이 작품은 국가 심 혼에 의해 지원 되었다, 폐 및 혈액 학회 R01088554, T32HL007284 및 미국 심 혼 협회 predoctoral 친목 14PRE20420024 부여 합니다. 우리는 특히 세인트 주드 세포 이미징 공유 연구 핵심, 랜달 웨이크필드와 전자 현미경 이미지에 대 한 린다 Horner, 아담 스트로브를 통해 대표적인 면역 형광 이미지, 및 그녀에 대 한 Pooneh Bagher를 포함 하 여 감사 합니다. 원고 프로토콜에 귀중 한 피드백입니다.

1. 도금 셀은 VCCC <ol><li>문화 큰 225 cm 2 플라스 크 EC 및 SMC의 70-90% 합칠 때까지 37 ° C에서 살 균 조건 하에서. SMC 보다 더 많은 EC는 사용; 기본 인간 EC 및 SMC, SMC의 1 큰 플라스 크를 EC의 일반적으로 3 큰 플라스 크를 사용 하 여 경우.
	<ol><li>낮은 구절에서 1 차 셀을 사용 하 고 통로 10 과거 사용 하지 마십시오. 문화 미디어 기반 공동 경작 될 셀을 선택 하십시오. 기본 인간 관상 동맥 EC, EGM2 MV 성장 요인으로 EBM-2 EC 기저 미디어를 사용 합니다. 기본 인간 관상 SMC, SmGM-2 성장 요소와 SmBM SMC 기저 미디어를 사용 합니다. 배양된 세포와 함께 사용, 이전을 미디어 성장 요인 추가.</li>
	</ol></li> <li>VCCC 주 1의 건설: 살 균 제 (예, Cavicide)와 큰 (150 m m) 접시와 뚜껑을 스프레이 종이 타월 또는 보풀 물티슈로 닦아. 그런 다음 70% 에탄올 (EtOH) 페 트리 접시를 살포 하 고 건조 공기를 후드에 배치.</li>
	<li>무 균 조건 하에서 필터 삽입 (재료의 표 참조)의 접시 열고 코트 fibronectin 솔루션 삽입의 SMC 측면 (필터의 밑바닥 측). 확인 하단의 필터의 절반은 (더 이상 1 mL)을 적용 하 고, 접시의 바닥에 슬릿 피펫으로 측면을 통해 fibronectin 솔루션 제공된 6 잘 플레이트에 삽입을 유지,.</li>
	<li>실내 온도 셀 문화 후드에 fibronectin 솔루션 치료 후 30 분 접시에서 삽입, 진공 모든 초과 솔루션 및 반전, 깨끗 한 페 트리 접시의 절반을 하단에 배치. 따로 설정 합니다. 초과 솔루션; suctioning 때 필터 삽입 멤브레인을 방해 하지 않도록 주의 하십시오 이 부드럽게 접시, 기울이기 및 삽입의 가장자리에서 솔루션을 진공 청소기로 청소 하 여 방지할 수 있습니다.</li>
	<li>Trypsinize 225 cm 2 플라스 크의 SMC 미리 데워 2 X 트립 신-EDTA 솔루션, 그리고 일단 세포가 접시를 낸 3 mL와 함께 9 mL SMC 미디어 트립 신 (3:1, 미디어: trypsin) 중화를 추가 합니다. 원뿔 튜브에 전송, 잘, 그리고 핸드폰 번호를 확인 하려면 hemocytometer에 피펫으로 10 µ L.
	<ol><li>수 5 x 5 셀의 수 상자 (즉, 18), 1 ml (180000) 셀의 수를 10, 000을 곱하면이 됩니다. 다음 12 mL (총 볼륨 세포 현 탁 액, 2.16 백만 SMC의)를 곱하십시오. 충분 한 SMC 접시 우물의 원하는 번호를 확인 하십시오. 
		참고: 예를 들어 1 잘 75000 SMC 있고 따라서 18 우물 1.35 백만 총 SMC 했. 1.35 백만 세포 1 mL 당 180000 셀에 필요한 분할 하 고 도금 하는 데 필요한 세포 현 탁 액의 7.5 mL에이 결과. 다음 계산 필요 마지막 볼륨 (18 우물 x 750 µ L = 13.5 mL). 따라서, 세포 현 탁 액의 7.5 mL, 볼륨을가지고 미리 따뜻하게 SMC 미디어와 잘 혼합 최대 13.5 mL.</li>
	</ol></li> <li>약 75000 SMC 각 필터의 아래쪽 면에 미디어와 셀 솔루션의 유출 하지 않도록 주의 되 고 포함 된 셀 서 스 펜 션의 플레이트 750 µ L. 뚜껑 위에 놓고 신중 하 게 삽입 된 페 트리 접시에 전송 37 ° C에서 인큐베이터 하룻밤. 
	참고: 다른 셀 형식에 대 한 최적의 셀 밀도 경험적으로 결정 해야 합니다.</li>
	<li>하루에 2, 채워 깨끗 한 6 잘 요리 신선한, 미리 데워 진 SMC 미디어의 2 mL. 인큐베이터에서 플레이트를 제거 합니다. 삽입 한 번에 하나를와 미디어 흡입, 다음 SMC 미디어 6-잘 접시에 놓습니다.</li>
	<li>37에서 적어도 30 분 동안 0.5% 소 젤라틴 해결책의 1 mL로 필터 (EC 측)의 반대편 코트 ° c.</li>
	<li>미리 데워 2의 3 mL와 EC의 225 cm 2 flask(s) trypsinize X 트립 신-EDTA (10 x 메 마른 Dulbecco에 희석 &#39; s PBS) 솔루션, 접시에서 셀 리프트 위해 플라스 크의 부드러운 도청. 
	참고: 그것은 다시 1-3 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 플라스 크를 필요할 수 있습니다.
	<ol>한 번 <li>셀 접시를 낸는 9 mL EC 미디어 트립 신 (3:1) 중화를 추가 합니다. 원뿔 튜브, 수영장을 함께 전송, 잘, 그리고 핸드폰 번호를 확인 하려면 hemocytometer에 피펫으로 10 µ L를 혼합.
		<ol><li>수 5 x 5 셀의 수 상자 (즉, 60), 1 ml (600000) 셀의 수를 10, 000을 곱하면이 됩니다. 다음 12 mL (총 볼륨 세포 현 탁 액, 7.2 백만 EC의)를 곱하십시오. 충분 한 EC 격판덮개 우물의 원하는 번호를 확인 하십시오. 
			참고: 약 360000 EC는 잘 당 필요. 예를 들어 18 우물 6.48 백만 적 필요 1 mL 당 600000 EC에 필요한 6.48 백만 셀 분할 하 고 도금 하는 데 필요한 세포 현 탁 액의 10.8 mL에이 결과. 다음 계산 필요 마지막 볼륨 (18 우물 1 mL = 18 mL x). 따라서, 세포 현 탁 액의 10.8 mL, 최대 볼륨을가지고 18 mL와 함께 미리 EC 미디어를 예 열 하 고 부드럽게 resuspend.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>각 삽입 필터의 상단 측면에 360000 EC의 1 mL 접시. 셀 4 일에 24 h. 대체 매체에 대 한 37 ° C에서 그대로 품 어 보자. 5 당일 수확.</li>
</ol> 2. 분수는 VCCC에서 수확 <ol><li>4 ° C 방에 격리를 수행 하 고 얼음에 모든 악기를 유지</li>
	<li>마음에 고립 되 고 개별 삽입의 수를 유지 하 고 (격리 된 필터)에 대 한 MEJ 분류 50 mL 튜브에 세포의 용 해 버퍼를 추가. 다음 레이블 두 10mm 요리; EC 및 SMC.</li>
	<li>조정 어떻게 집중은 lysate 해야; 15에 대 한 삽입에 따라 세포의 용 해 버퍼의 볼륨, MEJ 튜브에 대 한 세포의 용 해 버퍼의 500 µ L 및 페 트리 접시 당 250 µ L 좋습니다.</li>
	<li>작업 삽입 한 번에의 한 6 잘 플레이트. 셀 문화 후드 그리고 얼음에 차가운 방에 전송 매체에서 흡입 
	참고: 다음 지침은 1 삽입 격리에 대 한 것입니다.</li>
	<li>삽입의 SMC 측에 1 x PBS의 피펫으로 10 µ L.</li>
	<li>셀 삽입의 한쪽 끝을 아래로 밀고 셀 기중 장치를 사용 하 고 그것에 세포의 용 해 버퍼는 SMC 페 트리 접시에 기중에서 셀 전송</li>
	<li>일단 셀 기중 기는 접시에 세포의 용 해 버퍼만 진 되었습니다 때까지 그것은 완전히 닦아 종이 타 올에 건조 삽입 필터를 터치를 허용 하지 않습니다. 반복 하는 근 근이 SMC 필터의 적어도 1을 2 번 나머지 SMC 세포 파편을 완전히 제거 하.</li>
	<li>삽입 필터의 위/EC 쪽에 삽입 하 고 피펫으로 10 µ L 1 x PBS의 켜십시오. 셀 스 크레이 퍼와 EC 페 트리 접시 2.6 및 2.7 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>세포의 용 해 버퍼와 EC 페 트리 접시에 피 펫 및 전송 필터의 EC 측에서 나머지 셀 및 PBS 슬러리를 수집합니다. MEJ 분수에 두고 최소한의 EC/SMC 오염으로 필터의 양쪽 모두에서 세포를 근 근이 살아가고에 아주 철저 하 게.</li>
	<li>에서는 신중 하 게 메스를 사용 하 여 플라스틱 삽입에서 필터를 잘라. 플라스틱에서 그것의 절단 70-80%에 의해이 작업을 수행 하 고 집게 플라스틱 삽입 구조에서 완전히 필터를 사용 하 여. 세포의 용 해 버퍼, MEJ 표시 50 mL 원뿔 튜브에 필터를 넣고 세포의 용 해 버퍼에 앉아서 젖은 남아 보장.</li>
	<li>삽입의 모든 처리 될 때까지 6, 그룹의 격리 단계 반복.</li>
	<li>다른 치료 그룹 별도 튜브와 요리에 보관 됩니다 확인 하십시오.</li>
	<li>소용돌이 15 전체 강도에 50 mL MEJ 원뿔 튜브 s 또는 잘 혼합 때까지. 집게, 튜브에서 단백질 및 액체의 최대 금액을 떠나로 튜브의 측면 벽을 따라 끌어와 원뿔 MEJ에서 필터를 제거 합니다. 이 시점 후 필터 삭제.</li>
	<li>모든 필터 MEJ 원뿔 튜브에서 제거 되었습니다 일단 할 한 튜브의 하단에 모든 액체와 단백질을 뽑아 원심 분리기에 빠른 스핀 (최대 속도 ~ 16000 x g에서 10-15 s). 별도, 더 작은 원심 분리기 튜브로 MEJ 튜브와 EC 및 SMC 페 트리 접시의 내용을 전송.</li>
	<li>옵션: MEJ/SMC/EC 튜브의 내용을 Sonicate에 얼음에 4 세 10의 펄스에 대 한 설정 또는 손으로 부드럽게 균질.</li>
	<li>4 시 15 분 최대 속도 (~ 16000 x g)에서 원심 ° C. 피펫으로 상쾌한 고 시험의 bicinchoninic 분석 결과 메서드를 사용 하 여 단백질 함량에 대 한 lysate.</li>
</ol> 3. En 얼굴 면역 형광에 있는 VCCC 수확 <ol><li>에 하루 5의 VCCC 인큐베이션, 인큐베이터에서 삽입을 제거. 각 삽입 필터와 린스 1 x PBS와 두 번의 낮은 우물의 SMC 미디어에서 흡입 세포 문화 후드에서 working. EC 측을 가진 반복.</li>
	<li>부드러운 통에 있는 도보 4 ° C 룸에 10-20 분 동안 4 %paraformaldehyde (PFA) 추가 및 접시에 그대로 삽입을 유지. 5 분에 대 한 1 x PBS와 삽입 필터의 양쪽 모두를 세척 하 고 두 번 반복. 
	주의: PFA 독성 이며 신중 하 게 처리 해야 합니다.</li>
	<li>접시는 항 체에는 필터의 양쪽 모두를 유지 + 차단 솔루션 차단, 1 차 및 이차 항 체 외피를 수행 (9 mL PBS, 25 µ L 트리톤 X100, 50 mg 소 혈 청 알 부 민, 500 µ L 정상 혈 청)</li>
	<li>메스와 플라스틱 삽입에서 필터를 잘라 슬라이드에 필터를 탑재 하는 핸들에 장착 매체와 현미경 슬라이드에 탑재.</li>
</ol> 4. VCCC 가로 면역 형광 검사에 대 한 수확 <ol><li>에 하루 5의 VCCC 인큐베이션, 인큐베이터에서 삽입을 제거. 셀 문화 후드에 삽입 필터의 양쪽에서 미디어에서 흡입 하 고 두 번 1 x PBS와 필터의 각 측면을 린스.</li>
	<li>그대로 삽입 유지 6 잘 플레이트에 추가 4 %PFA 부드러운 통에 있는 도보 4 ° C 룸에서 밤새 품 어. 
	주의: PFA 독성 이며 신중 하 게 처리 해야 합니다.</li>
</ol> 5. VCCC 가로 면역 형광 검사에 대 한 포함 <ol><li>필터 후 삽입 약 4%에 24 h에 대 한 해결 되었습니다 PFA, 전송 70 %EtOH 적어도 24 시간, 하지만 몇 주까지.</li>
	<li>긴 자동된 조직 프로세서에서 실행 (하룻밤)에 필터를 처리 합니다. 다음과 같이 프로그램을 사용 하 여: 70% EtOH 30 분, 85% EtOH 30 분, 95% EtOH 30 분, 100% EtOH 30 분, 100% EtOH 45 분, 100% EtOH 45 분, 크 실 렌 30 분, 크 실 렌 30 분, 크 실 렌 45 분, 60 ° C 파라핀 30 분, 60 ° C 파라핀 30 분 60 ° C 파라핀 45 분</li>
	<li>액체 파라핀, 카세트에는 필터를 유지로 전송 수확된 필터 포함 역으로 처리 후.</li>
	<li>는 가장자리에 그냥 잡고 집게를 사용 하 여 신중 하 게 카세트에서 필터를 제거 합니다. 가 위, 반, 필터를 잘라 반쪽 모양의 두 세미 원형 형성. 그냥 오래 포함 채우기 위해 충분히 액체 파라핀과 금형 포함 역의 차가운 접시 부분에 2 반쪽의 각 위치.</li>
	<li>한번 액체 파라핀으로 가득 찬 격판덮개를 포함 형 터치 매우 간략하게 다음 필터의 각 반 형 (측면 줄이려고)를 포함에 포함; 그러면는, 단면 중 하나 절단 됩니다 가장자리 쪽으로 필터의 중심에서 .</li>
	<li>포함, 하는 동안를 사용 하 여 집게는 파라핀 혼자 서 서 그들을 위해 충분히 차갑게 될 때까지 서로 떨어지는 반쪽을 방지 하기 위해에서 필터를 잡아. 완전히 경화 될 때까지 차가운 접시 포함 형 이동. 
	참고: 얼음 쟁반에 블록을 냉각 주름된 섹션을 방지 하는 데 도움이 됩니다.</li>
</ol> 6. 단면화 및 가로 면역 형광 검사에 대 한는 VCCC 얼룩 <ol><li>파라핀 블록에 대 한 단면 및 장착 슬라이드: 5 µ m 섹션 잘라내기, 42 ° C 물 욕조에 섹션을 배치 및 충전 된를 사용 하 여 섹션을 선택 슬라이드입니다. 다음 슬라이드를 건조 42 ° C 오븐에 하룻밤 유지.</li>
	<li>재 단계를 시작 하기 전에 빵을 60 ° C에 파라핀을 녹기에서 슬라이드와 슬라이드에 VCCC 섹션을 준수 하는 데 도움이. 짧게, 냉각 후 크 실 렌, 100%의 두 가지 변화를 통해 슬라이드를 rehydrate EtOH, 95 %EtOH, 70%의 한 변화 EtOH, 2의 그리고 변화 증류수.</li>
	<li>Microwaving 또는 난방 섹션 수 있습니다 슬라이드에서가로 포함 하는 항 원 검색 방법을 방지.</li>
	<li>수행 세척 단계 및 이차 항 체 1 시간 실 온에서 다음 4 ° C에서 1 차적인 항 체를 가진 다음 하룻밤 외피, 실내 온도에 1 시간에 대 한 표준 차단. 설치 미디어와 coverslip 탑재.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Isakson, B. E., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterocellular+contact+at+the+myoendothelial+junction+influences+gap+junction+organization.">Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization.</a> Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).</li><li>Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+tracers+define+differential+endothelial+and+smooth+muscle+coupling+patterns+within+the+arteriolar+wall.">Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall.</a> Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).</li><li>Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+vascular+wall+in+vitro.+A+novel+model+to+study+interactions+between+endothelial+and+smooth+muscle+cells.">Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells.</a> Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).</li><li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier.">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).</li><li>Heberlein, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mRNA+binding+protein+complex+promotes+localized+plasminogen+activator+inhibitor-1+accumulation+at+the+myoendothelial+junction.">A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).</li><li>Straub, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+connexin+43+s-nitrosylation/denitrosylation+regulates+heterocellular+communication+in+the+vessel+wall.">Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).</li><li>Cucina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+increases+the+migration+and+proliferation+of+smooth+muscle+cells+through+the+mediation+of+growth+factors+released+by+endothelial+cells.">Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells.</a> J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).</li><li>Heberlein, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen+activator+inhibitor-1+regulates+myoendothelial+junction+formation.">Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation.</a> Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).</li><li>Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+protein+on+actin+bridges+between+endothelium+and+smooth+muscle+in+arterioles+demonstrates+heterogeneous+connexin+expression+and+phosphorylation.">Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).</li><li>Biwer, L. A., Isakson, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum-mediated+signalling+in+cellular+microdomains.">Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains.</a> Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).</li></ol>

저자는 공개 없다.

VCCC는 다양 한 MEJs에서 생체 외에서업과 측면에서 이점 하지만 토론의 경우는 VCCC 특정 응용 프로그램에 대 한 이용 될 수 있다 결정할 때. 예를 들어 다른 세포 유형이이 모델 사용할 수 있다면, 그것은 최적화가 필요 합니다. 우리는 기본 인간 세포 사용 하지만 소 aortas24또는 wildtype 또는 녹아웃 쥐에서 세포를 분리 하 여 사용 VCCC1,5<...

작은 직경 저항 동맥, 얇은 내부 탄력 있는 lamina (IEL) 내 피 (EC)와 평활 근 세포 (SMC)를 분리합니다. 셀이 탄성 매트릭스에 구멍을 통해 프로젝트 하 고 갭 정션 채널1,2를 통해 직접 세포질 연결을 만들 수 있습니다. 이 독특한 구조는 myoendothelial 접합 (MEJ) 이라고 불린다. MEJ 작은 (약 0.5 µ m 혈관 침대에 따라 0.5 µ m x), 셀룰러 투영 하지만 내 피 세포의 주로 구성3,4뿐만 아니라 부드러운 근육에서 발생 한 수 있습니다. 수 사관의 수 신호 그것은 피와 부드러운 근육5 사이의 양방향 신호 촉진을 위한 특히 중요 한 위치를 렌더링 MEJ에 선택적으로 발생 하는 네트워크의 엄청난 복잡성을 증명 하고있다 ,6,,78,,910.
그러나,는 MEJ에 신호 통로의 기계 해 부 그대로 동맥에서 어렵습니다. MEJ 셀룰러 프로젝션 때문에 그것 불가능 현재는 비보에 MEJ 혈관 벽에서 분리 합니다. 이러한 이유로 VCCC 모델1 개발 되었다. VCCC 생리 내 피 형태11 와 양극 화는 꼭대기 사이 신호를 복제 하는 중요 한 것은, 셀12MEJ 부분. 그것을 발견 알파 헤모글로빈에에서 있는 내 피 세포는 MEJ에 편광이 독특한 모델 이었습니다. 이것은 알파 헤모글로빈13를 표현 하지 않는 전통적으로 교양된 내 피 세포와 달리 이다. Microvascular 내 피에 관심이 연구원에 대 한 더 작은 직경 저항 동맥에서 발생 하는 신호 경로 해 부 하는 것입니다 의도 하는 경우에 특히 VCCC에서 경작 된 내 피 세포를 사용 하 여 적절 한 수 있습니다.
공동 문화 2 가지 종류를 튼튼한 플라스틱 삽입을 포함 하는 직경이 작은 숨 구멍 (직경에서 0.4 µ m)와 필터를 사용 하 여 계층 간의 마이그레이션에서 세포를 방지 합니다. 그것은 크게 비보, 보다 긴 하지만 여전히 많은 MEJs, 단백질 지 방화, 두 번째 메신저1 신호 등의 비보에 특성의 복제 세포 사이의 10 µ m 거리에서 결과 , 14. 또한는 VCCC 셀 주 작동 근 또는 특정 세포 구획에 적의 추가 통해 신호 유형 특정의 대상에 대 한 수. 예를 들어 BAPTA-킬레이트 칼슘, 오전으로 EC를 로드 하 고 phenylephrine14SMC를 자극. 이 제공 하는 공동 문화 모델15,,1617,18,19,20,21의 다른 설명, 달리 지침에 mRNA와 단백질, 필터 모 공 내의 별개 MEJ 분수를 포함 하 여 독특한 분수를 분리. VCCC에이 기술 추가 mRNA 현지화 또는 전사22,23, 단백질의 인 산화12,및 단백질 활동12변화의 특정 조사 수 있습니다. 이 기사 다른 conformations11,,1824두 세포 유형 문화 수도 있지만 아래에 필터와 SMC EC의 도금 설명 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24mm diameter, 0.4&#181;m Transwell Polyester membrane filter insert</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3450</td>
			<td>This is one 6 well plate of inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>225cm2 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates (without filter inserts)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human coronary artery endothelial cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human coronary artery smooth muscle cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 EC Basal media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC growth factors (EGM2 MV Single quots)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4147</td>
			<td>Add to basal media before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmBM SMC basal media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4149</td>
			<td>Add to basal media before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Trypsin-EDTA 10X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Dilute to 2X with sterile dPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15170-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>large petri dishes for SMC Plating (150mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-9382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>5&#181;g/ml of fibronectin and store at -20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Hanks&#39; Buffered salt solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14065-056</td>
			<td>Dilute to 1x with sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Dulbecco&#39;s Phosphate buffered saline (dPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td>Dilute to 1x with sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>MDS15210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17-467-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL conical tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mm petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35-1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>Make 4% solution with dPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>04-355-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cavicide disinfectant</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>131000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA protein lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic dismembranator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Model 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>does not need to be sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding/Sectioning/Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P31-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated tissue processer</td>
			<td>Excelsior</td>
			<td>ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding station + cold plate</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HistoCore Arcadia</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-961 or 25608-964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-230-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold mounting medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>**Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dPBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2&#181;m filter). 
			Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile HBSS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2&#181;m filter). 
			Final concentration: 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed 
			Final concentration: 100&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin to coat SMC side of VCCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100&#181;g/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5&#181;g/mL. 
			Final concentration: 5&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Trypsin EDTA solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . 
			Final concentration: 2X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking/antibody solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine gelatin to coat EC VCCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. 
			Final concentration: 0.50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS for harvesting cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>does not need to be sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model of resistance arteries

Myoendothelial 접합 (MEJ), 작은 직경 저항 동맥에 독특한 신호 microdomain 특정 단백질과 혈관 음색 및 혈압을 제어할 수 있는 신호 프로세스의 지역화를 전시 한다. 그것에서 프로젝션 내 피 또는 부드러운 근육 세포와 그것의 작은 때문에 MEJ (평균에, ~ 1 µ m2의 영역), 크기 격리에서 공부 하기 어렵습니다. 그러나, 우리는 MEJ 대형 생체 외에서 내 피 세포의 양극 화, 그리고 신호 단백질 및 프로세스의 저항 혈관 벽에의 해 부에 대 한 있도록 혈관 세포 공동 문화 (VCCC) 라는 세포 문화 모델 개발 동맥입니다. VCCC 다양 한 응용 프로그램 있으며 서로 다른 세포 유형에 맞게 적용할 수 있습니다. 0.4 µ m 모 공에는 생체 외에서 MEJs를 형성할 수 있습니다와 필터의 반대 측에 2 개의 세포 유형 모델에 의하여 이루어져 있다. 여기 우리가 설명 셀의 도금 및 절연의 내 피, 통해 VCCC 만드는 방법을 MEJ, 및 단백질 격리 또는 활동에 사용할 수 있습니다 부드러운 근육 분수 분석 실험. 포함 된, 그리고 immunofluorescent 분석 sectioned에 그대로 셀 레이어 필터를 해결할 수 있습니다. 중요 한 것은,이 모델에서 발견의 많은 생리 적인 관련성을 강조 하는 그대로 저항 동맥을 사용 하 여 확인 되었습니다.

필터 삽입 사용 VCCC는 있다 작은, 0.4 µ m 구멍. 그림 1A, VCCC 필터 삽입의 en 얼굴 보기는 MEJ 생체 외에서형성할 수 있다 숨 구멍을 보여줍니다. 회로도 1 일 내 피 세포는 반대 측 (그림 1B)에 도금 하기 전에 필터의 더 낮은 측에 도금 하는 평활 근 세포를 묘사 한다. 일단 세포는 도금 EC, MEJ, 및 SMC 분수 3 일 후에 격리 ?...

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A Cell Culture Model of Resistance Arteries

저항 동맥의 세포 문화 모델, 신호 경로 내 피, 평활 근, 또는 피와 부드러운 근육 (myoendothelial 교차점) 사이 해 부에 대 한 수 있도록 설명 되어 있습니다. 이 셀 문화 모델을 사용 하 여 면역 형광 검사, 전자 현미경, 또는 단백질 격리, 촉진제의 선택적 응용 프로그램을 활용할 수 있습니다.

저항 동맥의 세포 문화 모델

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

a-cell-culture-model-of-resistance-arteries

Research

JoVE Journal

Medicine

7.8K 조회수.  University of Virginia School of Medicine. 저항 동맥의 세포 문화 모델, 신호 경로 내 피, 평활 근, 또는 피와 부드러운 근육 (myoendothelial 교차점) 사이 해 부에 대 한 수 있도록 설명 되어 있습니다. 이 셀 문화 모델을 사용 하 여 면역 형광 검사, 전자 현미경, 또는 단백질 격리, 촉진제의 선택적 응용 프로그램을 활용할 수 있습니다.

비디오: A Cell Culture Model of Resistance Arteries

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

의 마우스 모델 Utero에 이식

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

연구

의학

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

세포 배양을위한 인간 감소 Mammoplasty과 유방 절제술의 조직의 처리

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ventilation. Up to now, the underlying mechanisms are not fully understood. The major vascular segment contributing to HPV is the intra-acinar artery. This vessel section is responsible for the blood supply of an individual acinus, which is defined as the portion of lung distal to a terminal bronchiole. Intra-acinar arteries are mostly located in that part of the lung that cannot be selectively reached by a number of commonly used techniques such as measurement of the pulmonary artery pressure in isolated perfused lungs or force recordings from dissected proximal pulmonary artery segments1,2. The analysis of subpleural vessels by real-time confocal laser scanning luminescence microscopy is limited to vessels with up to 50 &#181;m in diameter3.
We provide a technique to study HPV of murine intra-pulmonary arteries in the range of 20-100 &#181;m inner diameters. It is based on the videomorphometric analysis of cross-sectioned arteries in precision cut lung slices (PCLS). This method allows the quantitative measurement of vasoreactivity of small intra-acinar arteries with inner diameter between 20-40 &#181;m which are located at gussets of alveolar septa next to alveolar ducts and of larger pre-acinar arteries with inner diameters between 40-100 &#181;m which run adjacent to bronchi and bronchioles. In contrast to real-time imaging of subpleural vessels in anesthetized and ventilated mice, videomorphometric analysis of PCLS occurs under conditions free of shear stress. In our experimental model both arterial segments exhibit a monophasic HPV when exposed to medium gassed with 1% O2 and the response fades after 30-40 min at hypoxia.

Hypoxic pulmonary vasoconstriction (HPV) is an important physiological phenomenon by which at alveolar hypoxia lung perfusion is matched to ventilation. The major vascular segment contributing to HPV is the intra-acinar artery. Here, we describe our protocol for the analysis of HPV of murine pulmonary vessels with diameters of 20-100 &mu;m.

Murine 정밀 절단 폐 슬라이스를 사용하여 폐 내 동맥의 저산소 폐 혈관 수축의 비디오 형태 측정 분석

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

압력 Myography를 사용하여 저항 장간막 동맥에서 근육 조직 대응 및 Vasoactivity 평가

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Assessment of Perigenital Sensitivity and Prostatic Mast Cell Activation in a Mouse Model of Neonatal Maternal Separation

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the age of 50, yet it is the least understood and studied chronic pelvic pain disorder. A significant subset of patients with chronic pelvic pain report having experienced early life stress or abuse, which can markedly affect the functioning and regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis. Mast cell activation, which has been shown to be increased in both urine and expressed prostatic secretions of CP/CPPS patients, is partially regulated by downstream activation of the HPA axis. Neonatal maternal separation (NMS) has been used for over two decades to study the outcomes of early life stress in rodent models, including changes in the HPA axis and visceral sensitivity. Here we provide a detailed protocol for using NMS as a preclinical model of CP/CPPS in male C57BL/6 mice. We describe the methodology for performing NMS, assessing perigenital mechanical allodynia, and histological evidence of mast cell activation. We also provide evidence that early psychological stress can have long-lasting effects on the male urogenital system in mice.

We are measuring perigenital mechanical sensitivity and mast cell activation in the prostate of male C57BL/6 mice that underwent an early life stress paradigm &#8211; neonatal maternal separation, in order to induce a preclinical model of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome.

신생아 모자 분리의 마우스 모델에서 Perigenital 감도 및 전립선 비만 세포 활성화의 평가

Chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS) has a lifetime prevalence of 14% and is the most common urological diagnosis for men under the ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor invasion into surrounding brain parenchyma represents an enduring therapeutic challenge. To develop anti-migration therapies for GBM, model systems that provide a physiologically relevant background for controlled experimentation are essential. Here, we present a protocol for generating slice cultures from human GBM tissue obtained during surgical resection. These cultures allow for ex vivo experimentation without passaging through animal xenografts or single cell cultures. Further, we describe the use of time-lapse laser scanning confocal microscopy in conjunction with cell tracking to quantitatively study the migratory behavior of tumor cells and associated response to therapeutics. Slices are reproducibly generated within 90 min of surgical tissue acquisition. Retrovirally-mediated fluorescent cell labeling, confocal imaging, and tumor cell migration analyses are subsequently completed within two weeks of culture. We have successfully used these slice cultures to uncover genetic factors associated with increased migratory behavior in human GBM. Further, we have validated the model&#39;s ability to detect patient-specific variation in response to anti-migration therapies. Moving forward, human GBM slice cultures are an attractive platform for rapid ex vivo assessment of tumor sensitivity to therapeutic agents, in order to advance personalized neuro-oncologic therapy.

Current ex vivo models of glioblastoma (GBM) are not optimized for physiologically relevant study of human tumor invasion. Here, we present a protocol for generation and maintenance of organotypic slice cultures from fresh human GBM tissue. A description of time-lapse microscopy and quantitative cell migration analysis techniques is provided.

종양 세포 이동 연구를위한 인간 Glioblastoma Organotypic Slice 문화 모델 및 항 침윤성 약물의 환자 특이 적 효과

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

개 동맥과 정맥에서 차 내피 세포의 분리 및 문화

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

쥐의 고립 된 저항 동맥의 비디오 현미경을 이용 하 여 혈관 제어 메커니즘의 평가

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Muscle Imbalances: Testing and Training Functional Eccentric Hamstring Strength in Athletic Populations

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite of these eccentric hamstring actions are concentric quadriceps actions, where the larger and likely stronger quadriceps straighten the knee. Therefore, to stabilize the lower limbs during movement, the hamstrings must eccentrically combat against the strong knee-straightening torque of the quadriceps. As such, eccentric hamstring strength expressed relative to concentric quadricep strength is commonly referred to as the &#34;functional ratio&#34; as most movements in sports require simultaneous concentric knee extension and eccentric knee flexion. To increase the strength, resiliency, and functional performance of the hamstrings, it is necessary to test and train the hamstrings at different eccentric speeds. The main purpose of this work is to provide instructions for measuring and interpreting eccentric hamstring strength. Techniques for measuring the functional ratio using isokinetic dynamometry are provided and sample data will be compared. Additionally, we briefly describe how to address hamstring strength deficiencies or unilateral strength differences using exercises that specifically focus on increasing eccentric hamstring strength.

The hamstrings are a group of muscles that are sometimes problematic for athletes, resulting in soft tissue injury in the lower limbs. To prevent such injuries, functional training of the hamstrings requires intensive eccentric contractions. Additionally, hamstring function should be tested in relation to quadricep function at different contraction speeds.

근육의 불균형: 테스트 및 기능 편심 햄 스트링 운동 인구 강도 훈련

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite ...