저자는 Drs. Fahad Bafakih와 Jim Mandell, 면역 조직 화학에 도움을 준 Garrett F. Beeghly, 심장 혈관 연구 센터 Histology Core 및 Biorepository and Tissue Research Facility, University of Virginia의 Biomolecular Analysis Facility에 대한 지원 샘플 수집, 면역 조직 화학 및 영상.

이 프로토콜은 은행 임상 환자 샘플에 일반적 인 것처럼 포르말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 샘플의 세포 구성 요소를 식별합니다. 파라핀 삽입은 세포 및 조직 형태의 최적 유지뿐만 아니라 절편의 수명을 연장시킵니다. 이 분석에 사용 된 샘플은 University of Virginia Biorepository and Tissue Research Facility를 통해 확인할 수있었습니다. 환자 샘플은 2010 년과 2013 년 사이에 버지니아 대학에서 종양 절제술을 완료했다 아교 모세포종 (성상 세포종, WHO 등급 IV)의 최종 진단에 따라 신경 병리학에 의해 선정되었으며,이 분석 11 이전에 해제 확인되었다. 1. FFPE 샘플 탈 파라핀 및 재수 화 참고 : 프로토콜의이 부분은 FFPE 샘플에만 해당됩니다. 파라핀 포매 된 샘플은 세포 및 t의 보존 때문에이 분석에 더 유용 할 수 있지만형태학 문제를 해결하기 위해이 분석은 고정 된 섹션에서도 수행 할 수 있습니다. 동결 절편을 사용하는 경우이 부분을 생략하고 직접 발색 면역 조직 화학 법으로 진행할 수 있습니다. <ol><li> 크실렌, 크실렌, 100 % 에탄올, 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 95 % 에탄올, 70 % 에탄올, 탈 이온수, 탈 이온수 각각 5 분 동안 다음 세척을 수행하십시오 </li></ol> 2. 항원 검색 참고 : 프로토콜 의이 부분은 FFPE 샘플의 포르말린 고정하는 동안 형성된 메틸렌 다리를 깨고 항체가 바인딩 할 항원 사이트를 노출하는 데 필요합니다. <ol><li> 증류수 제조사의 권장 사항에 따라 Tris 기반 고 pH 항원 비 차단 용액을 희석하십시오. </li><li> 전자 레인지를 사용하여 열 매개 항원 검색을 수행하십시오. 다른 형태의 열 중재 검색 (예 : 압력솥, 야채 증기선 또는 끓는 물)도 충분합니다. <ol><li> 희석 된 언 마스킹 용액을 밀봉되지 않은 전자 레인지에 첨가한다.용기. 슬라이드에 슬라이드를 넣으십시오. 슬라이드를 전자 레인지에 놓습니다. </li><li> 고출력으로 20 분간 끓입니다. 증발을위한 액체 레벨을 모니터하고 필요에 따라 증류수를 보충하십시오. </li></ol></li><li> 실온에서 1 시간 동안 시료를 냉각시킨다. </li></ol> 3. 염색체 면역 조직 화학 <ol><li> 샘플을 덮는 데 필요한 시약의 양을 최소화하기 위해 소수성 펜으로 조직 샘플의 윤곽을 잡습니다. 참고 : 조직 샘플을 수분 상태로 유지하고 염색 효능에 영향을 미치기 때문에 건조시키지 마십시오. </li><li> 조직 샘플 (일반적으로 약 100 - 200 μL)을 충당 할 수 있도록 충분한 투과성 용액 (TBS-TBS (Tris-buffered saline) + 0.01 % Triton-X)을 피펫에 넣습니다. </li><li> 용액을 제거하고 버리고 3.2 단계를 반복하십시오. </li><li> 블로킹 용액 (2.5 % 말 혈청 + 투과 액)으로 실온에서 샘플을 인큐베이션한다. </li><li> 4 ºC에서 1 차 항체 희석 한 채 밤새차단 용액. 참고 : 여기에 사용 된 모든 1 차 항체는 1 : 200으로 희석 되나 제조업체 권장 사항부터 일련 희석을 사용하여 최적 희석을 결정할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용 된 항체에 대한 자세한 정보는 이전에 출판되었습니다 11 . </li><li> 제조 프로토콜에 따라 일차 항체 호스트 동물에 해당하는 양 고추 냉이 퍼 옥시다아제 폴리머 시약을 사용하여 일차 항체를 검색합니다. </li><li> 피펫은 조직 시료를 덮고 5 분 동안 배양하기에 충분한 투과성 솔루션을 제공합니다. </li><li> 용액을 제거하고 버리고 3.7 단계를 반복하십시오. </li><li> 15 분 1X TBS에서 0.3 % H 2 O 2 로 슬라이드를 품어. </li><li> 원하는 염색 강도가 달성 될 때까지 peroxidase diaminobenzidine (DAB) 기질로 시료를 2 ~ 10 분 동안 발색하십시오. </li><li> 헤 마톡 실린 (hematoxylin)과 같은 세포 핵을 확인하기 위해 샘플을 대조 제제 (counterstain)하여 제조사 프로토콜을 따른다. </li><li> 100 %에탄올 및 자일 렌. </li><li> 샘플을 마운팅 미디어로 영구 마운트하십시오. </li></ol> 4. 관심 지역 <ol><li> 밝은 영역 현미경으로 이미지 슬라이드가 고해상도 이미지를 낼 수 있습니다. 참고 : 이미징 셀룰러 구성 요소는 최소 20x 해상도로 사용하십시오. </li><li> 조직 샘플 전체에서 특정 관심 영역으로 카메라를 이동하십시오. </li><li> 이미지를 TIFF 파일로 저장하여 정량화하십시오. </li></ol> 5. 이미지 분석 <ol><li> 이미지 적용 범위의 정량화를 위해 ImageJ에서 이미지를 엽니 다. </li><li> Threshold Color 플러그인을 사용하여 hematoxylin으로 염색 된 핵에서 자주색을 제거합니다. </li><li> 이미지를 8 비트로 변환하십시오. </li><li> 어두운 배경없이 임계 값을 추가하십시오. </li><li> 17 개의 미리로드 된 ImageJ 임계 값 필터 중 하나 ( 예 : MaxEntropy)를 사용하여 이미지를 처리하므로 DAB로 염색 된 부분 만 임계 값에 포함됩니다. 참고 : 최소화 된 최적의 미리로드 된 임계 값 필터를 선택하십시오배경 염색의 포함. 이는 항체의 염색 및 특이성에 달려 있습니다. 각 환자 샘플 내의 모든 기술 복제물에 대해 동일한 임계 값을 사용하십시오. </li><li> 임계 값을 적용하십시오. </li><li> 임계 값 이미지의 백분율을 측정합니다. </li><li> 각 표본의 여러 영역에 대한 평균 영역 범위입니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+glioma+growth:+a+guerilla+war.">Diffuse glioma growth: a guerilla war.</a> Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).</li><li>Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+multiforme:+the+terminator.">Glioblastoma multiforme: the terminator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).</li><li>Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublethal+Irradiation+Promotes+Migration+and+Invasiveness+of+Glioma+Cells.">Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells.</a> Cancer Res. 61 (6), (2001).</li><li>Tuettenberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrence+pattern+in+glioblastoma+multiforme+patients+treated+with+anti-angiogenic+chemotherapy.">Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135 (9), 1239-1244 (2009).</li><li>Munson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-invasive+adjuvant+therapy+with+imipramine+blue+enhances+chemotherapeutic+efficacy+against+glioma.">Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma.</a> Sci. Transl. Med. 4 (127), 127ra36 (2012).</li><li>Correia, A. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+is+a+dominant+force+in+multidrug+resistance.">The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance.</a> Drug Resist. Updat. 15 (1-2), 39-49 (2012).</li><li>Rubin, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Only+in+congenial+soil:+the+microenvironment+in+brain+tumorigenesis.">Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis.</a> Brain Pathol. 19 (1), 144-149 (2009).</li><li>Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+glioma+migration.">Microglia promote glioma migration.</a> Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).</li><li>Le, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+astrocytes+by+glioma+cells+to+facilitate+invasiveness:+a+mechanism+involving+matrix+metalloproteinase-2+and+the+urokinase-type+plasminogen+activator-plasmin+cascade.">Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade.</a> J. Neurosci. 23 (10), 4034-4043 (2003).</li><li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+microglia/macrophages+enhance+the+invasion+of+glioma+stem-like+cells+via+TGF-&#946;1+signaling+pathway.">Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-&#946;1 signaling pathway.</a> J. Immunol. 189, 444-453 (2012).</li><li>Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+the+Cellular+Microenvironment+of+Glioblastoma+to+Develop+Predictive+Statistical+Models+of+Overall+Survival.">Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. , (2016).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Image+Analysis+of+Cellular+Heterogeneity+in+Breast+Tumors+Complements+Genomic+Profiling.">Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling.</a> Sci. Transl. Med. 4 (157), (2012).</li><li>Yi, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Obstructive+Intimal+Lesions+and+Their+Cellular+Phenotypes+in+Chronic+Pulmonary+Hypertension.">Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162 (4), 1577-1586 (2000).</li><li>Turcan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDH1+mutation+is+sufficient+to+establish+the+glioma+hypermethylator+phenotype.">IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype.</a> Nature. 483 (7390), 479-483 (2012).</li><li>Songtao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDH+mutations+predict+longer+survival+and+response+to+temozolomide+in+secondary+glioblastoma.">IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma.</a> Cancer Sci. 103 (2), 269-273 (2012).</li><li>Shinojima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+Value+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+in+Patients+with+Glioblastoma+Multiforme.">Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme.</a> Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).</li><li>Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+inhibition+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+high-grade+gliomas:+where+do+we+stand?.">Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand?.</a> Mol. Cancer Res. 7 (7), 1000-1012 (2009).</li><li>Badie, B., Schartner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microglia+in+glioma+biology.">Role of microglia in glioma biology.</a> Microsc. Res. Tech. 54 (2), 106-113 (2001).</li><li>Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+function+in+brain+tumors.">Microglia function in brain tumors.</a> J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).</li><li>Alves, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+cells:+A+heterogeneous+and+fatal+tumor+interacting+with+the+parenchyma.">Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma.</a> Life Sci. 89 (15), 532-539 (2011).</li><li>Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microglia+and+macrophages+in+glioma+maintenance+and+progression.">The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression.</a> Nat. Neurosci. 19 (1), 20-27 (2015).</li><li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/macrophages+promote+glioma+progression.">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59 (3), 472-485 (2011).</li><li>Placone, A. L., Qui&#241;ones-Hinojosa, A., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+astrocytes+in+the+progression+of+brain+cancer:+complicating+the+picture+of+the+tumor+microenvironment.">The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment.</a> Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).</li><li>Rath, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Enhance+the+Invasion+Potential+of+Glioblastoma+Stem-Like+Cells.">Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells.</a> PLoS One. 8 (1), e54752 (2013).</li></ol>

우리의 방법은 전통적인 chromogenic immunohistochemistry를 사용하여 염색 된 조직 학적 샘플을 분석하는 정량적 접근법입니다. 이 유형의 분석을위한 현재의 방법론은 유사한 염색 프로토콜과 독립적 인 병리학 자의 채점을 포함합니다. 이 방법은 신뢰할 만하다. 그러나 많은 응용에서 종양과 관련된 이질성에 대한 더 나은 이해와 생체 외 연구를위한 종양의 정확한 재현과 같은 세포 구성에 대한보다 ?...

아교 모세포종 (GBM), 가장 일반적인 악성 뇌종양은 주변의 건강한 뇌 실질 1, 2에 기본 종양 부피에서 매우 확산 침공에 의해 특징입니다. 이 확산 침투는 종양을 완전히 절제하는 것을 특히 어렵게 만들고, 치료 후 남아있는 침입 암 세포는 피할 수없는 재발의 가장 흔한 원인입니다 2 , 3 , 4 . 이전에, 우리는 그러나 조금 GBM의 침략에 기여하는 복잡한 메커니즘에 대해 알려진, 확산 신경 교종 세포 침공 (5) 치료 도움이 될 억제 발견했다. 암 주변 종양 미세 환경, 또는 조직은,도 7은 여러 암 6 종양의 진행에 관여한다. 교 모세포종 종양 미세 환경, p관절염은 성상 세포, 미세 아교 세포 및 희소 돌기 아교 세포뿐만 아니라 세포 외 기질, 용해성 인자 및 생물 물리학 적 인자와 같은 다수의 신경교 세포를 구성하는 비교적 특징이 낮고 독특하게 복잡합니다. 실험적으로, 성상 세포 및 미세 아교 세포는 신경 교종의 진행과 침공 8, 9, 10을 증가시키는 것으로,하지만 원래 인간의 뇌의 미세 환경에있는 모든 신경 교세포의 구성을 알 수있다. 우리는 이전에 미세 환경 구성 요소가 glioblastoma microenvironment의 세포 구성 요소를 정량 분석하고 비례 위험 모델 11에 우리의 분석을 통합하여 환자의 생존을 예측할 수 있음을 보여주었습니다. 여기, 우리는 glioblastoma 환자에서 종양 대량 및 종양 절제의 인접 지역 내의 glial 세포의 인구를 식별하기위한 정량 분석 ​​방법을 설명합니다에스. 우리는 각질 세포군에 대한 염색의 비율 적용 범위를 분석하기 위해 염색체 면역 조직 화학을 사용하여 신경 교세포 집단과 ImageJ를 확인했습니다. 커버리지 비율을 평가하면 세포, 특히 암세포와의 상호 작용에 의해 영향을받는 세포의 형태 학적 차이를 측정하기위한 간단한 측정이 가능합니다. 조직 병리학 적 염색을 정량화하기위한 이전의 연구는 항체 기반 면역 조직 화학 염색의 특이성을 이용하지 않는 헤 마톡 실린 (hematoxylin)과 에오신 (eosin) 12 또는 Masson &#39;s trichrome 13 과 같은 표준 염색법을 사용한다. 우리의 방법은 glioblastoma 환자의 종양 절제술에서 glial 집단을 직접 정량화하기 위해 개발되었으며, 복잡한 glioblastoma microenvironment를 밝히기 위해 사용합니다.

<table><tbody><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3P</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>High pH antigen unmasking solution</td><td>Vector Labs</td><td>H-3301</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Amresco</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-ALDH1L1&amp;nbsp;</td><td>abcam&amp;nbsp;</td><td>ab56777</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Iba1&amp;nbsp;</td><td>abcam&amp;nbsp;</td><td>ab5076</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1&amp;nbsp;</td><td>abcam&amp;nbsp;</td><td>ab53041</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS anti-goat</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit)</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7500</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB substrate</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin counterstain</td><td>ThermoScientific</td><td>72404</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice Mounting Media</td><td>Amresco</td><td>H157-475</td><td></td></tr><tr><td>Aperio Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Super HT PAP Pen</td><td>Research Products International</td><td>195506</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative immunohistochemistry of the cellular microenvironment in patient glioblastoma resections

종양의 미세 환경에 대한 관심이 증대됨에 따라 가장 치명적이고 가장 침습적 인 뇌암 인 아교 모세포종 환자의 표본에서 미세 환경 성분을 구체적으로 결정하는 방법을 개발하기 시작했습니다. 병이있는 조직을 정확하게 묘사하기 위해 정량적 방법이 유용 할뿐만 아니라 잠재적으로 더 정확한 예후, 진단 및 조직 공학 시스템과 대체물의 개발에 기여할 수 있습니다. 아교 모세포종에서, 소교 세포 및 성상 세포와 같은 신경 교세포는 병리학 자의 등급에 기초하여 불량한 예후와 독립적으로 상관되어왔다. 그러나, 이들 세포 및 다른 교세포 구성 요소의 상태는 정량적으로 잘 기술되어 있지 않다. 이러한 glial 세포를 표시하는 큰 프로세스로 인해 어려울 수 있습니다. 또한 대부분의 조직 학적 분석은 전체 조직 표본에 초점을 맞추거나 종양의 대부 분에만 초점을 맞 춥니 다.매우 이질적인 조직. 여기, 우리는 glioblastoma 환자의 종양 절제술의 종양 대량 및 인접 지역 내의 glial 세포의 인구를 식별하고 양적으로 분석하는 방법을 설명합니다. 우리는 색소 성 면역 조직 화학을 사용하여 환자의 종양 절제술에서 glial 세포 집단을 확인하고 ImageJ는 각 glial 집단에 대한 염색의 비율 범위를 분석했습니다. 이러한 기술로 우리는 신경 교종 종양 미세 환경의 영역에 걸쳐 신경아 교세포를 더 잘 묘사 할 수 있습니다.

이 분석을 위해 우리의 종양 절제술 (주로 종양 벌크와 인접한 부위, 주로 확산 성 침윤 암세포가있는 건강한 조직으로 구성된 두 영역)의 두 관심 영역이 헤 마톡 실린과 에오신 염색 환자에서 신경 병리학자를 협동하여 확인되었습니다 ( 그림 1A , 1B ) 견본. 각 환자 표본 내에서 색소 성 면역 조직 화학을 통해 성상 교세포 ( <strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections at JoVE.com

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

환자 Glioblastoma 절제술에서 세포 미세 환경의 정량적 면역 조직 화학

이 프로토콜은 chromogenic immunohistochemistry 및 ImageJ를 사용하여 glioblastoma 환자 절제술에서 종양 microenvironment 구성 요소를 정량적으로 식별하기 위해 개발되었습니다.

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

quantitative-immunohistochemistry-cellular-microenvironment-patient

Research

JoVE Journal

Medicine

9.6K 조회수.  University of Virginia.  이 프로토콜은 chromogenic immunohistochemistry 및 ImageJ를 사용하여 glioblastoma 환자 절제술에서 종양 microenvironment 구성 요소를 정량적으로 식별하기 위해 개발되었습니다. 

비디오: Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased understanding of the molecular events that give rise to glioblastomas, this cancer still remains highly refractory to conventional treatment. Surgical resection of high grade brain tumors is rarely complete due to the highly infiltrative nature of glioblastoma cells. Therapeutic approaches which attenuate glioblastoma cell invasion therefore is an attractive option. Our laboratory and others have shown that tumor associated macrophages and microglia (resident brain macrophages) strongly stimulate glioblastoma invasion. The protocol described in this paper is used to model glioblastoma-macrophage/microglia interaction using in vitro culture assays. This approach can greatly facilitate the development and/or discovery of drugs that disrupt the communication with the macrophages that enables this malignant behavior. We have established two robust coculture invasion assays where microglia/macrophages stimulate glioma cell invasion by 5 - 10 fold. Glioblastoma cells labelled with a fluorescent marker or constitutively expressing a fluorescent protein are plated without and with macrophages/microglia on matrix-coated polycarbonate chamber inserts or embedded in a three dimensional matrix. Cell invasion is assessed by using fluorescent microscopy to image and count only invasive cells on the underside of the filter. Using these assays, several pharmacological inhibitors (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib, and Semapimod), have been identified which block macrophage/microglia stimulated glioblastoma invasion.

Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.

공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

연구

암 연구학

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for immunotherapies. Recent clinical advances in immunotherapy highlight the need for reproducible methods to accurately and thoroughly characterize the tumor and its associated immune infiltrate. Tumor enzymatic digestion and flow cytometric analysis allow broad characterization of numerous immune cell subsets and phenotypes; however, depth of analysis is often limited by fluorophore restrictions on panel design and the need to acquire large tumor samples to observe rare immune populations of interest. Thus, we have developed an effective and high throughput method for separating and enriching the tumor immune infiltrate from the non-immune tumor components. The described tumor digestion and centrifugal density-based separation technique allows separate characterization of tumor and tumor immune infiltrate fractions and preserves cellular viability, and thus, provides a broad characterization of the tumor immunologic state. This method was used to characterize the extensive spatial immune heterogeneity in solid tumors, which further demonstrates the need for consistent whole tumor immunologic profiling techniques. Overall, this method provides an effective and adaptable technique for the immunologic characterization of subcutaneous solid murine tumors; as such, this tool can be used to better characterize the tumoral immunologic features and in the preclinical evaluation of novel immunotherapeutic strategies.

Here we describe a method to separate and enrich components of the tumor immune and non-immune microenvironment in established subcutaneous tumors. This technique allows for the separate analysis of tumor immune infiltrate and non-immune tumor fractions which can permit comprehensive characterization of the tumor immune microenvironment.

농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as biomarkers with applications in diagnosis, prognosis, classification, state of tumor progression, and cell differentiation state. These analyses of biomarkers are also useful to characterize tumor neurospheres (NS) generated from glioma patients and glioma models. Tumor NS provide a valuable in vitro model to assess different features of the tumor from which they are derived and can more accurately mirror glioma biology. Here we describe a detailed method to analyze biomarkers in tumor NS using immunohistochemistry (IHC) on paraffin-embedded tumor NS.

Neurospheres grown as 3D cultures constitute a powerful tool to study glioma biology. Here we present a protocol to perform immunohistochemistry while maintaining the 3D structure of glioma neurospheres through paraffin embedding. This method enables the characterization of glioma neurosphere properties such as stemness and neural differentiation.

Immunohistochemistry 파라핀 임베디드 3D Glioma Neurosphere 문화에 의해 Glioma 바이오 마커의 평가

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell cultures that preserve the genomic profile of the parental tumors, for use in patient specific in vitro and in vivo models, has the potential to revolutionize the preclinical development of new treatments for glioblastoma tailored to the molecular characteristics of each tumor.
Starting with fresh high grade astrocytoma tumors dissociated into single cells, we use the neurosphere assay as an enrichment method for cells presenting cancer stem cell phenotype, including expression of neural stem cell markers, long term self-renewal in vitro, and the ability to form orthotopic xenograft tumors. This method has been previously proposed, and is now in use by several investigators. Based on our experience of dissociating and culturing 125 glioblastoma specimens, we arrived at the detailed protocol we present here, suitable for routine neurosphere culturing of high grade astrocytomas and large scale expansion of tumorigenic cells for preclinical studies. We report on the efficiency of successful long term cultures using this protocol&#160;and suggest affordable alternatives for culturing dissociated glioblastoma cells that fail to grow as neurospheres. We also describe in detail a protocol for preserving the neurospheres 3D architecture for immunohistochemistry. Cell cultures enriched in CSCs, capable of generating orthotopic xenograft models that preserve the molecular signatures and heterogeneity of GBMs, are becoming increasingly popular for the study of the biology of GBMs and for the improved design of preclinical testing of potential therapies.

Protocol for propagation of dissociated high grade glioma surgical specimens in serum-free neurosphere medium to select for cells with cancer stem cell phenotype. For specimens that fail to grow as neurospheres, an alternative protocol is suggested. A paraffin embedding technique for maintaining the 3D neurosphere architecture for immunocytochemistry is described.

임상적으로 관련동물 모델 및 3D 면역화학에 사용하기 위한 외과 표본에서 고학년 신경교종 세포 배양의 최적화

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

의학

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically complex tumors, with a high degree of proteomic variability across both the tumor itself and its heterogenous microenvironment. The malignant potential of these tumors is enhanced by the dysregulation of proteins involved in several key pathways, including processes that maintain cellular stability and preserve the structural integrity of the microenvironment. Although there have been numerous bulk and single-cell glioma analyses, there is a relative paucity of spatial stratification of these proteomic data. Understanding differences in spatial distribution of tumorigenic factors and immune cell populations between the intrinsic tumor, invasive edge, and microenvironment offers valuable insight into the mechanisms underlying tumor proliferation and propagation. Digital spatial profiling (DSP) represents a powerful technology that can form the foundation for these important multilayer analyses.
DSP is a method that efficiently quantifies protein expression within user-specified spatial regions in a tissue specimen. DSP is ideal for studying the differential expression of multiple proteins within and across regions of distinction, enabling multiple levels of quantitative and qualitative analysis. The DSP protocol is systematic and user-friendly, allowing for customized spatial analysis of proteomic data. In this experiment, tissue microarrays are constructed from archived glioblastoma core biopsies. Next, a panel of antibodies is selected, targeting proteins of interest within the sample. The antibodies, which are preconjugated to UV-photocleavable DNA oligonucleotides, are then incubated with the tissue sample overnight. Under fluorescence microscopy visualization of the antibodies, regions of interest (ROIs) within which to quantify protein expression are defined with the samples. UV light is then directed at each ROI, cleaving the DNA oligonucleotides. The oligonucleotides are microaspirated and counted within each ROI, quantifying the corresponding protein on a spatial basis.

Proteomic dysregulation plays an important role in the spread of diffusely infiltrating gliomas, but several relevant proteins remain unidentified. Digital spatial processing (DSP) offers an efficient, high-throughput approach for characterizing the differential expression of candidate proteins that may contribute to the invasion and migration of infiltrative gliomas.

성인형 미만성 침윤성 신경교종의 미세환경 특성화를 위한 디지털 공간 프로파일링

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

종양 미세환경의 다중 면역형광 및 공간 이미지 분석(Multiplex Immunofluorescence and Spatial Image Analysis of the Tumor Microenvironment)

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending on its composition and the interactions between cancer cells and peri-tumoral cells, the TME may affect cancer progression. The characterization of tumors and their complex microenvironment could improve the understanding of cancer diseases and may help scientists and clinicians to discover new biomarkers.
We recently developed several multiplex immunofluorescence (mIF) panels based on tyramide signal amplification (TSA) for the characterization of the TME in colorectal cancer, head and neck squamous cell carcinoma, melanoma, and lung cancer. Once the staining and scanning of the corresponding panels are completed, the samples are analyzed on an image analysis software. The spatial position and the staining of each cell are then exported from this quantification software into R. We developed R scripts that allow us not only to analyze the density of each cell type in several tumor compartments (e.g. the center of the tumor, the margin of the tumor, and the stroma) but also to perform distance-based analyses between different cell types.
This particular workflow adds a spatial dimension to the classical density analysis already routinely performed for several markers. mIF analysis could allow scientists to have a better understanding of the complex interaction between cancer cells and the TME and to discover new predictive biomarkers of response to treatments, such as immune checkpoint inhibitors, and targeted therapies.

저자 스포트라이트: 종양 미세환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 다중 면역형광  

In this article, a protocol for manual tyramide signal amplification (TSA) multiplex immunofluorescence (mIF) combined with image analysis and spatial analysis is described. This protocol can be used with formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) sections for the staining of two to six antigens per slide depending on the slide scanner available in the laboratory.

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

면역학 및 감염병학

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

정위 적 입양 전송 Orthotopic 인간 세포종 님 Xenografts Murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

환자 Glioblastoma 절제술에서 세포 미세 환경의 정량적 면역 조직 화학

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기

농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

Immunohistochemistry 파라핀 임베디드 3D Glioma Neurosphere 문화에 의해 Glioma 바이오 마커의 평가

임상적으로 관련동물 모델 및 3D 면역화학에 사용하기 위한 외과 표본에서 고학년 신경교종 세포 배양의 최적화

성인형 미만성 침윤성 신경교종의 미세환경 특성화를 위한 디지털 공간 프로파일링

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

정위 적 입양 전송 Orthotopic 인간 세포종 님 Xenografts Murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의