저자가이 작품 (그랜트 # #7-13-학사-180), 미시간 주립 대학 연구 기술 지원 시설 교육 및는 vivo에서 이미징 시스템에 대 한 액세스를 제공 하기 위한 지원에 대 한 미국 당뇨병 협회를 감사 하 고 싶습니다 그리고 미시간 주립 대학 조사 Histopathology 연구소 histopathological 시험에 대 한 마우스 biopsies 처리.

동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 미시간 주립 대학에 의해 승인 했다.
 1. 폐색 드레싱의 준비 및 실리콘 스페이서 <ol><li>잘라 투명 한 폐색 드레싱을 사각형 약 1 cm × 1 cm가 위.</li>
	<li>잘라 10 m m 10mm 생 검 펀치. 센터 5mm 생 검을 사용 하 여 0.5 m m 두꺼운 실리콘 시트에 10 m m 원형 중간 펀치 원과 형태로 구멍을 만들고에 단단히 눌러는 &#34; 도넛 &#34;-부 목으로 사용 될 디스크 처럼.</li></ol>
 2. 실험 동물 상업적인 종 축에서 <ol><li>사용 8 주 오래 된 (22-26 g) 남성 SKH-1 쥐. 음식과 물에 21 ° C와 무료 12 h 빛 어두운 주기의 표준 상태에서 마우스를 유지.</li>
	<li>당뇨병을 유도 하는 13 mg/ml streptozotocin (STZ) solutionand 25% 마우스 intraperitonially 주사 포도 당 (당 250 µ l / 마우스) 5 일 연속에.
	<ol><li>Diluting 65 µ g STZ의 100 m 구 연산 산 성, pH 4.5 m의 5 µ L에 의해 STZ 솔루션 확인.</li>
		<li>각 마우스의 마우스 몸 무게 1 킬로그램 당 65 mg STZ의 마지막 질량에 대 한 삽입된 볼륨을 조정합니다. 같은 일에 100 m m 구 연산 산 성 솔루션 ph 4.5 통제 쥐를 주입.</li>
	</ol></li> <li>혈당 모니터링는 glucometer와 마지막 STZ 주입 후 14 일에 의해 혈당을 확인. 당뇨병 쥐 polyuria 있을 수 있습니다 그래서 그들의 침구 촉촉한 제거를 더 자주 변경 해야 할 수 있습니다 하 고 그들의 무게는 3 회 모니터링 해야 합니다.</li>
</ol> 3. Biofilms <ol><li>Biofilm 준비 <ol><li>성장 식민지 biofilms 8 상처를 예방 하. 2 일 수술 시작 전에 발광의 숙박 문화 P. 농 균 젠 tryptic 간장 국물 (TSB)에 41 37 ° C에서 incubated 200 rpm에서 떨고 있고 UV에 노출에 의해 0.2 µ m 기 공 크기와 폴 리 카보 네이트 멤브레인 필터를 소독 사이드 당 15 분에 대 한 생물 안전 후드에 빛.</li>
		<li>수술 전에 1 일 원심 20000 x g 2 분에 대 한 야간 문화 그리고 Dulbelcco의 1 mL로 3 번 세척 &#39; s 인산 아래로 pipetting으로 식 염 수 (DPBS) 버퍼링.</li>
		<li>0.05 600에서의 흡 광도를 DPBS에 현 탁 액 희석 nm.</li>
		<li>Tryptic 간장 agar (TSA) 접시에 각 막에 희석된 문화의 피 펫 10 µ L. 건조를 허용 후 모든 24 h. 신선한 TSA 격판덮개 전송 biofilms 성장 72 h 35 ° C에서 막 품 어</li>
	</ol></li> <li>표준 곡선 <ol><li>실험의 시작 이전에 게 생물 발광 및 세균 수를 연결 하는 표준 곡선.</li>
		<li>3.1에 설명 된 대로 biofilms 준비.</li>
		<li>는 시각적으로 균질 해결책은 생성 될 때까지 vortexing와 DPBS biofilm를 혼합 하 여 1/24 ½에서 배열 하는 biofilms의 직렬 희석 확인 합니다. 피 펫 200µL 블랙 96 잘 접시에 vivo에서 이미징 시스템 이미지 희석 솔루션.</li>
		<li>TSA 격판덮개에 격판덮개 dilutions와 24 h. 35 ° C에서 품 어</li>
		<li>접시에 콜로 니 형성 단위 (CFU)를 계산 하 고 생물 발광 및 세균 수를 연결 하는 표준 곡선을 만듭니다.</li>
	</ol></li></ol> 4. 수술 상처 <ol><li>1 L/min의 유량에서 isoflurane에에서 사용 95% oxygen/5% CO 2 (ketoacidosis에서 죽음을 방지) 전신 마 취 유도 및 유지 사용 하 여 1-3 %isoflurane 마 취. 수술 하는 동안 열 매트에 동물 유지.</li>
	<li>마우스의 깊은 페달 반사는 핀셋으로 발을 곤란 하 게 하 여 억제 하 고 발생 하기 쉬운 위치에 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>Meloxicam (0.2 mg/kg) 통증 관리에 대 한 하위 피부 주입 (30 μ)을 통해 관리.</li>
	<li>10 %povidone-요오드 세 번 다시와 소 프로 파 놀 패드의 피부를 닦아.</li>
	<li>살 균 4mm 생 검 펀치를 마우스의 1 개의 측에 상처에 대 한 하나의 원형 패턴 개요을 사용 하 여 &#39; s 중간 어깨의 수준에서. 영구 표시와 함께 패턴 개요.</li>
	<li>톱니 모양의 집게를 사용 하 여 panniculus carnosus를 포함 하 여 피하 조직을 통해 확장 하는 전체 두께 상처를 만들고 조직의 원형 조각을 소비 세 개요와 아이리스가 위 중간 피부.</li>
	<li>의료 방수 피부 접착제 접착제 쥐의 피부에 적용 하 고 가벼운 압력 실리콘 부를 배치 합니다. 투명 한 폐색 하는 드레싱으로 상처를 커버. 수술 후, 개별적으로 동물 케이지.</li>
</ol> 5. 수술 후 관리 <ol><li>meloxicam (0.2 mg/kg) 다음 2 일에 대 한 수술 후 통증에 대 한 하위 피부 주입을 통해 하루에 한 번씩 관리.</li>
	<li>매일 통증 및 체중 감소의 발현에 대 한 모니터 동물. 그들은 몸 무게의 15% 이상을 잃었을 때 당뇨병 동물 인슐린 주사 필요.</li>
</ol> 6. Biofilm Inoculum 준비 및 감염 <ol><li>다음 단계에 설명 된 대로 마우스 48 h 수술 후 예방.</li>
	<li>긁어 72 h biofilms 메 마른 주걱을 사용 하 여 막에서 그것 microcentrifuge 튜브에 놓고 DPBS에 1:2 희석 합니다. 짧게 위아래로 pipetting으로 믹스.</li>
	<li>확산 판 inoculum TSA 접시 총 CFU 계산 하에. 초음파 세탁 기술자에서 40 kHz에서 2 분 쥡니다 단계에 의해 삽입 된 두 개의 1 분 vortexing 단계 시리즈로 biofilm inoculum 더 뜨 개수 정확 하도록.</li>
	<li>상처와 실리콘 부 목 및 참조에 대 한 눈금자를 사용 하 여 연결 된 카메라와 현미경으로 상처의 현미경 사진 걸릴 드레싱 덮 음을 제거.</li>
	<li>200 µ L 피 펫 팁의 팁을 잘라내어 각 상처에 biofilm inoculum의 10 µ L 플라스틱.</li>
	<li>는 vivo에서 자동 설정을 사용 하 여 시스템 이미지를 사용 하 여 이미지 마우스: 노출 시간 5-300 s, 중간 binning, 1 f/정지 및 오픈 필터 및 보기의 필드 C (12.9 c m x 12.9 cm).</li>
	<li>커버 신선한 드레싱 상처.</li>
</ol> 7. 상처 측정 및 이미징 <ol><li>동물 일일 9의 임상 증상을 평가.</li>
	<li>음식을 제공, 물 및 필요에 따라 새 장 변경.</li>
	<li>확인 매일 드레싱의 무결성입니다. 드레싱 있으면, 상처의 폐색으로 인해 생물 발광만을 측정할 수 있습니다. 8 날, 드레싱 제거 되 고 상처 폐쇄의 허용 측정 바뀌지.</li>
	<li>무게 동물 매일.</li>
	<li>모든 일에 대 한 배치 마우스 개별적으로 고립 약 실에 HEPA 필터와는 vivo에서 매일 또는 하루 걸러 발광 값 배경 수준 이하로 떨어질 때까지 시스템 이미징 사용 하 여 이미지.</li>
	<li>8 일 후 전신 마 취를 유도 하 고 카메라로 현미경 현미경으로 상처의 연결 된 통치자를 참조 하 여 상처 치유 될 때까지 매일.</li>
</ol> 8. 조직학 분석 <ol><li>는 안락사에서 CO 2의 2 l/min의 흐름으로 쥐 발광 배경 수준 아래로 떨어지면 상처가 완전히 나 았 후 챔버 Euthanize. 안락사의 두 번째 방법으로 자 궁 경부 전위에 의해 죽음을 확인 하십시오.</li>
	<li>아이리스가 위 사용 하 여 만들고 주위와 아래 상처 영역 (직경 약 1 c m) 넓은, 전체 절단 조직학 분석을 위한 4 %paraformaldehyde 조직 보존.</li>
	<li>다른 분석: Cytokine 감지 <ol><li>복고풍 orbitally 유리 모 세관 튜브를 사용 하 여 마 취 동물에서 혈액을 수집 하 고 EDTA 대우 관에 그것을 전송.</li>
		<li>4 ° C에서 20 분 2000 rpm에서 혈액을 원심와 플라스마 cytokine 탐지에 대 한 동결.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>James, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms+in+chronic+wounds.">Biofilms in chronic wounds.</a> Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).</li><li>Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+health+care+costs+of+diabetic+peripheral+neuropathy+in+the+US.">The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US.</a> Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).</li><li>Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+system+for+quality+improvement+in+ambulatory+care:+assessing+the+quality+of+diabetes+care.">A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care.</a> Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).</li><li>Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+costs+of+diabetic+foot:+The+economic+case+for+the+limb+salvage+team.">The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team.</a> J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).</li><li>Rocchetta, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+noninvasive,+real-time+imaging+technology+using+bioluminescent+Escherichia+coli+in+the+neutropenic+mouse+thigh+model+of+infection.">Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).</li><li>Kadurugamuwa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+direct+method+for+monitoring+antibiotics+in+a+mouse+model+of+bacterial+biofilm+infection.">Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).</li><li>Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+antibiotic+penetration+limitation+in+Klebsiella+pneumoniae+biofilm+resistance+to+ampicillin+and+ciprofloxacin.">Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).</li><li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+for+establishing+humane+endpoints.">A systematic approach for establishing humane endpoints.</a> ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).</li><li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+wound+healing.">Murine model of wound healing.</a> J Vis Exp. (75), e50265 (2013).</li><li>Zhao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+wound+healing+in+diabetic+(db/db)+mice+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+challenge+-+a+model+for+the+study+of+chronic+wounds.">Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge - a model for the study of chronic wounds.</a> Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).</li><li>Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+superoxide+dismutase-mediated+inside-out+signaling+in+HaCaT+human+keratinocytes+and+SKH-1+mouse+skin.">Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin.</a> Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).</li><li>Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UVB+exposure+enhanced+benzanthrone-induced+inflammatory+responses+in+SKH-1+mouse+skin+by+activating+the+expression+of+COX-2+and+iNOS+through+MAP+kinases/NF-&#312;B/AP-1+signalling+pathways.">UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-&#312;B/AP-1 signalling pathways.</a> Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).</li><li>Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+treatment+modulates+the+host+immune+system+to+enhance+Pseudomonas+aeruginosa+wound+biofilms.">Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms.</a> Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

여기는 재현, 번역, 그리고 유연한 모델을 만드는 많은 이점이 당뇨 만성 상처에 biofilms의 연구에 대 한 새로운 마우스 모델에 설명 합니다.
첫 번째 혁신은 털이 없는 쥐의 사용 이다. 모든 왁 싱 또는 머리 클리핑 함께 포함 하는 프로세스에 의해 모피의 제거를 요구 하는 발 마우스의 사용에 의존 해야 하지만 다른 마우스 모델 당뇨병 만성 상처 치유10,</...

Biofilms 만성 상처1의 불 쌍 한 해상도 대 한 기여 요인으로 강조 된 고분자 물질의 매트릭스에 포함 된 미생물의 복잡 한 지역 사회는. 이 매우 조직적이 고 지속적인 미생물 인구의 연구는 특히 당뇨병 환자는 사지 및 변경 된 주변 감각 메커니즘에 냉 들 키 지 않고 병 변2이어질 중요 합니다. 미국에서는, 그것은 당뇨병 환자의 15% 그들의 생활의 과정 동안 적어도 하나의 궤를 개발할 것입니다 추정. 이 치료3,4, 약 28 십억 달러의 경제 비용 immensurable 정서적 및 사회적 부담을 언급 하지 않기 위하여 변환 됩니다. 상처 침대와 이러한 biofilms 치유 행사에 미칠 영향에 유지 하기 위해 미생물 커뮤니티를 허용 하는 요소를 이해 하는 것은 영향을 받는 환자에 대 한 더 나은 관리를 운전 하 고 새로운 치료 방법의 개발을 추진 하는 것이 필수적. 따라서, 재현할 수 및 번역 vivo에서 박테리아-호스트 상호 작용을 탐구에 대 한 모델의 설립은 최고 이다.
Murine 모델 biofilms 만성 상처에의 영향을 공부를 성공적으로 개발 되었습니다. 그러나이 모델,, 종종 머리 종 그리고 활용 biofilm 정리 삭제 조직의 희생된 동물, 시간이 소모 및 비용이 많이 드는 그들을 만들기에서 실행 가능한 박테리아 세포에 대 한 판 수에 의해 평가.
Biophotonic 대안 평가 감염 동물의 끝점 샘플링을 Contag 외에의해 처음 제안 했다. (1995) 5 , constitutively 발광 살 모 넬 라 typhimurium 항생제 치료 효능 측정 하에서 발광을 캡처하는 방법 개발. 생물 발광-발광 박테리아를 활용 하는 다른 연구 뒤. 예를 들어 Rochetta은 외. (2001 년) 6 발광 한 강화 전 하 결합 소자를 사용 하 여 측정 하 여 대장균 허벅지 감염 마우스에서 공부 하는 감염 모델 검증 및 나중에, Kadurugamuwa 외. (2003) 7 쥐에서 카 테 터 상처 모델에서 여러 가지 항생제의 효능을 조사 하기 위해 포도 상 구 균 의 설계 긴장의 방출 광자의 이용을 했다.
여기 특징 방법 선물 털이 없는 쥐에 있는 당뇨병을 유도, 생산 및 상처와 미리 형성한 발광 biofilms P. 녹 농 균 의 접종 및 biophotonic 감염의 모니터링을 실시 하는 간단한 프로토콜 사용 하는 비보에 이미징 시스템. 그것은 제공 하는 직접, 급속, 제자리에서비-침략 적, 양적 프로세스 biofilms 만성 상처에 평가 하 고 현미경 이미징 치유의 상처, 간헐적인 혈액 컬렉션에 대 한와 같은 또한 추가 분석에 대 한 수 cytokine 측정, 그리고 조직학에 대 한 터미널 조직 컬렉션.

<table><tbody><tr><td>Opsite</td><td>Smith &amp;amp; Nephew</td><td>Model 66000041</td><td>Smith &amp;amp; Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4&quot; x 11yards</td></tr><tr><td>SKH-1 mice &lt;strong&gt;Crl:SKH1-Hr&lt;/strong&gt;&lt;sup&gt;hr&lt;/sup&gt;</td><td>Charles River Breeding Laboratories</td><td>SKH1</td><td>Hairless mice, 8 weeks old</td></tr><tr><td>Streptozotocin (STZ)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0130-1G</td><td>Streptozocin powder, 1g</td></tr><tr><td>AccuChek glucometer</td><td>Accu-Chek Roche</td><td>Art No. 05046025001</td><td>ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa Xen 41</td><td>Perkin Elmer</td><td>119229</td><td>Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa</td></tr><tr><td>Polycarbonate membrane filters</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9199</td><td>Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 &amp;mu;m pore size</td></tr><tr><td>Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Tryptic soy agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22091</td><td>Culture agar</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>49755</td><td>Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection</td></tr><tr><td>10% povidone-iodine (Betadine)</td><td>Purdue Products LP</td><td>301879-OA</td><td>Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ61899AK</td><td>Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS</td></tr><tr><td>Capillary glass tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-566</td><td>Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes</td></tr><tr><td>Silicone to make splints</td><td>Invitrogen Life Technologies Corp</td><td>P-18178</td><td>Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets</td></tr><tr><td>Tryptic soy broth</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22092</td><td>Culture broth</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>In vivo imaging system</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum Isolation chamber</td><td>Perkin Elmer</td><td>123997</td><td>XIC-3 animal isolation chamber</td></tr><tr><td>HEPA filter</td><td>Teleflex</td><td>28022</td><td>Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022</td></tr><tr><td>Biopsy punches</td><td>VWR International Inc</td><td>21909-142</td><td>Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.</td></tr><tr><td>Biopsy punches</td><td>VWR International Inc</td><td>21909-140</td><td>Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>J.T.Baker</td><td>1916-01</td><td>Dextrose, Anhydrous, Powder</td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td>Citric Acid</td></tr><tr><td>Mastisol</td><td>Eloquest Healthcare</td><td>HRI 0496-0523-48</td><td>Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48</td></tr><tr><td>Corning 96-well black plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-567</td><td>96-well clear bottom black polysterene microplates</td></tr><tr><td>25 gauge 5/8 inch needle</td><td>BD</td><td>305122</td><td>Regular bevel needle</td></tr><tr><td>Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>N/A</td><td>Ultrasonic Cleaner</td></tr></tbody></table>

come to the light side: in vivo monitoring of pseudomonas aeruginosa biofilm infections in chronic wounds in a diabetic hairless murine model

당뇨병 환자, 특히 만성 상처에 구조적된 biofilms 박테리아의 존재는 상처 치유 및 해상도 방지 하기 위해 생각 된다. 만성 마우스 상처 모델 미생물와 호스트 간의 기본 상호 작용 이해에 사용 되었습니다. 최신 개발 모델 머리 동물의 사용 및 실행 가능한 박테리아의 결정에 대 한 상처 조직의 터미널 컬렉션에 의존 합니다. 이러한 모델 인 사이트를 얻고,이 실험적인 절차 필요 동물의 많은 수 및 샘플링 시간이 소모 되는 중요 한 동안. 우리는 만성 상처에 biofilm 진행을 평가 하기 위해 몇 가지 최적의 혁신을 통합 하는 소설 murine 모델 개발: 한) 털 쥐, 머리 제거;에 대 한 필요성을 제거 사용 b) 지 속성의 즉각적인 평가 호스트;에이 커뮤니티의 효과 대 한 수 있도록 상처에 미리 형성 된 biofilms 적용 c) 녹 농 균, 따라서 연구 당 필요한 동물의 수를 줄이고 감염의 실시간 감시를 허용의 유전자 조작된 발광 변형에 의해 빛 생산 측정 모니터링 biofilm 진행 합니다. 이 모델에서 단일 전체 깊이 상처는 STZ 유도 당뇨병 털 쥐의 뒷면에 생산과 P. 농 균 발광 스트레인 젠 41의 biofilms와 주사. 상처에서 광 출력을 vivo에서 이미징 시스템, vivo에서 그리고 제자리에서 빠른 biofilm 시각화 및 상처 내 biofilm 박테리아의 지역화에 대 한 허용에 매일 기록 됩니다. 이 새로운 메서드는 유연한 유전자 조작된 종 등 여러 종 biofilms, 다른 미생물을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다 하 고 항균 성 폐색 드레싱을 포함 한 안티 biofilm 전략 테스트에 특별 한 가치가 있을 수 있습니다.

이 새로운 모델을 개발, C57BL/6J 쥐, 우리가 과거에 사용 되는 동안 털 SKH-1을 활용에 많은 이점이 관찰 합니다. 동물 STZ 주사를 정상적으로 받게; 당뇨병의 발병과 점진적 체중 감소 경험 그러나, 상처 치유 실험 이전 실시 던 외제시한 모델을 재현 하는 우리의 실험실에 의해. (2012 년) 9 C57BL/6J, 급격 한 체중 감소를 사용 하 여 (그림 1</...

Watch this Scientific Journal Video about Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model at JoVE.com

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

라이트 사이드에와 서: Vivo에서 당뇨병 털 Murine 모델에 만성 상처에서 녹 농 균 Biofilm 감염의 모니터링

여기는 실시간, 비-침략 적, 발광 녹 농 균의 biofilm 상처 감염의 모니터링을 위한 털 쥐를 활용 하 여 새로운 당뇨병 murine 모델에 설명 합니다. 이 메서드는 다른 세균성 종 및 다 종 biofilms를 포함 하 여 유전자 변형된 미생물의 감염을 평가 하 고 antibiofilm 전략의 효능 테스트에 적용할 수 있습니다.

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

come-to-light-side-vivo-monitoring-pseudomonas-aeruginosa-biofilm

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

13.2K 조회수.  Michigan State University. 여기는 실시간, 비-침략 적, 발광 녹 농 균의 biofilm 상처 감염의 모니터링을 위한 털 쥐를 활용 하 여 새로운 당뇨병 murine 모델에 설명 합니다. 이 메서드는 다른 세균성 종 및 다 종 biofilms를 포함 하 여 유전자 변형된 미생물의 감염을 평가 하 고 antibiofilm 전략의 효능 테스트에 적용할 수 있습니다.

비디오: Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

연구

면역학 및 감염병학

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

상처 치유의 생쥐 모델

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

의학

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans biofilms have been studied predominantly in vitro but there is a crucial need for better understanding of this dynamic process under in vivo conditions. We developed an in vivo subcutaneous rat model to study C. albicans biofilm formation. In our model, multiple (up to 9) Candida-infected devices are implanted to the back part of the animal. This gives us a major advantage over the central venous catheter model system as it allows us to study several independent biofilms in one animal. Recently, we adapted this model to study C. albicans biofilm development in BALB/c mice. In this model, mature C. albicans biofilms develop within 48 hr and demonstrate the typical three-dimensional biofilm architecture. The quantification of fungal biofilm is traditionally analyzed post mortem and requires host sacrifice. Because this requires the use of many animals to perform kinetic studies, we applied non-invasive bioluminescence imaging (BLI) to longitudinally follow up in vivo mature C. albicans biofilms developing in our subcutaneous model. C. albicans cells were engineered to express the Gaussia princeps luciferase gene (gLuc) attached to the cell wall. The bioluminescence signal is produced by the luciferase that converts the added substrate coelenterazine into light that can be measured. The BLI signal resembled cell counts obtained from explanted catheters. Non-invasive imaging for quantifying in vivo biofilm formation provides immediate applications for the screening and validation of antifungal drugs under in vivo conditions, as well as for studies based on host-pathogen interactions, hereby contributing to a better understanding of the pathogenesis of catheter-associated infections.

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

생물 발광 영상에 이어 마우스 피하 모델의 의학 관련 외국 기관에 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)에 바이오 필름 ​​개발

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

만성 슈도모나스 녹농증 상처 감염의 지연 접종 모델

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine models provide valuable mechanistic insight into these processes; however, no single model fully addresses all aspects of the wound healing response. Instead, it is ideal to use multiple models to address the different aspects of wound healing. Here, two different methods that address diverse aspects of the wound healing response are described. In the first model, polyvinyl alcohol sponges are subcutaneously implanted along the mouse dorsum. Following sponge retrieval, cells can be isolated by mechanical disruption, and fluids can be extracted by centrifugation, thus allowing for a detailed characterization of cellular and cytokine responses in the acute wound environment. A limitation of this model is the inability to assess the rate of wound closure. For this, a tail skin excision model is utilized. In this model, a 10 mm x 3 mm rectangular piece of tail skin is excised along the dorsal surface, near the base of the tail. This model can be easily photographed for planimetric analysis to determine healing rates and can be excised for histological analysis. Both described methods can be utilized in genetically altered mouse strains, or in conjunction with models of comorbid conditions, such as diabetes, aging, or secondary infection, in order to elucidate wound healing mechanisms.

Here, two murine wound healing models are described, one designed to assess cellular and cytokine wound healing responses and the other to quantify the rate of wound closure. These methods can be used with complex disease models such as diabetes to determine mechanisms of various aspects of poor wound healing.

등지성 폴리비닐 알코올 스폰지 이식 및 절제 꼬리 피부 상처 모델을 사용하여 급성 상처 치유의 평가.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ~6.5M people and cost ~$40B/year in the US alone. Although a significant effort has been invested in understanding how chronic wounds develop in humans, fundamental questions remain unanswered. Recently, we developed a novel mouse model for diabetic chronic wounds that have many characteristics of human chronic wounds. Using db/db-/- mice, we can generate chronic wounds by inducing high levels of oxidative stress (OS) in the wound tissue immediately after wounding, using a one-time treatment with inhibitors specific to the antioxidant enzymes catalase and glutathione peroxidase. These wounds have high levels of OS, develop biofilm naturally, become fully chronic within 20 days after treatment and can remain open more for more than 60 days. This novel model has many features of diabetic chronic wounds in humans and therefore can contribute significantly to advancing fundamental understanding of how wounds become chronic. This is a major breakthrough because chronic wounds in humans cause significant pain and distress to patients and result in amputation if unresolved. Moreover, these wounds are very expensive and time-consuming to treat, and lead to significant loss of personal income to patients. Advancements in this field of study through the use of our chronic wound model can significantly improve health care for millions who suffer under this debilitating condition. In this protocol, we describe in great detail the procedure to cause acute wounds to become chronic, which has not been done before.

Chronic wounds are developed from acute wounds on a diabetic mouse model by inducing high levels of oxidative stress after a full-thickness cutaneous wound. The wound is treated with inhibitors for catalase and glutathione peroxidase, resulting in impaired healing and biofilm development by bacteria present in the skin microbiome.

당뇨병 마우스에서 만성 상처를 만드는 프로토콜

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds

Biofilm-related infections are implicated in a wide array of chronic conditions such as non-healing diabetic foot ulcers, chronic sinusitis, reoccurring otitis media, and many more. Microbial cells within these infections are protected by an extracellular polymeric substance (EPS), which can prevent antibiotics and host immune cells from clearing the infection. To overcome this obstacle, investigators have begun developing dispersal agents as potential therapeutics. These agents target various components within the biofilm EPS, weakening the structure, and initiating dispersal of the bacteria, which can theoretically improve antibiotic potency and immune clearance. To determine the efficacy of dispersal agents for wound infections, we have developed protocols that measure biofilm dispersal both ex vivo and in vivo. We use a mouse surgical excision model that has been well-described to create biofilm-associated chronic wound infections. To monitor dispersal in vivo, we infect the wounds with bacterial strains that express luciferase. Once mature infections have established, we irrigate the wounds with a solution containing enzymes that degrade components of the biofilm EPS. We then monitor the location and intensity of the luminescent signal in the wound and filtering organs to provide information about the level of dispersal achieved. For ex vivo analysis of biofilm dispersal, infected wound tissue is submerged in biofilm-degrading enzyme solution, after which the bacterial load remaining in the tissue, versus the bacterial load in solution, is assessed. Both protocols have strengths and weaknesses and can be optimized to help accurately determine the efficacy of dispersal treatments.

Here, we describe ex vivo and in vivo methods for assessing bacterial dispersal from a wound infection in mice. This protocol can be utilized to test the efficacy of topical antimicrobial and anti-biofilm therapies, or to assess the dispersal capacity of different bacterial strains or species.

뮤린 상처에서 생물막 분산 평가

Biofilm-related infections are implicated in a wide array of chronic conditions such as non-healing diabetic foot ulcers, chronic sinusitis, reoccurring ...

생물막에 감염된 화상 상처 연구를 위한 장기 돼지 모델 개발

Swine Model of Biofilm Infection and Invisible Wounds

Biofilm infection is a major contributor to wound chronicity. The establishment of clinically relevant experimental wound biofilm infection requires the involvement of the host immune system. Iterative changes in the host and pathogen during the formation of such clinically relevant biofilm can only occur in vivo. The swine wound model is recognized for its advantages as a powerful pre-clinical model. There are several reported approaches for studying wound biofilms. In vitro and ex vivo systems are deficient in terms of the host immune response. Short-term in vivo studies involve acute responses and, thus, do not allow for biofilm maturation, as is known to occur clinically. The first long-term swine wound biofilm study was reported in 2014. The study recognized that biofilm-infected wounds may close as determined by planimetry, but the skin barrier function of the affected site may fail to be restored. Later, this observation was validated clinically. The concept of functional wound closure was thus born. Wounds closed but deficient in skin barrier function may be viewed as invisible wounds. In this work, we seek to report the methodological details necessary to reproduce the long-term swine model of biofilm-infected severe burn injury, which is clinically relevant and has translational value. This protocol provides detailed guidance on establishing an 8 week wound biofilm infection using P. aeruginosa (PA01). Eight full-thickness burn wounds were created symmetrically on the dorsum of domestic white pigs, which were inoculated with (PA01) at day 3 post-burn; subsequently, noninvasive assessments of the wound healing were conducted at different time points using laser speckle imaging (LSI), high-resolution ultrasound (HUSD), and transepidermal water loss (TEWL). The inoculated burn wounds were covered with a four-layer dressing. Biofilms, as established and confirmed structurally by SEM at day 7 post-inoculation, compromised the functional wound closure. Such an adverse outcome is subject to reversal in response to appropriate interventions.

저자 스포트라이트: 상처 생물막 형성에서 숙주-미생물 상호 작용 연구 

Chronic wounds that are resistant to antibiotics are a major threat to the healthcare system. Biofilm infections are stubborn and hostile and can cause deficient functional wound closure. We report a clinically relevant swine model of biofilm-infected full-thickness chronic wounds. This model is powerful for mechanistic studies as well as for testing interventions.

생물막 감염 및 보이지 않는 상처의 돼지 모델

Biofilm infection is a major contributor to wound chronicity. The establishment of clinically relevant experimental wound biofilm infection requires the ...

라이트 사이드에와 서: Vivo에서 당뇨병 털 Murine 모델에 만성 상처에서 녹 농 균 Biofilm 감염의 모니터링

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

상처 치유의 생쥐 모델

장기 만성

생물 발광 영상에 이어 마우스 피하 모델의 의학 관련 외국 기관에 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)에 바이오 필름 개발

만성 슈도모나스 녹농증 상처 감염의 지연 접종 모델

등지성 폴리비닐 알코올 스폰지 이식 및 절제 꼬리 피부 상처 모델을 사용하여 급성 상처 치유의 평가.

당뇨병 마우스에서 만성 상처를 만드는 프로토콜

뮤린 상처에서 생물막 분산 평가

생물막 감염 및 보이지 않는 상처의 돼지 모델

생물막 감염 및 보이지 않는 상처의 돼지 모델

라이트 사이드에와 서: Vivo에서 당뇨병 털 Murine 모델에 만성 상처에서 녹 농 균 Biofilm 감염의 모니터링

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

흐름 세포 녹농균 및 Saccharomyces cerevisiae의의 Biofilm

상처 치유의 생쥐 모델

장기 만성

생물 발광 영상에 이어 마우스 피하 모델의 의학 관련 외국 기관에 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)에 바이오 필름 ​​개발

만성 슈도모나스 녹농증 상처 감염의 지연 접종 모델

등지성 폴리비닐 알코올 스폰지 이식 및 절제 꼬리 피부 상처 모델을 사용하여 급성 상처 치유의 평가.

당뇨병 마우스에서 만성 상처를 만드는 프로토콜

뮤린 상처에서 생물막 분산 평가

생물막 감염 및 보이지 않는 상처의 돼지 모델

생물막 감염 및 보이지 않는 상처의 돼지 모델

생물 발광 영상에 이어 마우스 피하 모델의 의학 관련 외국 기관에 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)에 바이오 필름 개발