preparazione del dispositivo matrice PDMS Micropillar <ol><li>tagliare il dispositivo di micropillar PDMS di un coltello, lama di rasoio o forbici per adattarsi con la parte di vetro (14mm φ) di un piatto di vetro-fondo di 35 mm. 
	Nota: La procedura completa della costruzione dispositivo PDMS è descritto in precedenti documenti 8 , 9, e così i dettagli sono omessi qui. Piatti con fondo di vetro con volumi più piccoli, ad esempio 4-pozzetti o 96 pozzetti piastre, possono essere utilizzati per l'imaging a breve termine senza il dispositivo.</li>
	<li>Sterilizzare il lato superiore del dispositivo PDMS sotto luce UV per 15 min.</li>
	<li>Accendere l'apparecchio PDMS su utilizzando una pinzetta punta quadrata e tenerlo sotto UV luce per 15 min sterilizzare fondo.</li>
	<li>Trasferire il dispositivo PDMS sterilizzato in una piastra di coltura di 35 mm e aggiungere il supporto di N5T fino a quando il dispositivo è completamente imbevuto nel medio (circa 5-7 mL).</li>
	<li>Mettere il piatto in una camera a vuoto e ridurre la pressione a degas. Mantenere l'aspirazione per 3 h a tutta la notte fino a quando l'aria nel dispositivo viene sostituita dal mezzo. 
	Nota: Il dispositivo può essere staccato da bolle d'aria sotto una forte depressione.</li>
	<li>Prendere il dispositivo dal piatto, tenendola con le pinzette a punta quadrata e metterlo su un tovagliolo di carta per rimuovere il mezzo supplementare sulla parte laterale e inferiore. 
	Nota: il mezzo sulla matrice micropillar (superficie superiore) non deve essere rimosso perché questo sarà utilizzato per la coltivazione di ovulo.</li>
	<li>Trasferire il dispositivo su un vetro da diapositiva 76 x 26 mm, garantendo per mantenere la parte di micropillar come il lato superiore e coprire l'apparecchio con il coperchio di piatto di cultura 35 mm per evitare il terreno dall'asciugarsi durante la successiva estrazione dell'ovulo.</li>
</ol> 3. Anemofila dissezione ed estrazione dell'ovulo <ol><li>sterilizzare un ago (mm 0,40 G) e pinzette bene strofinando con etanolo al 70%. L'ago è facilmente gestibile collegandolo a un bastone di legno o siringa.</li>
	<li>Verifica l'infiorescenza della pianta e selezionare i corretto silique per l'esperimento. Le silique circa 5 mm contengono zigoti, e le silique di 8-10 mm includono giovani embrioni globulari.</li>
	<li>Accise i silique utilizzando una pinzetta e metterli su nastro biadesivo su un vetro di diapositiva 76 x 26 mm. Un anemofila contiene circa 40-60 ovuli e 3-4 silique (cioè, 120-240 ovuli) sono sufficienti per un unico dispositivo.</li>
	<li>Aprire l'anemofila (parete dell'ovaia) per vedere gli ovuli all'interno utilizzando l'ago sterilizzato e pinzette sotto un microscopio stereoscopico. Tagliare solo la parete dell'ovaia, in modo che gli ovuli non siano danneggiati.</li>
	<li>Trasferire l'anemofila aperto nel mezzo di N5T sul dispositivo PDMS (preparato al punto 2.7) e rilasciare gli ovuli nel mezzo con l'ago o una pinzetta.</li>
	<li>Mettere una piccola copertura vetrata (18 x 18 mm) sul dispositivo PDMS per spingere gli ovuli negli spazi nella matrice micropillar.</li>
	<li>Togliere il vetro di copertura tirandolo orizzontalmente con una pinzetta o le dita per rimuovere medium extra.</li>
	<li>Capovolgere il dispositivo PDMS, metterlo in un piatto fondo di vetro 35mm e premere leggermente il dispositivo spingendo con le pinzette punta quadrata per attaccarlo al vetro.</li>
	<li>Medie N5T versare delicatamente in vetro-fondo piatto di decantazione la bottiglia fino a quando il dispositivo PDMS è completamente imbevuto nel mezzo e sigillare il piatto con la pellicola di paraffina. 
	Nota: Il dispositivo PDMS può essere riciclato, ma dispositivi che sono troppo vecchi si staccano facilmente dalla parte inferiore del vetro. Inoltre, il dispositivo può galleggiare se esso non è completamente degassato nel passaggio 2.5 o il mezzo viene versato troppo in fretta.</li>
</ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig2.jpg" /> Figura 2: procedura schematica per la preparazione del campione. 
Questo flusso schematico corrisponde ai passaggi 3.5 a 4.1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig2large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
 4. Time-lapse Imaging <ol><li>posizionare il piatto con fondo di vetro che è stato preparato in passaggio 3.9 su un microscopio invertito e selezionare adatti ovuli di concentrarsi su. 
	Nota: Perché gli ovuli variano in fase, la posizione e la direzione, ovuli adatti dovrebbero essere trovati controllando loro fluorescenza marcatore.</li>
	<li>Avviare la live-imaging secondo il produttore &#39; s istruzioni del sistema microscopio. 
	Nota: La strumentazione del microscopio e i parametri sono diversi, e così gli utenti devono scegliere le impostazioni corrette che corrispondono allo scopo di esperimento. Ad esempio, le impostazioni utilizzate in questo manoscritto sono elencate nella tabella 1.</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>attrezzature/impostazione</td> <td>supplementare video 1, figura 3 (A) e 4</td> <td> Figura 3 (B) e supplementare Video 2</td> <td>supplementare Video 3</td></tr> <tr><td>microscopio</td> <td>microscopio (A1R MP) invertito a scansione laser</td> <td>disco rotante invertito il microscopio confocale (CSU-W1)</td> <td> casella-tipo invertito sistema di microscopio confocale con una camera di incubazione stabile (CV1000)</td></tr> <tr><td>Laser</td> <td>ti femtosecond laser di impulso</td> <td>laser LD 488 nm e 561 nm</td> <td>488 nm e 561 nm laser LD</td></tr> <tr><td>O biettivi lente</td> <td>40 X obiettivo di immersione in acqua (NA = 1.15) con mezzo immersione</td> <td>60 X obiettivo obiettivo ad immersione in silicone (NA = 1.30), montato su un'unità di messa a fuoco Piezo</td> <td>40 X Diametro obiettivo (NA = 0.95)</td></tr> <tr><td>Detect o</td> <td>esterne non descanned GaAsP PMT rivelatore</td> <td>telecamera EMCCD</td> <td>fotocamera EMCCD</td></tr> <tr><td>dicroiche specchio</td> <td>DM495 e DM560</td> <td>DM488/561</td> <td>DM400-410/488/561</td></tr> <tr><td>filtro</td> < td > passa-banda filtri; 534/30 nm e 578/105 nm</td> <td>filtri passa-banda; 520/35 nm e 593/46 nm</td> <td>filtri passa-banda; 520/50 nm e 617/73 nm</td></tr> <tr><td>fetta lungo asse z</td> <td>31 z-stack con intervalli da 1 µm</td> <td>inter 17 z-stack con 3 µm Vals</td> <td>7 z-stack con intervalli di 5-µm</td></tr> <tr><td>intervallo di tempo</td> <td>20 min</td> <td>5 min</td> <td>10 min</td></tr></tbody></table> tabella 1: il Sistemi di microscopia e le impostazioni utilizzate in questo manoscritto. 
I microscopi e i parametri sono diversi, e così ogni utente dovrebbe scegliere il sistema adatto per l'esperimento.
<ol start="3"> <li>controllare la sequenza di immagini acquisite e convertirlo nel formato di film generale, come. avi o. MOV per presentazione. 
	Nota: Se il software di microscopio non può emettere le immagini come un film in formato, è possibile salvare le immagini come TIF e quindi aprirli in ImageJ, un programma open source ispirato da NIH Image, per modificare il tipo di file. ImageJ è disponibile presso: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ può essere utilizzato anche per fare un Z-sInfilare il film, come la proiezione di massima intensità, come descritto in: https://imagej.net/Z-functions.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Natesh, S., Rau, M. A., Johri, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Embryology of Angiosperms. , 377-443 (1984).</li><li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH.">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li><li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+(Oryza+sativa+L.).">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li><li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+double+fertilization+in+Nicotiana+tabacum+(L.):+the+role+of+cell+volume+in+cell+fusion.">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li><li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+double+fertilization+and+the+cell+cycle+in+male+and+female+gametes+of+tobacco.">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li><li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants.">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li><li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules.">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li><li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li><li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microcage+arrays+to+fix+plant+ovules+for+long-term+live+imaging+and+observation.">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li><li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote.">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li><li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana.">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li><li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues.">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo manoscritto presenta un semplice in vitro dell'ovulo coltivazione protocollo che è efficiente per l'uso nell'imaging di cellule vive di sviluppare zigoti e degli embrioni.
Il design del dispositivo PDMS potrebbe bisogno di ottimizzazione secondo allo stadio embrionale. Il primo dispositivo sviluppato era una gamma di microcage per regolare l'orientamento e per fissare la posizione di ovuli9, e quindi un dispositivo di micropillar è stato costruito per ...

Il piano di base del corpo di un organismo si sviluppa da uno zigote unicellulare. Nella maggior parte delle piante da fiore, divisione zygotic genera un apicale e delle cellule basali, che si sviluppano nella radice, rispettivamente1e sparare. Pertanto, è importante capire come il corpo di pianta si forma durante l'embriogenesi, ma non c'è stato uno strumento efficace per osservare direttamente le dinamiche della vita zigoti ed embrioni perché si sviluppano nel profondo il fiore. In varie specie di monocotiledoni, come mais e riso, un metodo di fecondazione in vitro è stato stabilito2,3. In questo metodo, le cellule uovo e dello sperma isolato sono fuse elettricamente o chimicamente, e la cella generata può svilupparsi in una pianta fertile. Tuttavia, nelle piante dicotiledoni, non c'è nessun in vitro fertilizzazione metodo che può produrre embrioni corretta, presumibilmente a causa dello stato non sincronizzate ciclo cellulare di gameti maschili e femminili4,5. Inoltre, il tessuto che circonda embrione (endosperma) svolge i ruoli importanti nell'embrione di sviluppo6.
In una specie di modello dicotilene, a. thaliana, un metodo di coltivazione in vitro è stato sviluppato focalizzando l'attenzione sull'ovulo intero, che contiene l'embrione e l'endosperma7. Questo sistema è stato usato con successo per analizzare gli effetti di vari agenti chimici su embriogenesi, ma non è adatto per l'imaging di time-lapse perché ha un basso tasso di sopravvivenza. Di conseguenza, un sistema di coltivazione del ovulo romanzo in vitro è stato sviluppato al fine di avviare più presto la stadio di zigote e producono piante fertili in un alto rapporto8. Dopo varie prove, è stato trovato quel mezzo di Nitsch e trealosio ha migliorato significativamente il tasso di sopravvivenza di ovuli8. Inoltre, perché l'ovulo si espande come cresce e così spesso si sposta lontano dal campo di osservazione del microscopio, un dispositivo PDMS è stato sviluppato per risolvere l'ovulo in media9. Il dispositivo PDMS abilitato l'imaging a lungo termine per 3-4 giorni, che è sufficiente per tracciare lo sviluppo da uno zigote, un embrione di cuore-fase. Utilizzando questo metodo, diventa possibile visualizzare le dinamiche di polarizzazione di zigote ed embrione patterning, non solo in condizioni normali, ma anche in presenza di inibitori chimici o in vari ambiti di provenienza mutante8,10 ,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg"> 
Figura 1: Diagramma schematico dei marcatori fluorescenti specifici utilizzati per visualizzare zigoti ed embrioni attraverso l'ovulo. Lo zigote Arabidopsis si sviluppa in un embrione nell'ovulo, che viene generato profondo all'interno del fiore. In questo sistema in vitro coltura, lo zigote ed embrione sono osservati attraverso l'ovulo, e quindi è importante utilizzare marcatori fluorescenti specifici che non sono espressi in altri tessuti dell'ovulo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table width="606">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">Nitsch basal salt mixture</td>
			<td style="width:104px;">Duchefa</td>
			<td style="width:119px;">N0223</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">trehalose dihydrate</td>
			<td style="width:104px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:119px;">206-18455</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">MES</td>
			<td style="width:104px;">Dojindo</td>
			<td style="width:119px;">345-01625</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">Gamborg&#8217;s vitamin solution</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1019</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">35-mm glass-bottom dish</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">D111300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">35 mm culture dish</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430588</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">PDMS</td>
			<td style="width:104px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard184</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">76 &#215; 26 mm slide glass</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">S1225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">18 &#215; 18 mm slide glass</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">C018181</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">needle (gauge 0.40mm)</td>
			<td style="width:104px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-2719S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td style="width:104px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">444969-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">A1R MP</td>
			<td style="width:104px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="width:216px;height:84px;">CSU-W1</td>
			<td style="width:104px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">CV1000</td>
			<td style="width:104px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;">CV1000-SP84</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ovule cultivation for live-cell imaging of zygote polarization and embryo patterning in arabidopsis thaliana

Nella maggior parte delle piante da fiore, lo zigote ed embrione sono nascosti nel profondo del tessuto di madre, e così è stato a lungo un mistero di come si sviluppano in modo dinamico; ad esempio, come lo zigote polarizza per stabilire l'asse del corpo e come l'embrione specifica vari destini delle cellule durante la formazione dell'organo. Questo manoscritto descrive un in vitro dell'ovulo cultura metodo per eseguire la formazione immagine di cellule vive di sviluppare zigoti ed embrioni di Arabidopsis thaliana. Il medium di coltivazione ottimizzato permette di zigoti o embrioni in anticipo a crescere nelle piante fertili. Attraverso la combinazione con un dispositivo di matrice micropillar poly(dimethylsiloxane) (PDMS), l'ovulo si svolge nel liquido di coltura nella stessa posizione. Questo sistema di fissaggio è fondamentale per osservare l'ovulo stesso sotto un microscopio per diversi giorni dalla divisione zygotic per la fine della fase embrionale. L'imaging di vivere-cella risultante consente di monitorare le dinamiche in tempo reale di polarizzazione di zigote, quali migrazione nucleare e riarrangiamento del citoscheletro e anche i tempi di divisione cellulare e specifica di destino delle cellule durante il patterning di embrione. Inoltre, questo sistema di coltivazione dell'ovulo possa essere combinato con trattamenti inibitore per analizzare gli effetti di vari fattori per lo sviluppo dell'embrione e con ottiche manipolazioni come rottura di laser per esaminare il ruolo della comunicazione cellula-cellula.

Utilizzando questo sistema di coltivazione dell'ovulo, questo metodo può tracciare la dinamica vita di polarizzazione di zigote e patterning di embrione. Questo è un risultato, perché in precedenza non c'era nessuna tecnica per visualizzare il comportamento in tempo reale di zigote ed embrione, che sono nascosti nel profondo del tessuto di madre. Figura 3A e supplementare Video 1 mostrano che i microtubuli (MTs) nello zigote giovane si acc...

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In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Questo manoscritto descrive un in vitro dell'ovulo metodo di coltivazione che permette l'imaging di cellule vive di Arabidopsis zigoti ed embrioni. Questo metodo viene utilizzato per visualizzare le dinamiche intracellulare durante la polarizzazione di zigote e la specifica di destino delle cellule nello sviluppo di embrioni.

In Vitro Coltivazione dell'ovulo per Live cell Imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

in-vitro-ovule-cultivation-for-live-cell-imaging-zygote-polarization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

10.8K Views.  Nagoya University. Questo manoscritto descrive un in vitro dell'ovulo metodo di coltivazione che permette l'imaging di cellule vive di Arabidopsis zigoti ed embrioni. Questo metodo viene utilizzato per visualizzare le dinamiche intracellulare durante la polarizzazione di zigote e la specifica di destino delle cellule nello sviluppo di embrioni.

Video: In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell&#39;embrione mouse Uso<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Saggi

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

La differenziazione in vitro di miofibre mature per Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Vivere Confocale Imaging di sviluppare Arabidopsis Fiori

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Un metodo per la caratterizzazione di embriogenesi in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and mammalian final host, respectively. The ability to isolate and sustain the different life cycle stages under in vitro culture conditions has greatly facilitated investigations of the cellular, biochemical and molecular mechanisms regulating parasite growth, development and host interactions. Transmission of schistosomiasis requires asexual reproduction and development of multiple larval stages within the snail host; from the infective miracidium, through primary and secondary sporocysts, to the final cercarial stage that is infective to humans. In this paper we present a step-by-step protocol for mass hatching and isolation of Schistosoma mansoni miracidia from eggs obtained from livers of infected mice, and their subsequent introduction into in vitro culture. It is anticipated that the detailed protocol will encourage new researchers to engage in and broaden this important field of schistosome research.

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

This article describes a protocol for the large-scale axenic isolation and collection of free-swimming miracidia of the human blood fluke Schistosoma mansoni and their subsequent processing for introduction into in vitro culture.

Massa isolamento e coltivazione In Vitro delle fasi Intramolluscan del trematode umano sangue Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Live Cell Imaging della segregazione cromosomica durante la mitosi

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

Trasferimento embrionale minimamente invasivo e vetrificazione embrionale nella fase embrionale ottimale nel modello Rabbit

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualizzare il nodo e la piastra Notochordal In embrioni di topo Gastrulating mediante microscopia elettronica a scansione e intero Monte immunofluorescenza

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...