미생물학자와 전염병 의사는 만성 질환에서 생물막 관련 감염이 얼마나 중요한지 깨닫기 시작했습니다. NIH는 만성 감염의 80% 이상이 세균성 생물막 때문이라고 말했습니다. 그래서 이것은 생물막 문제를 해결하고 생물막 문제를 해결하는 치료법을 개발하는 데 중점을 두라고 촉구했습니다.
그리고 그 치료법은 생물막에서 생물막에 있는 세균 세포를 분산시키는 데 초점을 맞추고 있기 때문에 더 쉽게 죽일 수 있습니다. 그러나 실제로 이러한 분산 제의 효능을 결정하는 방법을 다루는 현재 문학에 많은 프로토콜이 없습니다. 그래서 우리는 이것이 사용하기에 좋은 프로토콜이라고 느낍니다.
그것은 생물막 관련된 세균성 감염의 한 모형입니다. 그리고 우리는 또한 세균성 종의 많은 다른 모형을 연구하기 위하여 아주 쉽게 최적화될 수 있고, 어떻게 생물막을 형성하고 분산하는지, 뿐만 아니라 다른 분산 에이전트를 공부하기 위하여 아주 쉽게 최적화될 수 있다고 생각합니다. 그리고 우리는 우리가 마우스에서 최적으로 작동을 발견한 에이전트의 납품에 특히 뉘앙스가 있다는 것을 보았기 때문에 비디오 형식으로 이것을 전달하는 것이 중요하다고 생각합니다.
시작하려면 발가락 핀치에 의해 마취의 평면을 평가하고 호흡 률과 노력을 모니터링합니다. 등쪽 표면을 면도하고 면도 부위에 10분 간 또는 제품의 지침에 따라 탈필 크림을 바르십시오. 디필 크림을 부드럽게 제거합니다.
그리고 피부가 건조한지 확인하십시오. 알코올 방지 마커를 사용하여 뒷면의 후방 영역을 향해 직경 1.5cm의 원을 그립니다. 통증 관리를 위해, 투여할 지역에 피하로 리도카인의 0.05 밀리리터를 투여하십시오.
그리고 0.02 밀리리터의 부프레노르핀은 목 덜미에 피하한다. 통증 관리에 도달하려면 10 분 동안 기다립니다. 절제하기 전에 알코올 면봉을 사용하여 소독 표면을 소독하십시오.
시술 내내 멸균 수술장을 유지하고, 오토클레이브 기기와 멸균 장갑을 사용하여 오염을 제한합니다. 외과 가위와 함께 판니큘러스 근육의 수준으로 전체 두께 의 흥분 피부 상처를 관리합니다. 절제 후, 반투과성 폴리우레탄 드레싱으로 상처를 즉시 덮습니다.
해당되는 경우 두 개의 미세 한 양면으로 드레싱과 백업을 조심스럽게 분리하십시오. 약 10 세균의 제 4 CFU에 약 10, 100 마이크로 리터 PBS 드레싱 아래 와 상처 침대에 감염을 설정 합니다. 참고, 상처는 또한 박테리아 및/또는 곰팡이의 다중 종에 동시에 감염될 수 있고, 또는 전형성된 생물막 또는 상처 침대에 환자에게서 추출한 탈량 조직을 배치하여 감염될 수 있습니다.
감염 후, 쥐가 침구 물질에 질식하는 것을 방지하기 위해 종이 타월 위에 케이지에 마우스를 배치합니다. 케이지를 가열 패드에 놓고 마우스가 올바른 반사를 되찾을 때까지 마우스를 모니터링합니다. 이 시점에서 종이 타월을 제거합니다.
상처 감염이 48 시간 동안 확립되도록 허용하십시오. 매일 드레싱을 검사하여 무너지 않은 부위에 눈물을 흘리고 필요한 경우 교체하십시오. 치료를 투여하는 동안 이소플루란 마취 하에 마우스를 3 %와 산소 분당 1 리터로 놓습니다.
200 마이크로리터의 효소 용액 또는 PBS 제어를 통해 피부의 앞쪽을 집게로 약간 앞쪽으로 들어 올리고, 주사기로 들어올린 피부를 조심스럽게 관통하고, 상처 침대와 드레싱 사이의 부위에 용액을 천천히 주입하여 상처에 주입하십시오. 상처 침대 전체가 용액으로 덮여 있는지 확인하기 위해, 부드럽게 집게로 드레싱을 들어 올리고 상처 침대에서 꺼내서 천천히 용액을 주입합니다. 치료 후, 30 분 동안 케이지에 다시 마우스를 배치합니다.
치료에 30 분 동안 노출 된 후, 이소플루란으로 마우스를 재마취하고 주사기로 나머지 용액을 흡인하고 이전과 동일한 영역에서 구멍을 뚫습니다. 참고, 이 흡량 제 솔루션은 분산된 세균 세포를 포함하며, 이는 다양한 다운스트림 분석을 위해 저장될 수 있습니다. 매번 새로운 주사기를 사용하여 첫 번째로 수행된 바와 같이 두 번째 및 세 번째 관개 처리를 관리한다.
박테리아의 발광 긴장이 감염을 시작하기 위하여 이용되는 경우에, 생체 내 화상 진찰 시스템은 상처 침대에서 분산을 구상하기 위하여 이용될 수 있습니다. 분석을 위해 IVIS 소프트웨어의 이미지를 열고 도구 팔레트로 분석할 영역을 선택합니다. 배경을 고려하려면 이미지 의 배경에 원을 놓은 다음 각 마우스의 상처 침대 위에 동일한 크기의 원을 배치합니다.
도구 팔레트에서 ROI 측정을 선택하고 측정 테이블을 스프레드시트에 업로드합니다. 각 상처 침대 측정에서 백그라운드 원을 빼서 각 샘플에 대한 발광을 계산합니다. 인도적인 안락사 후, 먼저 멸균 집게로 드레싱을 부드럽게 제거하고 멸균 수술 가위로 상처 침대의 둘레를 절단하여 상처 침대 조직을 수확하십시오.
집게를 사용하여 상처 침대의 한쪽 끝을 부드럽게 들어 올린 다음 가위를 사용하여 조직 샘플을 근육 층에서 잘라냅니다. PBS의 1 밀리리터를 포함하는 미리 계량된 2밀리리터 균질화 관에 조직 샘플을 놓습니다. 샘플을 삽입한 후 튜브의 무게를 다시 측정합니다.
비장을 수확하려면 마우스를 해부학적 위치에 놓고 사지를 해부 표면에 고정하여 고정하십시오. 오염을 방지하기 위해 70 %의 에탄올로 해부 할 지역을 적들. 하복부의 진피에 외과 가위를 가진 중간선에 수직으로 작은 절개를 합니다.
내부 장기에서 피부를 위로 끌어당기십시오. 흉골에 도달할 때까지 중간선을 따라 절개를 계속합니다. 복막 구멍이 노출되고 내부 장기가 보이면 비장을 결합 조직으로부터 분리하고 별도의 미리 계량된 균질화 튜브에 배치합니다.
비장을 삽입 한 후 튜브의 무게를 다시 합니다. 샘플을 초당 5미터에서 60초, 2회 균질화합니다. CFU를 열거하기 위해, 동질화된 샘플을 연속적으로 희석하고 현물 플레이트.
동질화된 시료의 100마이크로리터를 PBS 의 900 마이크로리터와 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 파이프팅하여 연일 희석합니다. 희석된 샘플의 100마이크로리터를 PBS 의 900 마이크로리터를 포함하는 별도의 튜브로 배관하여 희석을 계속하기 전에 소용돌이. 6개의 희석이 달성될 때까지 이 단계를 반복합니다.
그림과 같이 한천 판의 표시된 영역에 각 희석제의 파이펫 10 마이크로리터. 더 정확한 CFU 수량이 필요한 경우 별도의 한천 플레이트에 샘플의 각 희석제 100 마이크로리터를 확산시면 됩니다. 세균의 약 10~제4 CFU를 가진 세균을 결합하고 감염시키는 것은 생체 내 프로토콜에 기재된 바와 같이.
감염이 48 시간 동안 확립되도록 허용한 다음 생체 내 프로토콜과 유사한 방식으로 상처 침대를 추출하십시오. 드레싱을 조심스럽게 제거하여 시작합니다. 상처의 둘레를 절단.
그리고 근육 층에서 분리. 상처 침대 샘플은 샘플 수를 늘리기 위해 여러 섹션으로 나눌 수 있습니다. 그런 다음 분할된 샘플을 별도의 미리 계량된 빈 균질화 튜브에 넣습니다.
튜브의 무게를 다시 계량하고 샘플과 튜브의 무게에서 샘플없이 튜브의 무게를 빼서 샘플의 무게를 계산합니다. 샘플을 포함하는 균질화 튜브에 PBS의 1 밀리리터를 추가하고 튜브를 몇 번 부드럽게 반전하여 헹구십시오. PBS 세척을 제거하고 폐기하십시오.
GH 치료의 1 밀리 리터를 추가, 또는 부정적인 제어로 PBS, 그리고 섭씨 37도에서 2 시간 동안 배양, 80 RPM에서 흔들어. 분산 용액에서 담즙을 제거하고 별도의 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브에 배치하십시오. 여기에는 분산된 셀이 포함됩니다.
이전과 마찬가지로 나머지 조직을 PBS의 1 밀리리터로 세척하고 PBS 세척을 폐기하십시오. 나머지 조직에 PBS 1밀리리터를 추가하고 초당 5미터에서 60초 동안 균질화합니다. 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에서 샘플의 100 마이크로리터를 PBS의 900 마이크로리터로 파이프팅하여 분산 된 세포의 용액과 균질화 된 조직 샘플을 연속적으로 희석시.
희석된 시료를 소용돌이치고 총 6개의 희석제에 대해 희석을 5회 더 지속한다. 현물 플레이트는 선택적인 한천 판의 표시된 영역에 각 희석제 의 10 마이크로리터를 파이프팅하여 샘플을 플레이트한다. 분산된 CFU를 총 CFU로 나누고 100으로 곱하여 CFU를 계산하고 백분율 분산을 계산합니다.
이 실험에서, 8-10 주 된 여성 스위스 웹스터 마우스는 발광 플라스미드 PQF50-lux를 운반 PA01의 네 번째 CFU에 10에 감염되었다. 감염은 PBS의 3개의 30분 처리를 차량 통제로, 또는 생물막 EPS를 소화하기 위하여 실험적인 처리로 10% GH를 관리하기 전에 48 시간 동안 설치할 수 있었습니다. 섹션 A에 나타난 마우스는 치료 후 직접 전처리를 영상화하고 치료 후 10 시간 및 20 시간 후에 이미지화되었습니다.
IVIS를 사용하여, 확립된 감염은 밝은 생물 발광 신호를 생성하는 상처 침대 안에 시각화될 수 있습니다. 상처 침대에서 박테리아의 분산은 GH 치료 직후에 시각화 할 수 있지만 PBS 치료 후는 시각화 할 수 없습니다. 장기내 세균 성 보급은 또한 아래 패널에 나타난 바와 같이, 이미징을 위해 측면에 마우스를 배치하여 볼 수 있습니다.
B섹션에서, PBS와 GH 처리마우스 둘 다에서 심상은 전처리에 비해 처리 후 20 시간에서 발광 신호의 증가를 보여주었습니다. 그러나 IVIS에서 발광의 검출 임계값으로 인해 CFU를 수량화하는 것이 여전히 중요합니다. 치료 후 20시간 에서, 마우스는 안락사되었고 상처 침대와 비장들은 조직 1그램당 CFU를 예포하기 위해 수집되었다.
C섹션은 상처 침대에 세균 부하를 표시하고, 섹션 D는 비장의 세균 부하를 나타낸다. 이러한 데이터는 박테리아가 EPS 표적 GH 용액으로 처리된 마우스의 비장에서만 검출되었기 때문에 분산된 박테리아의 확산을 시사합니다. 이러한 프로토콜은 매우 유용하지만 몇 가지 제한 사항이 있습니다.
첫째, 생체 내 이미징 시스템 또는 IVIS에 대한 검출 제한이 있다는 점에 유의해야 한다. 발광 신호의 감소는 박테리아가 고정 된 단계를 입력 할 때 볼 수 있습니다. 따라서 발광과 CFU 열거 된 사이에 단절이있을 수 있으므로 관심있는 조직을 수집하고 현재 CFU를 측정하는 것이 중요합니다.
그러나, IVIS는 실제로 동물을 안락사할 필요 없이, 연구 를 통해 처리의 효험을 시각화하는 데 유용합니다. 고려해야 할 또 다른 제한 사항은 붕대를 면밀히 모니터링해야 한다는 것입니다. 붕대는 수축 치유를 줄이고 다른 박테리아에서 상처 멸균을 유지하는 데 필요합니다.
붕대를 자주 교체해야 하므로 상처의 우발적인 손상과 오염 의 기회로 이어질 수 있습니다. 이러한 프로토콜은 분산제에서 담즙을 연구하는 새로운 방법과 분산 제에서 치료 담즙의 평가를 설명합니다. 이 모형은 임상적으로 관련있는 인간 적인 감염을 모방하는 복잡한 polymicrobial biofilm 관련 감염의 발달을 허용합니다.
우리의 희망은 이러한 프로토콜이 치료 용 항 생물막 분산제의 개발을 더욱 강화하기 위해 활용되고 정제될 것입니다.
