R.B.는 Searle 학자 프로그램, 트 면 스미스 재단 (C1404), 그리고 천 재단 (1-년도-15-344)의 3 월에 의해 지원 되었다. B.A.G는 NIH에서 지원 R01GM110174 및 NIH R01AI118891 국방부 뿐만 아니라 BC123187P1를 부여 부여 인정 합니다. R.W.-T. NIH 훈련 그랜트 T32GM008216에 의해 지원 되었다.

1. 문화 및 mESCs의 확장 참고: 마우스 배아 줄기 세포 문화에 쉽게 하 고 그들의 빠른 사이클 시간 덕분에 생 화 확 적인 실험에 필요한 큰 숫자를 신속 하 게 확장 될 수 있다. 건강 한 mESCs 더블 모든 12 헤
<li>MESC gelatinized 번호판에 원하는 번호를 확장 mESCs <ol>매체 (아래 참조) 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° c, 5% CO 2, 보관 및 &#62; 95% 습도. 
	참고: 3-5에 대 한 생물 학적 복제에 대 한 준비 한다 충분 한 격판덮개는 + 4SU 샘플-4SU 컨트롤. 한 10 cm 플레이트 (즉, 5-10 백만 셀)는 각 생물 복제에 게 충분 한 것 보다 더.</li>
	<li>MESCs에 대 한 매체 Dulbecco의 구성 &#39; s 수정이 글 &#39; s 매체 (DMEM) 보충 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), L-글루타민, 2mm 페니실린/스, 1 x 비 본질적인 아미노산, 100 µ M 베타-mercaptoethanol, 1000 U x 0.5 /mL 백혈병 금지 요인 (LIF), 3 µ M CHIR99021, 1 µ M PD0325901.</li>
	<li>뿌리고 mESCs, 전에 준비 10 cm 번호판의 원하는 수.
	<ol><li>확인 접시의 전체 표면을 커버 하 고 물에 0.1% 젤라틴의 4 개 mL를 추가, 실 온 (RT)에서 10 분 동안 품 어, 젤라틴 솔루션 제거.</li>
	</ol></li> <li>통행 셀에 도달할 때 접시, 당 ~ 10 백만 셀 일반적으로 다음 접종 ~ 48 h. 
	참고: mESCs 조밀한 식민지에서 성장, 접시 결코 허용 되어야 한다 monolayers (예: HEK293 또는 3T3 세포)에서 성장 하는 세포 라인에 대 한 관찰로 100 %confluency 도달. ~ 50 %confluent 매체 전에 확실히 노란색 때 mESC 접시를 passaged 해야 합니다.
	<ol>셀을 분리 하려면 <li>1 x 2 mM EDTA, 보충 버퍼링 인산 염 (PBS)에 한 번 밀도 mESC 문화 접시를 씻어 다음 0.05% trypsin DMEM에 녹아 추가 하 고 5 분 동안 인큐베이터에 접시를 반환 (37 ° C, 5% CO 2, 그리고 &#62; 95% 습도).</li>
		<li>인큐베이터에서 플레이트를 제거 하 고 적극적으로 여러 번 위아래로 pipetting으로 DMEM의 동등한 양으로 셀 resuspend.</li>
		<li>Hemocytometer를 사용 하 여 셀 및 셀 단일 세포 현 탁 액을 형성 있도록 (즉, 없음 클러스터), 다음 실 온에서 5 분에 대 한 셀 혼합 500 x g 원심. 상쾌한을 제거 하 고 1-2 ml DMEM 셀 펠 릿 resuspend.</li>
		<li>MESC 매체 (즉 800000 ~ 10 cm 접시 당 세포)에 10, 000 셀/c m 2의 조밀도에 세포를 접종 준비 단계 1.3.1에서에서 젤라틴 코팅 접시를 사용 하 여.</li>
	</ol></li></ol> 2. 단백질 Crosslink &#8211; 라이브 세포 상호 작용 RNA 참고: RNA-단백질 가교는 사진-활성화 ribonucleoside 아날로그 4-thiouridine (4SU)에 의해 중재입니다. 4SU는 내 생 보다 더 흡수도 최대 뉴클레오티드 RNA;로 통합 될 수 있다 고 따라서 중간 파장 UVB는 선택적으로 crosslink RNA 단백질 25 , 26를 사용할 수 있습니다. 4SU 치료 세포의 UVB 치료 리드 화학식 crosslinks에 4SU 포함 된 RNA 및 Tyr에 대 한 보고 선호와 아미노산 사이 Trp, 메트로, 리스, 그리고 Cys 27.
<li>1 단계에 설명 된 필요한 개수의 10 cm 번호판 확장 mESCs <ol>. 
	참고: 3-5에 대 한 생물 학적 복제에 대 한 준비 한다 충분 한 격판덮개는 + 4SU 샘플-4SU 컨트롤. 한 10 cm 플레이트 (즉, 5-10 백만 셀)은 각 생물 복제에 대 한 충분 한.</li>
	<li>판 confluency, 도달 하기 전에 추가 4SU 매체에 직접 500의 최종 농도에 µ M. 남겨 주세요-4SU 제어 요리 치료.</li>
	<li>균질 매체에 걸쳐 4SU 배포를 부드럽게 흔들어 접시. 2 시간에 대 한 동일한 조직 문화 인큐베이터에 그들을 반환 (37 ° C, 5% CO 2, 그리고 &#62; 95% 습도).</li>
	<li>접시 얼음 양동이 전송과 매체 삭제.</li>
	<li>씻어 얼음 처럼 차가운 PBS의 5 mL와 함께 부드럽게 접시. 
	참고: 부드럽게 린스 또는 셀 분리 수 있습니다.</li>
	<li>UVB 방출 전구 장착 crosslinker에 뚜껑 없이 얼음 처럼 차가운 PBS와 장소 격판덮개의 2 개 mL를 추가 (312 nm). 1 J/c m 2의 에너지 설정에서 번호판을 비추는. 
	참고: 그것은 플라스틱 뚜껑 제거 하거나 자외선 으로부터 세포를 보호 하 고 가교를 방지 수 중요.</li>
	<li>셀 옮기는 사용 하 여 셀을 수집 하 고 전송 원뿔 관에 얼음 처럼 차가운 PBS. 5 분, 4 ° c.에 대 한 2000 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>는 상쾌한을 제거 하 고 5 mL 2 mM EDTA와 0.2 m m phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF)와 얼음 처럼 차가운 PBS에 셀 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>수 세포는 hemocytometer를 사용 하 여입니다. 10 cm와 15 cm에서에서 5-10 및 10-20 백만 셀을 각각 기대.</li>
	<li>분리기 2000 x g에서 5 분, 4 ° c. 
	참고: 수송과 세포 수 있습니다 즉시 사용 3 단계 또는 플래시-액체 질소에서 냉동 하 고 무기한-80 ° C에서 저장 수 있습니다. 이것은 잠재적인 정지점.</li>
</ol> 3. 핵의 절연 참고: 핵 세포질 단백질을 제거 하 고 핵 단백질의 범위를 증가에 격리 됩니다. 이 단계는 다른 세포질 격실에서 RBPs 공부 세포 분별 법의 다른 형태와 대체 될 수 있다.
<ol><li>준비 얼음 감기 (10 mM Tris HCl pH 7.9, 4 ° C, 1.5 m m MgCl 2, 10mm KCl) 버퍼. 10 백만 셀 (으로 단계 2.9에서에서 계산) 당 적어도 2.5 mL를 사용 하 여 추출. 
	참고: 버퍼 A의 주식 (예를 들면: 500 mL 병) 미리 준비 고 6 개월 동안 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
	<li>사용 전에 0.5 m m dithiothreitol (DTT)와 0.2 밀리미터 PMSF 차가운 버퍼 A. 원하는 금액 (2.5 mL 당 10 백만 셀)을 추가</li> 하는 <ol>
	</ol></li> <li>10 백만 셀 당 2 mL 버퍼 A 사용 하 여 셀을 씻어. 4 ° c.에서 5 분 동안 2500 x g에서 회전</li>
	<li>삭제 상쾌한 추가 버퍼 A octyl-phenoxy-polyethoxy-에탄올 등 비, 비 변성 시키기 세제의 0.2%와 보충 (재료의 표 참조), 500 µ L 당 10 백만 셀. 4 ° c.에서 5 분 동안 회전</li>
	<li>5 분에 대 한 2500 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>제거는 상쾌한, 세포질 없는 그대로 핵을 구성 하는 펠 릿. 
	참고: 핵 단계 4 또는 플래시-냉동 액체 질소에 대 한 즉시 사용 고 무기한-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 이것은 잠재적인 정지점.</li>
</ol> 4. 핵의 세포 참고: 가교 된 핵은 단백질 및 단백질 RNA 복합물을 질량 분석 호환 버퍼에서 lysed.
10 백만 셀 당 200 µ L <ol><li>추가 세포의 용 해 버퍼 (9 M 요소, 100 mM Tris HCl pH 8.0, 24 ° C). Chromatin는 1/8를 사용 하 여 기울이려면 sonicate &#34; 5-10 미에 대 한 50% 진폭 설정에서 프로브</li>
	<li>스핀 5 분 g x 12, 000와 수집 175 µ L의 펠 릿을 피하기 위해 상쾌한. 
	참고: 다음 RBR ID 단계 사용 됩니다 100 µ L 고 lysate의 나머지 75 µ L 나중에 사용 및 서쪽 오 점 분석-80 ° C에 저장 될 수 있다.</li>
	<li>측정 단백질 농도 Bradford 분석 실험 또는 유사한 기술 28을 통해. 다른 샘플을 1 mg/mL에서 단백질 농도 또는 세포의 용 해 버퍼의 적절 한 금액을 사용 하 여 낮은 샘플 농도 희석. 
	참고: 10 백만 mESCs의 핵에서 단백질의 100-200 µ g 기대.</li>
</ol> 5. 트립 신 소화 참고: 단백질 펩 티 드 s 생성 하 소화는하단-최대 질량 분석 (MS) 분석에 대 한의 uitable.
<ol><li>실시간에서 1 시간에 대 한 품 어 핵 lysate (5 m m 마지막); DTT 추가 솔루션</li>
	<li>신선한 주식 (최종 14 m m)에서 iodoacetamide를 추가, 어둠 속에서 RT에서 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>50mm NH 4 HCO 3의 5 번 볼륨 lysate Dilute</li>
	<li>트립 신 추가 (µ g 단백질: µ g 트립 신 = 200: 1). 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
</ol> 6. 펩 티 드의 담 <ol><li>샘플 당 하나의 맞춤 단계 팁 준비.
	<ol><li>6.1.1. 고체 상 추출 C18 물자의 디스크 200 µ L 피 펫 팁의 하단에 배치.</li>
		<li>추가 50 µ L 올리고 R3의 C18 디스크 위에 수 지 위상 반전. 원심 분리 어댑터 내부 단계 팁과 1.5 mL microfuge 관 내부 어댑터와 장소 팁.</li>
		<li>씻어 팁 추가 100 µ L 100% 이기. 용 매를 제거 하는 1 분에 1000 x g에서 원심 분리기.</li>
		<li>평형 50 µ L 0.1 %trifluoroacetic 산 (TFA). 1 분에 1000 x g에서 원심 분리기</li>
	</ol></li> <li>소화 단백질 샘플 2-3 pH 감소를 100% 포 름 산 추가. 
	참고:이 샘플 희석된 펩 티 드의 1 mL 당 ~ 5 µ L를 필요로 한다 하지만 pH 측정 하 고 더 개미의 산 추가 해야 합니다. 필요한 경우.</li>
	<li>맞춤 단계 팁, 샘플의 모든 때까지 1 분에 1000 x g에서 원심 분리기에 부하 샘플 팁을 통해 간다.</li>
	<li>세척 바인딩된 펩 티 드 50 µ L 0.1 %TFA. 1 분에 1000 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>50 µ L 차입 버퍼를 추가 하 여 펩 티 드를 elute (75% 이기, 0.025 %TFA) 단계 팁을 팁에서 차입 버퍼를 1 분 동안 1000 x g에서 원심 분리기.</li>
	<li>건조 150g x 1 헤에 대 한 인민군 제 1-3에서 설정 진공 원심 분리기를 사용 하 여 샘플 
	참고: 말린된 펩 티 드 저장할 수 있습니다-80 ° C에 무기한. 이것은 잠재적인 정지점.</li>
</ol> 7. 가교 된 RNA의 제거 참고: 가교 된 RNA를 제거 하는 nuclease와 펩 티 드를 치료.
<ol><li>Nuclease 버퍼 (100mm NH 4 HCO 3, 4 m m MgCl 2) x 50 µ L 2에서에서 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>측정 펩 티 드 농도 280에서 흡 광도 사용 하 여 가정 1 mg/mL 1의 A 280에 대 한 펩 티 드의 nm. 
	참고: 예상된 농도 1 mg/mL.</li>
	<li>모든 샘플 1 mg/mL 또는 nuclease 버퍼 x 2를 사용 하 여 최저 농도 조정.</li>
	<li>50 µ L H 2 O + 1 µ L 고 순도 nuclease 마스터 믹스를 준비 (&#8805; 250 U) (테이블의 자료를 참조) 샘플 당.</li>
	<li>펩 티 드 샘플의 50 µ L 고 추가 50 µ L H 2 O + nuclease 믹스 마스터.</li>
	<li>품 1 h. 질량 분석을 수행 하는 진행에 대 한 37 ° C에서. 
	참고:는 펩 티 드 질량 분석에 대 한 준비가 이제 있습니다. 그들은 즉시 분석 하거나 무기한-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 이것은 잠재적인 정지점.</li>
</ol> 8. 나노 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 원시 데이터 처리 참고: 4SU 가교는 펩 티 드의 질량 때문에, 그들의 이온 합산 되지 않습니다 비 가교 된 펩타이드의 농도 LC-MS/MS, 중 따라서는 가교에 의해 감소 될 것으로 보인다. 24 각 펩 티 드 단백질-RNA 가교의 정도 반영 하는 정도와이 감소의 일관성.
<ol><li>준비 HPLC 다음과 같이 버퍼: HPLC 급 물 (버퍼 A) 0.1% 포 름 산, HPLC 급 이기 (버퍼 B)에서 0.1% 개미 산.</li>
	<li>나노 HPLC를 사용할 수 있으면 다음 사양 나노 열 연결: 내부 직경 75 µ m; C18-AQ 입자; 포장 길이 20-25 cm. 
	참고: 사용할 수 있는 HPLC 높은 흐름 속도에서 실행 되는 경우 지정 된 유량에 대 한 적절 한 열 크기를 사용 합니다. 높은 흐름 크로마토그래피 감도 감소.</li>
	<li>프로그램 HPLC 방법은 다음과 같습니다: 흐름 속도 250-300 nL/분; 28 다음 5 분 동안 80 %B isocratic 80% B 10 분에서에서 120 분에 28% 버퍼 B에 2에서 그라데이션 
	참고:는 HPLC 자동된 열 평형 사전 샘플 로드 되어 있지 않으면, 시작 프로그램 0% B 10 분 샘플을 로드 하기 전에.</li>
	<li>MS 인수 메서드를 표준 샷건 proteomics 실험으로 데이터 종속 수집 (DDA) 프로그램. 악기 듀티 사이클 탠덤 MS 스캔 (또는 MS/MS)의 가장 강렬한 신호 전체 MS 검사 대체 한다. Proteomics MS 실행에 대 한 최적의 설정을 사용 하 여. 
	참고: 자신감의 결과 대 한 높은 해상도 모드 (예: orbitrap, 비행 시간)에 스캔 전체 MS 이상 수행할 수 있는 사용 악기. 정확한 정량화에 대 한 있는지 확인 전체 MS 검사 간의 간격으로 더 이상 보다 3 s. 더 듀티 사이클 추출된 이온 chromatograms의 정확한 정의 되지 않을 수 없습니다.</li>
	<li>는 HPLC 열에 샘플의 1-2 µ g를 로드 하 고 프로그래밍 HPLC-MS/MS 메서드를 실행 합니다. 각 생물 복제에 대 한 적어도 2 개의 독립적인 실행을 수행 하 고 그들을 치료 기술 복제.</li>
	<li>후 MS, MS/MS 스펙트럼 식별 및 추출 된 이온 크로마토그래피를 통해 펩 티 드 정량화에 대 한 proteomics 소프트웨어 패키지에 원시 파일을 가져올. 좋습니다 여러 컬럼에 맞춤 수행할 수 있는 소프트웨어 패키지 MS 실행 (참조 테이블의 재료) 29 , 30.</li>
	<li>옵션 소프트웨어 제품군에서 사용할 수 있는 경우에, 가능 하 게 &#34; 사이의 일치를 실행 &#34; 데이터 처리를 시작 하기 전에.</li>
	<li>분석 완료 되 면 수출 부 량 값과 함께 펩 티 드 목록.</li>
</ol>

<ol>
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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SONAR+Discovers+RNA-Binding+Proteins+from+Analysis+of+Large-Scale+Protein-Protein+Interactomes.">SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes.</a> Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).</li><li>Bonasio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+with+RNA+direct+the+Polycomb+group+protein+SCML2+to+chromatin+where+it+represses+target+genes.">Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes.</a> Elife. 3, e02637 (2014).</li><li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+JARID2+and+noncoding+RNAs+regulate+PRC2+recruitment+to+chromatin.">Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin.</a> Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).</li><li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+the+PRC2+component+Ezh2+is+cell+cycle-regulated+and+up-regulates+its+binding+to+ncRNA.">Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA.</a> Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).</li><li>Saldana-Meyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+regulates+the+human+p53+gene+through+direct+interaction+with+its+natural+antisense+transcript,+Wrap53.">CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53.</a> Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Identification+of+RNA-Binding+Domains+in+Human+Cells.">Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells.</a> Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li><li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Mapping+of+RNA-Binding+Regions+in+the+Nuclear+Proteome+of+Embryonic+Stem+Cells.">High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).</li><li>Favre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Thiouridine+photosensitized+RNA-protein+crosslinking+in+mammalian+cells.">4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP.">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li><li>Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thionucleobases+as+intrinsic+photoaffinity+probes+of+nucleic+acid+structure+and+nucleic+acid-protein+interactions.">Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions.</a> J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+U1+snRNP,+a+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle,+reveals+the+mechanism+of+5'+splice+site+recognition.">Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li></ol>

저자는 공개 없다.

자세한 실험 프로토콜 RBR-ID를 mESCs로 하 고, RNA 4SU를 통합할 수 있는 모든 셀에 적절 한 수정 수행을 설명 합니다. 다른 세포 유형 충분 한 신호 대 잡음 비를 되도록 접근 방법의 최적화가 필요할 수 있습니다. 또한, 프로토콜 설명 여기 핵 RBPs 시험에 초점을 맞추고, 하는 동안 RBR-ID 기술 한다 쉽게 적용할 cytosol 또는 특정 세포와 같은 다른 세포질 구획 다른 분류를 사용 하 여 전략입니다. 최적화 ?...

RBR ID 방법의 목적은 새로운 RNA 의무적인 단백질 (RBPs)를 식별 하 여 펩 티 드 수준 해상도 RNA 바인딩 돌연변이의 디자인 및 생물학 및 생 화 확 적인 조사를 촉진 하기 위하여 그들의 RNA 바인딩 영역 (RBRs) 지도 단백질 RNA 상호 작용의 기능입니다.
RNA는 생체 중 고유 수 모두 유전 정보를 운반 하는 메신저 역할을 하 고도 생화학 기능 단백질1,2의 유사 더 많은 복잡 한 3 차원 구조에 접어. 증거의 성장 시체 noncoding RNAs (ncRNAs) 다양 한 유전자 규정 하는 후 성적인 경로3,,45 에 중요 한 역할을, 일반적으로, 이러한 규정 하는 기능 콘서트 중재는 제안 특히 주어진된 RNA와 상호 작용 하는 단백질 특정 한 관련성의 상호 작용 단백질의 집합 최근 심각 하 게 공부 긴 ncRNA (lncRNA) Xist,이 lncRNA 여성 셀6,7 x 염색체 비활성화를 중재 하는 방법에 대 한 값진 통찰력을 제공에 대 한 확인 되었다 ,8. 특히, 이러한 Xist 상호 작용 단백질의 몇 없는 어떤 정식 RNA 바인딩 도메인9, 그리고 그러므로 그들의 RNA 바인딩 작업 수 없습니다 예측 철에서 혼자 그들의 기본 시퀀스에 따라. LncRNAs의 수천 어떤 주어진된 셀10표현 됩니다 고려, 아직 될 RNA 의무적인 단백질 (RBPs) 발견 그들 중 많은와 상호 작용을 통해 행동 수도 있습니다 가정 하는 합리적입니다. 이러한 소설 RBPs 식별 하는 실험적인 전략 것입니다 따라서 크게 용이 하 게 ncRNAs의 생물 학적 기능 해 부의 작업.
RBPs 경험적으로 식별 하는 이전 시도 polyA + RNA 선택 질량 분석 (MS)11,12,13,,1415에 결합에 의존 했습니다. 비록이 실험 상 상속 RBPs의 목록에 많은 단백질을 추가, 디자인에 의해 그들은 감지할 수 단백질 polyadenylated 성적표에 바인딩된. 그러나, 대부분의 작은 RNAs 및 많은 lncRNAs polyadenylated 되지 않습니다. 16 , 17 그리고 그들의 상호 작용 단백질 것 가능성이 되었습니다 놓친이 실험에서. 최근 연구 공동 여러 알려진된 RBPs와 정화 하 고 이러한 재발 RBP 파트너 RNA 바인딩 활동18보유 가능성이 것으로 나타났다 단백질을 식별 하기 위해 단백질-단백질 위하여 데이터베이스에 기계 학습을 적용. 그러나,이 방법은 기존의 큰 상호 작용 데이터베이스 마이닝에 의존 하며만 공동 알려진된 RBPs, 따라서 불용 성, 막 임베디드 및 부족 한 분석에서 제외 된 비 변성 시키기 조건에 순화 될 수 있는 단백질을 확인할 수 있습니다. 단백질입니다.
Id는 단백질의 한 진실 fide RBP로 종종 단백질 RNA 상호 작용의 생물학 및 생 화 확 적인 기능에 대 한 정보를 자동으로 생성 하지 않습니다. 해결 하기 위해이 시점, 그것은 일반적으로 특정 돌연변이 각 소설 RBP19, 의 맥락에서 RNA 바인딩 기능을 테스트 하도록 설계 된 수 수 있도록 단백질 도메인 및 아미노산 잔류물 상호 작용에 관련 된 식별 하는 것이 좋습니다. 20. 우리의 그룹 및 다른 사람에 의해 이전 노력 사용 재조합 형 단백질 파편 삭제 돌연변이 RNA 바인딩 영역 (RBRs)19,20,,2122;을 식별 하 그러나, 이러한 접근은 노동 집약 및 높은 처리량 분석와 호환 되지 않는. 더 많은 최근 연구 질량 분석23;를 사용 하 여 높은 처리량 패션에서 RNA 바인딩 활동을 지도 하는 실험적인 전략 설명 그러나,이 방법은 이중 polyA + RNA 선택에 의존 하 고 따라서 위에서 설명한 RBP 식별 방식으로 동일한 제한 실시.
우리 나 RNA 바인딩 영역 id RBR-, photocrosslinking 단백질-RNA와 단백질 및 단백질 영역 만들기 없이 라이브 세포에서 RNA 상호 작용을 식별 하기 위해 양적 질량 분석을 이용 하는 기술 개발 RNA polyadenylation 상태에 가정, polyA RNAs24에 바인딩된 따라서 RBPs를 포함 한. 또한,이 방법은 가교를 독점적으로 의존 단백질 가용성 또는 액세스 가능성 요구 사항은 없습니다 고 따라서 내 막 (예: 핵 봉투) 또는 가난 하 게 녹는 구획 (RNA 바인딩 활동 지도에 적합 예를 들어 핵 매트릭스)입니다. 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)의 핵에 대 한 RBR-ID를 수행 하는 실험 단계 설명 하지만 사소한 수정이 프로토콜 적합 해야한다 다양 한 세포 유형, 그들은 효율적으로 문화에서 4SU를 통합할 수 있는 중간입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, qualified, US origin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution 200 mM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PZ0162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution,2% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-thiouridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4509</td>
			<td>50 mM stock in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrolinker XL-1500</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-992-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>78830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CO-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>542334</td>
			<td>Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, sequencing grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk</td>
			<td>3M</td>
			<td>66883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLIGO R3 Reversed - Phase Resin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1133903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8263</td>
			<td>High purity nuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>updated with FB505110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReproSil-Pur 18-AQ</td>
			<td>Dr. Maisch GmbH HPLC</td>
			<td>r13.aq.0003</td>
			<td>Packing material for HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary for nano columns (75 &#181;m)</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068150017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant software</td>
			<td>Max Planck Institute for Biochemistry</td>
			<td></td>
			<td>Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for mass spectrometry-based identification of rna-binding regions

Noncoding RNAs 유전자 발현, chromatin 구조, 및 DNA 복구 통제 등 여러 가지 핵 프로세스에서 중요 한 역할을 재생 합니다. 대부분의 경우에서 noncoding RNAs의 행동은 누구의 기능 차례로 noncoding RNAs와의 이러한 상호 작용에 의해 통제 된다 단백질에 의해 중재 됩니다. 이 일치, 핵 기능에 관련 된 단백질의 증가 RNA를 바인딩할 보고 되었습니다 그리고 몇 가지 경우에이 단백질의 RNA 바인딩 영역 매핑 되었습니다, 자주 힘 드는, 후보 기반 방법을 통해.
여기, 우리는 RNA 의무적인 단백질 및 RNA 바인딩 영역 그들의 높은 처리량, 프로테옴 전체 편견된 식별을 수행 하기 위해 상세한 프로토콜을 보고 합니다. 방법론 photoreactive uridine 아날로그 세포질 RNA, UV 중재 단백질-RNA 가교 및 질량 분석 분석 공개는 프로테옴 내 RNA-가교 된 펩 티 드에서에서의 설립에 의존 합니다. 마우스 배아 줄기 세포에 대 한 절차를 설명 하 고, 비록 배양된 세포의 다양 한 프로토콜을 쉽게 적응 한다.

그림 1 RBR ID 워크플로를 보여 줍니다. 때문에이 기술은 상대적으로 낮은 가교 효율 생물 복제 걸쳐 고갈 수준 및 관찰 된 효과 (P-값)의 일관성을 고려 하는 매우 중요 하다. 그림 2 는 RBR ID 결과의 화산 줄거리. 펩 티 드 RNA 승인 주제 (RRM) 도메인을 겹쳐 높게 일관 된 고갈 수준 표시. RRM 도메인 RBR ID 분석에 대 한 긍정적인 ?...

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Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

우리는 RNA 의무적인 단백질을 확인 하 고 중재 하는 UV photocrosslinking 및 질량 분석을 사용 하 여 라이브 셀에서 그들의 RNA 바인딩 영역 지도를 프로토콜을 설명 합니다.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

sample-preparation-for-mass-spectrometry-based-identification-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.0K 조회수.  University of Pennsylvania Perelman School of Medicine. 우리는 RNA 의무적인 단백질을 확인 하 고 중재 하는 UV photocrosslinking 및 질량 분석을 사용 하 여 라이브 셀에서 그들의 RNA 바인딩 영역 지도를 프로토콜을 설명 합니다.

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A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the abundances of key metabolites to which regulatory factors respond, adjusting cellular metabolism. In recent years, a number of proteins and RNA have emerged as important regulators of virulence gene expression. For example, the CodY protein responds to levels of branched-chain amino acids and GTP and is widely conserved in low G+C Gram-positive bacteria. As a global regulator in Staphylococcus aureus, CodY controls the expression of dozens of virulence and metabolic genes. We hypothesize that S. aureus uses CodY, in part, to alter its metabolic state in an effort to adapt to nutrient-limiting conditions potentially encountered in the host environment. This manuscript describes a method for extracting and analyzing metabolites from S. aureus using liquid chromatography coupled with mass spectrometry, a protocol that was developed to test this hypothesis. The method also highlights best practices that will ensure rigor and reproducibility, such as maintaining biological steady state and constant aeration without the use of continuous chemostat cultures. Relative to the USA200 methicillin-susceptible S. aureus isolate UAMS-1 parental strain, the isogenic codY mutant exhibited significant increases in amino acids derived from aspartate (e.g., threonine and isoleucine) and decreases in their precursors (e.g., aspartate and O-acetylhomoserine). These findings correlate well with transcriptional data obtained with RNA-seq analysis: genes in these pathways were up-regulated between 10- and 800-fold in the codY null mutant. Coupling global analyses of the transcriptome and the metabolome can reveal how bacteria alter their metabolism when faced with environmental or nutritional stress, providing potential insight into the physiological changes associated with nutrient depletion experienced during infection. Such discoveries may pave the way for the development of novel anti-infectives and therapeutics.

Here we describe a protocol for the extraction of metabolites from Staphylococcus aureus and their subsequent analysis via liquid chromatography and mass spectrometry.

의 대사 산물 분석을위한 탠덤 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 기반 접근<em&gt; 포도상 구균</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

연구

생화학

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences in a structurally similar protein, in order to determine the functional importance of these regions. Such chimeras are generated by means of a nested PCR protocol using overlapping DNA fragments and adequately designed primers, followed by their expression within a mammalian system to ensure native secondary structure and post-translational modifications. 
The functional role of a distinct region is then indicated by a loss of activity of the chimera in an appropriate readout assay. In consequence, regions harboring a set of critical amino acids are identified, which can be further screened by complementary techniques (e.g. site-directed mutagenesis) to increase molecular resolution. Although limited to cases in which a structurally related protein with differing functions can be found, chimeric proteins have been successfully employed to identify critical binding regions in proteins such as cytokines and cytokine receptors. This method is particularly suitable in cases in which the protein's functional regions are not well defined, and constitutes a valuable first step in directed evolution approaches to narrow down the regions of interest and reduce the screening effort involved.

Structurally related proteins frequently exert distinct biological functions. The exchange of equivalent regions of these proteins in order to create chimeric proteins constitutes an innovative approach to identify critical protein regions that are responsible for their functional divergence.

공상 단백질 구축을 통한 기능성 단백질 영역 식별

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) in eukaryotic cells. Precise identification of nitration sites on proteins is crucial for understanding the physiological and pathological processes related to protein nitration, such as inflammation, aging, and cancer. Since the nitrated proteins are of low abundance in cells even under induced conditions, no universal and efficient methods have been developed for the profiling and identification of protein nitration sites. Here we describe a protocol for nitropeptide enrichment by using a chemical reduction reaction and biotin labeling, followed by high resolution mass spectrometry. In our method, nitropeptide derivatives can be identified with high accuracy. Our method exhibits two advantages compared to the previously reported methods. First, dimethyl labeling is used to block the primary amine on nitropeptides, which can be used to generate quantitative results. Second, a disulfide bond containing NHS-biotin reagent is used for the enrichment, which can be further reduced and alkylated to enhance the detection signal on a mass spectrometer. This protocol has been successfully applied to the model peptide Angiotensin II in the current paper.

Proteomic profiling of tyrosine-nitrated proteins has been a challenging technique due to the low abundance of the 3-nitrotyrosine modification. Here we describe a novel approach for nitropeptide enrichment and profiling by using Angiotensin II as the model. This method can be extended for other in vitro or in vivo systems.

안지오텐신 II에 의해 설명 니트로 펩티드 프로파일링 및 식별

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves numerous incubation and liquid transfer steps in order to achieve denaturation, reduction, alkylation, and cleavage. Adapting this workflow onto an automated workstation can increase efficiency and reduce coefficients of variance, thereby providing more reliable data for statistical comparisons between sample types. We previously described an automated proteomic sample preparation workflow1. Here, we report the development of a more efficient and better controlled workflow with the following advantages: 1) The number of liquid transfer steps is reduced from nine to six by combining reagents; 2) Pipetting time is reduced by selective tip pipetting using a 96-position pipetting head with multiple channels; 3) Potential throughput is increased by the availability of up to 45 deck positions; 4) Complete enclosure of the system provides improved temperature and environmental control and reduces the potential for contamination of samples or reagents; and 5) The addition of stable isotope labeled peptides, as well as &#946;-galactosidase protein, to each sample makes monitoring and quality control possible throughout the entire process. These hardware and process improvements provide good reproducibility and improve intra-assay and inter-assay precision (CV of less than 20%) for LC-MS based protein and peptide quantification. The entire workflow for digesting 96 samples in a 96-well plate can be completed in approximately 5 hours.

Here, we present an automated plasma protein digestion method for mass spectrometry-based quantitative proteomic analysis. In this protocol, the liquid transferring and incubation steps for protein denaturation, reduction, alkylation, and trypsin digestion reactions are streamlined and automated. It takes approximately five hours to prepare a 96-well plate with desired precision.

자동화된 워크스테이션을 사용한 질량 분석법을 위한 플라즈마 시료 준비

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ratios (m/z), which are useful to deduce molecular weights and structures. While it is essentially a destructive analytical method, recent advancements in the ambient ionization technique have enabled us to acquire data while leaving tissue in a relatively intact state in terms of integrity. Probe electrospray ionization (PESI) is a so-called direct method because it does not require complex and time-consuming pretreatment of samples. A fine needle serves as a sample picker, as well as an ionization emitter. Based on the very sharp and fine property of the probe tip, destruction of the samples is minimal, allowing us to acquire the real-time molecular information from living things in situ. Herein, we introduce three applications of PESI-MS technique that will be useful for biomedical research and development. One involves the application to solid tissue, which is the basic application of this technique for the medical diagnosis. As this technique requires only 10 mg of the sample, it may be very useful in the routine clinical settings. The second application is for in vitro medical diagnostics where human blood serum is measured. The ability to measure fluid samples is also valuable in various biological experiments where a sufficient volume of sample for conventional analytical techniques cannot be provided. The third application leans toward the direct application of probe needles in living animals, where we can obtain real-time dynamics of metabolites or drugs in specific organs. In each application, we can infer the molecules that have been detected by MS or use artificial intelligence to obtain a medical diagnosis.

This article introduces sample preparation methods for a unique real-time analytical method based on the ambient mass spectrometry. This method lets us perform real-time analysis of the biological molecules in vivo without any special pretreatments.

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management of product yield and quality. Metabolomics data provides a read-out of these interactions at a given moment in time and is informative of an organism&#39;s biochemical status. Further, individual metabolites or panels of metabolites can be used as precise biomarkers for yield and quality prediction and management. The plant metabolome is predicted to contain thousands of small molecules with varied physicochemical properties that provide an opportunity for a biochemical insight into physiological traits and biomarker discovery. To exploit this, a key aim for metabolomics researchers is to capture as much of the physicochemical diversity as possible within a single analysis. Here we present a liquid chromatography-mass spectrometry-based untargeted metabolomics method for the analysis of field-grown wheat grain. The method uses the liquid chromatograph quaternary solvent manager to introduce a third mobile phase and combines a traditional reversed-phase gradient with a lipid-amenable gradient. Grain preparation, metabolite extraction, instrumental analysis and data processing workflows are described in detail. Good mass accuracy and signal reproducibility were observed, and the method yielded approximately 500 biologically relevant features per ionization mode. Further, significantly different metabolite and lipid feature signals between wheat varieties were determined.

A method for the untargeted analysis of wheat grain metabolites and lipids is presented. The protocol includes an acetonitrile metabolite extraction method and reversed phase liquid chromatography-mass spectrometry methodology, with acquisition in positive and negative electrospray ionization modes.

밀 곡물의 비표적 액체 크로마토그래피 질량 분광계 기반 대사체학 분석

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view of the impact of a disease, treatment, or other condition on the proteome as a whole. This report provides a detailed protocol for the extraction, quantification, precipitation, digestion, labeling, and subsequent data analysis of protein samples. Our optimized TMT labeling protocol requires a lower tag-label concentration and achieves consistently reliable data. We have used this protocol to evaluate protein expression profiles in a variety of mouse tissues (i.e., heart, skeletal muscle, and brain) as well as cells cultured in vitro. In addition, we demonstrate how to evaluate thousands of proteins from the resulting dataset.

We present an optimized tandem mass tag (TMT) labeling protocol that includes detailed information for each of the following steps: protein extraction, quantification, precipitation, digestion, labeling, submission to a proteomics facility, and data analyses.

프로테오믹스 시설 제출 및 후속 데이터 분석을 위한 TMT 샘플 준비

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality have been seen for microcrystals with the development of beamline optics, beam stability and variable beam size focusing from submicron to microns, such as at the VMXm beamline at Diamond Light Source1. Further improvements in data quality will be gained through improvements in sample environment and sample preparation. Microcrystals inherently generate weaker diffraction, therefore improving the signal-to-noise is key to collecting quality X-ray diffraction data and will predominantly come from reductions in background noise. Major sources of X-ray background noise in a diffraction experiment are from their interaction with the air path before and after the sample, excess crystallization solution surrounding the sample, the presence of crystalline ice and scatter from any other beamline instrumentation or X-ray windows. The VMXm beamline comprises instrumentation and a sample preparation protocol to reduce all these sources of noise.
Firstly, an in-vacuum sample environment at VMXm removes the air path between X-ray source and sample. Next, sample preparation protocols for macromolecular crystallography at VMXm utilize a number of processes and tools adapted from cryoTEM. These include copper grids with holey carbon support films, automated blotting and plunge cooling robotics making use of liquid ethane. These tools enable the preparation of hundreds of microcrystals on a single cryoTEM grid with minimal surrounding liquid on a low-noise support. They also minimize the formation of crystalline ice from any remaining liquid surrounding the crystals. 
We present the process for preparing and assessing the quality of soluble protein microcrystals using visible light and scanning electron microscopy before mounting the samples on the VMXm beamline for X-ray diffraction experiments. We will also provide examples of good quality samples as well as those which require further optimization and strategies to do so.

The signal-to-noise ratio of data is one of the most important considerations in performing X-ray diffraction measurements from microcrystals. The VMXm beamline provides a low-noise environment and microbeam for such experiments. Here, we describe sample preparation methods for mounting and cooling microcrystals for VMXm and other microfocus macromolecular crystallography beamlines.

VMXm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, including RNA processing, signal transduction, DNA damage response, miRNA biogenesis, and translation.
In recent years, thanks to biochemical and analytical developments, mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as the most effective strategy to characterize the cellular methyl-proteome with single-site resolution. However, identifying and profiling in vivo protein R-methylation by MS remains challenging and error-prone, mainly due to the substoichiometric nature of this modification and the presence of various amino acid substitutions and chemical methyl-esterification of acidic residues that are isobaric to methylation. Thus, enrichment methods to enhance the identification of R-methyl-peptides and orthogonal validation strategies to reduce False Discovery Rates (FDR) in methyl-proteomics studies are required.
Here, a protocol specifically designed for high-confidence R-methyl-peptides identification and quantitation from cellular samples is described, which couples metabolic labeling of cells with heavy isotope-encoded Methionine (hmSILAC) and dual protease in-solution digestion of whole cell extract, followed by off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) chromatography fractionation and affinity enrichment of R-methyl-peptides using anti-pan-R-methyl antibodies. Upon high-resolution MS analysis, raw data are first processed with the MaxQuant software package and the results are then analyzed by hmSEEKER, a software designed for the in-depth search of MS peak pairs corresponding to light and heavy methyl-peptide within the MaxQuant output files.

Protein Arginine (R)-methylation is a wide-spread post-translational modification regulating multiple biological pathways. Mass spectrometry is the best technology to globally profile the R-methyl-proteome, when coupled to biochemical approaches for modified peptide enrichment. The workflow designed for the high confidence identification of global R-methylation in human cells is described here.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...