이 프로토콜은 RNA 분자에서 확인 교환을 검사하기 위해 양성자 R1rho 이완 분산 측정을 위한 RNA 샘플 준비 및 NMR 설정을 설명합니다. 양성자를 프로브하기 때문에 이 방법은 동위원소 라벨링이 필요하지 않으며 직접 이동된 베이스 페어링과 같은 구조적 기능에 액세스할 수 있습니다. 피펫은 시료가 다른 방법으로 제조되더라도 R1rho 이완 분산을 측정할 수 있다는 점에서 매우 모듈식입니다.
플라스미드 샘플을 준비하고 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 체외 전사 및 분열 반응을 설정하여 시작합니다. 1 시간 동안 섭씨 37도에서 반응을 배양하십시오. 그런 다음 로딩 용액에서 샘플 10배의 마이크로리터 1개를 희석시 희석합니다.
그리고 데니링 PAGE 젤에 마이크로리터 1개를 실행합니다. 분열 반응이 성공하면 원하는 볼륨에 대한 반응을 조정하여 하룻밤 동안 실행합니다. 그런 다음 또 다른 데니스팅 PAGE 젤을 실행하고 분열 반응이 완료되었는지 여부를 평가합니다.
불완전한 골짜기의 경우, 종래의 전자레인지에서 반응 용액을 450와트로 15초 동안 가열합니다. 그런 다음 RNA와 분열 가이드를 다시 음상하기 위해 40 분 동안 용액을 섭씨 37도로 천천히 식힙니다. 그리고 새로운 침전물의 형성에 유의하십시오.
무기 파이로포스파타제와 RNase H.Incubate를 섭씨 37도에서 1~3시간 동안 추가합니다. 그런 다음 부인 페이지와 분열 반응의 완료를 확인합니다. RNase H 분열 반응이 완료되면, 50 밀리머 최종 농도에 EDTA를 추가하여 반응을 담금질.
그리고 철저하게 소용돌이. 0.2 미크론 주사기 필터를 통해 용액을 필터링합니다. 그리고 정화를 위해 HPLC 시스템에 주입 가능한 볼륨에 용액을 농축한다.
NMR 튜브에 농축 및 정제 된 샘플을 추가하기 전에 풍부한 물로 씻어 튜브를 청소하십시오. 그런 다음 RNase 오염 시약, 물 및 95 %에탄올을 제거합니다. 물로 마지막 헹구면 말리십시오.
플런저를 물로 헹구고 보풀이 없는 닦기를 사용하여 RNase 제염 시약및 95%에탄올로 청소하십시오. 튜브와 플런저를 건조한 후 NMR 샘플에 10%D2O를 추가합니다. 큰 파이펫 팁을 사용하여 RNA 샘플을 NMR 튜브로 전송하여 튜브 벽의 측면을 따라 흐릅니다.
플런저를 튜브에 삽입하여 빠른 비틀기 동작으로 굴착기를 아래로 밀어 기포를 제거한 다음 플런저를 천천히 당겨 새로운 기포를 만들지 않고 천천히 당깁니다. 그리고 파라핀 왁스 필름으로 고정하십시오. RNA 할당을 위해 완전히 표지된 RNA 샘플에 사용되는 방향족 양성자 탄소 HSQC 데이터 집합을 기반으로 새 데이터 집합을 만듭니다.
일반 매개 변수 및 RD 별 매개 변수를 설정합니다. 그런 다음 테스트를 위해 양성자 스핀 잠금 전력을 1.2 킬로헤르츠로 설정합니다. 하나의 항목, 0 밀리초, TDF1을 하나로 설정하고 D30을 업데이트하여 테스트 스펙트럼을 실행하도록 테스트 VD 목록을 생성합니다.
테스트 vd 목록을 설정한 후 D30 및 TDF1을 업데이트합니다. 그리고 다른 스핀 잠금 길이에 대한 피크의 강도를 플롯. 원래 피크의 강도가 1/3으로 감소하는 스핀 잠금 길이를 식별합니다.
테스트 실행의 결과에서 실험에 사용할 최종 VD 목록을 만듭니다. 목록의 가장 약한 피크에 최소 10의 신호 대 잡음 비율이 있도록 검사 수를 선택합니다. 탠덤 성적증명서의 여러 골짜기 반응의 결과는 여기에 표시됩니다.
20개의 뉴클레오티드 표적 RNA가 성공적인 반응에서 생성되었다. 실패한 반응은 샘플의 불완전하고 실패한 절단을 초래했습니다. RNA 샘플의 HPLC 주사는 38분에서 순수 표적 RNA에 대한 피크를 밝혀냈습니다.
더 길고 짧은 제품은 관심의 절정에서 잘 분리되었지만. RNA 헤어핀의 분석은 관찰된 이미노 양성자의 수가 이차 구조 시뮬레이션에서 예상되는 이미노 양성자의 수와 일치하는 것으로 나타났다. RNA의 방향족 공명의 양성자 탄소 HSQC 스펙트럼은 접힌 후 4개의 신호를 보였다.
그리고 접기 전에 세 개의 신호. 두 개의 다른 H8 원자와 두 개의 다른 합성 RNA 헤어핀에 대해 얻은 공명 곡선에 대한 대표에서, G6H8은 확인 교환을 경험한다. A4H8은 그렇지 않지만.
G6H8의 경우 컬러 스핀 잠금 능력이 선택되고 공진 데이터가 기록되었습니다. 교환이 느린 CG 구조에서 R1rho 행 값과 오프셋 플롯은 이미 곡선의 약간의 비대칭을 표시하여 화학 적 변화 차이 델타 오메가의 표시를 나타냅니다. R1 기여도가 제거되는 R2 플러스 REX 플롯에서 더욱 명백해집니다.
한편, GC 구조는 더 빠른 교환을 경험하고 R1rho 값과 오프셋 플롯은 R2 플러스 REX 플롯에서도 델타 오메가의 추출이 덜 분명해지는 더 넓은 곡선을 제시했습니다. 일단 RNA 역학이 해명되면, 국가는 특징과 갇혀 있을 수 있습니다. 이러한 갇힌 상태는 예를 들어 생물학적 검사에서 테스트할 수 있습니다.
이 방법을 통해 활성 microRNA miRNA 복합체에서 기능적이고 관련기식 페어링 교대, 리보소말 RNA의 루프 리플렉트 및 단일 뉴클레오티드 불룩의 기본 쌍 안정성을 관찰할 수 있습니다.
