Yazarlar Dr Dr teşekkür ederim. Fahad Bafakih ve Jim Mandell, hasta numunelerinin edinilmesi ve tanımlanması için Garrett F. Beeghly, Biyorepository ve Doku Araştırma Tesisi, Kardiyovasküler Araştırma Merkezi Histoloji Çekirdeği ve Virginia Üniversitesindeki Biyomoleküler Analiz Merkezi ile yardımda bulunmak için yardım ettiler. Örnek alma, immünohistokimya ve görüntüleme.

Bu protokol, bloke edilmiş klinik hasta örnekleri için normal olduğu gibi, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) numunelerdeki hücresel bileşenleri tanımlar. Parafin gömülmesi, hücresel ve doku morfolojisinin en iyi şekilde korunmasına ve bölümlerin daha uzun ömürlü olmasına olanak tanır. Bu analiz için kullanılan örneklere Virginia Üniversitesi Biyorepository ve Doku Araştırma Tesisi aracılığıyla erişilmiştir. Hasta numuneleri, 2010 ve 2013 yılları arasında Virginia Üniversitesi&#39;nde tümör rezeksiyonlarını tamamlayan ve glioblastoma (astrositom, DSÖ grade IV) kesin bir teşhisine dayanan bir nöropatolog tarafından seçildi ve bu analizden önce tanımlanmadı 11 . 1. FFPE Örneği Deparafinizasyon ve Rehidrasyon NOT: Protokolün bu kısmı FFPE örneklerine özeldir. Parafin gömülü numuneler, bu analiz için hücresel ve t korunmasından dolayı daha yararlı olabilirkenMorfoloji yayınlarken, bu analiz donmuş bölümlerle de yapılabilir. Dondurulmuş kesitler kullanılıyorsa bu bölüm atlanabilir ve direkt olarak kromojenik immünohistokimyaya geçebilir. <ol><li> Ksinilen, ksilen,% 100 etanol,% 100 etanol,% 95 etanol,% 95 etanol,% 70 etanol, Deiyonize su, Deiyonize su </li></ol> 2. Antijen Geri Alma NOT: Protokolün bu kısmı, FFPE numunelerinin formalin fiksasyonu sırasında oluşan metilen köprülerini kırmak ve bağlamak için antikorlar için antijen alanlarını ortaya çıkarmak için gereklidir. <ol><li> Damıtılmış suda üreticinin tavsiyesi üzerine Tris bazlı yüksek pH antijen maskesini çözündürünüz. </li><li> Bir mikrodalga kullanarak ısı aracılı antijen alımını gerçekleştirin. Isı aracılı geri alımın diğer biçimleri (basınçlı ocak, sebze buharı veya kaynar su gibi) de yeterli olacaktır. <ol><li> Seyreltilmiş maskelenmeyen çözeltiyi, mühürlenmemiş bir mikrodalgaya tabi tutulabilirliğe ilave edindamar. Kayıkları tekneye yerleştirin. Slaytları mikrodalga fırına yerleştirin. </li><li> Yüksek güçlü, 20 dk kaynatın. Buharlaşma için sıvı seviyelerini izleyin ve gerekirse damıtılmış su ile doldurun. </li></ol></li><li> Numunelerin, çözeltide oda sıcaklığında 1 saat bekletilmesine izin verin. </li></ol> 3. Kromojenik İmmünohistokimya <ol><li> Örneği örtmek için gereken reaktif hacmini en aza indirgemek için hidrofobik bir kalem ile doku örneğini ana hatlarıyla çizin. NOT: Doku numunelerini sulu tutun ve lekelenme etkinliğini etkileyeceği için kurumasına izin vermeyin. </li><li> Doku örneğini örtmek için yeterli permeabilizasyon solüsyonu (Tris-tamponlu salin (TBS) +% 0.01 Triton-X) pipetleyin (tipik olarak yaklaşık 100 - 200 μL). </li><li> Çözümü çıkarıp atın ve adım 3.2&#39;yi tekrarlayın. </li><li> Örnekleri engelleme çözeltisi (% 2.5 at serum + permeabilization çözüm) oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Seyreltilmiş primer antikorlarla gece boyunca 4 ºC&#39;de örnekleri inkübe edinEngelleme çözümünde. NOT: Burada kullanılan tüm birincil antikorlar 1: 200&#39;de seyreltilir, ancak en iyi seyreltiler imalatçının tavsiyesi ile başlayan seri seyreltmeler kullanılarak belirlenebilir. Bu protokolde kullanılan antikorlar hakkında ayrıntılı bilgi 11 yayınlanmıştır. </li><li> Birincil antikorları, birincil antikor konakçı hayvana karşılık gelen bir yaban turbu peroksidaz polimer reaktifi kullanarak, üretici protokolünü izleyerek tespit edin. </li><li> Doku numunesini örtmek için 5 dakika yeterli inkübasyon solüsyonu pipetleyin ve inkübe edin. </li><li> Çözümü çıkarın ve atın ve Adım 3.7&#39;yi tekrarlayın. </li><li> 15 dakika boyunca 1 x TBS,% 0.3 H2O 2 slaytlar inkübe edin. </li><li> Bir peroksidaz diaminobenzidin (DAB) substrat ile istenilen leke yoğunluğuna ulaşılıncaya kadar 2-10 dakika örnekler geliştirin. </li><li> Hematoksilen gibi hücre çekirdeğini üreticinin protokolünü izleyerek tanımlamak için leke örnekleri hazırlayın. </li><li> Örnekleri% 100 oranında kurutunEtanol ve ksilen. </li><li> Örnekleri montaj malzemeleri ile kalıcı olarak monte edin. </li></ol> 4. İlgi Alanı Tanımlama Bölgeleri <ol><li> Yüksek çözünürlüklü görüntülere sahip parlak alan mikroskobu altında görüntü slaytları. NOT: Görüntüleme hücresel bileşenlerini en az 20x çözünürlükte kullanın. </li><li> Fotoğraf makinesini doku örnekleri boyunca belirli bölgelere taşıyın. </li><li> Niceleme için resimleri TIFF dosyaları olarak kaydedin. </li></ol> 5. Görüntü Analizi <ol><li> Yüzde kapsama alanının miktarını belirlemek için ImageJ&#39;de resim açın. </li><li> Hematoksilenle boyalı çekirdeğin mor rengini çıkarmak için Eşik Renk eklentisini kullanın. </li><li> Görüntüyü 8 bit&#39;e dönüştürün. </li><li> Karanlık arka plan olmadan eşik ekleyin. </li><li> 17 önceden yüklenmiş ImageJ eşik filtrelerinden ( örn. MaxEntropy) birini kullanarak işlem görüntüsü, böylece yalnızca DAB lekeli kısımları eşiğe dahil edilir. NOT: Minimize eden en iyi ön yüklemeli eşik filtresini seçinArka plan boyamanın dahil edilmesi. Bu, lekelenme kalitesine ve antikorun spesifitesine bağlı olabilir. Her hasta örneğindeki tüm teknik çoğaltmalar için aynı eşiği kullanın. </li><li> Eşik uygula. </li><li> Eşikli görüntünün yüzde alanını ölçün. </li><li> Her örnek içindeki birden çok bölge için yüzde yüzdelik kapsam. </li></ol>

<ol>
	<li>Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+glioma+growth:+a+guerilla+war.">Diffuse glioma growth: a guerilla war.</a> Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).</li><li>Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+multiforme:+the+terminator.">Glioblastoma multiforme: the terminator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).</li><li>Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublethal+Irradiation+Promotes+Migration+and+Invasiveness+of+Glioma+Cells.">Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells.</a> Cancer Res. 61 (6), (2001).</li><li>Tuettenberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrence+pattern+in+glioblastoma+multiforme+patients+treated+with+anti-angiogenic+chemotherapy.">Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135 (9), 1239-1244 (2009).</li><li>Munson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-invasive+adjuvant+therapy+with+imipramine+blue+enhances+chemotherapeutic+efficacy+against+glioma.">Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma.</a> Sci. Transl. Med. 4 (127), 127ra36 (2012).</li><li>Correia, A. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+microenvironment+is+a+dominant+force+in+multidrug+resistance.">The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance.</a> Drug Resist. Updat. 15 (1-2), 39-49 (2012).</li><li>Rubin, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Only+in+congenial+soil:+the+microenvironment+in+brain+tumorigenesis.">Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis.</a> Brain Pathol. 19 (1), 144-149 (2009).</li><li>Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+glioma+migration.">Microglia promote glioma migration.</a> Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).</li><li>Le, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploitation+of+astrocytes+by+glioma+cells+to+facilitate+invasiveness:+a+mechanism+involving+matrix+metalloproteinase-2+and+the+urokinase-type+plasminogen+activator-plasmin+cascade.">Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade.</a> J. Neurosci. 23 (10), 4034-4043 (2003).</li><li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+microglia/macrophages+enhance+the+invasion+of+glioma+stem-like+cells+via+TGF-&#946;1+signaling+pathway.">Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-&#946;1 signaling pathway.</a> J. Immunol. 189, 444-453 (2012).</li><li>Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+the+Cellular+Microenvironment+of+Glioblastoma+to+Develop+Predictive+Statistical+Models+of+Overall+Survival.">Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. , (2016).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Image+Analysis+of+Cellular+Heterogeneity+in+Breast+Tumors+Complements+Genomic+Profiling.">Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling.</a> Sci. Transl. Med. 4 (157), (2012).</li><li>Yi, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Obstructive+Intimal+Lesions+and+Their+Cellular+Phenotypes+in+Chronic+Pulmonary+Hypertension.">Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162 (4), 1577-1586 (2000).</li><li>Turcan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDH1+mutation+is+sufficient+to+establish+the+glioma+hypermethylator+phenotype.">IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype.</a> Nature. 483 (7390), 479-483 (2012).</li><li>Songtao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IDH+mutations+predict+longer+survival+and+response+to+temozolomide+in+secondary+glioblastoma.">IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma.</a> Cancer Sci. 103 (2), 269-273 (2012).</li><li>Shinojima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+Value+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+in+Patients+with+Glioblastoma+Multiforme.">Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme.</a> Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).</li><li>Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+inhibition+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+high-grade+gliomas:+where+do+we+stand?.">Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand?.</a> Mol. Cancer Res. 7 (7), 1000-1012 (2009).</li><li>Badie, B., Schartner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+microglia+in+glioma+biology.">Role of microglia in glioma biology.</a> Microsc. Res. Tech. 54 (2), 106-113 (2001).</li><li>Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+function+in+brain+tumors.">Microglia function in brain tumors.</a> J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).</li><li>Alves, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+cells:+A+heterogeneous+and+fatal+tumor+interacting+with+the+parenchyma.">Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma.</a> Life Sci. 89 (15), 532-539 (2011).</li><li>Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microglia+and+macrophages+in+glioma+maintenance+and+progression.">The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression.</a> Nat. Neurosci. 19 (1), 20-27 (2015).</li><li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/macrophages+promote+glioma+progression.">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59 (3), 472-485 (2011).</li><li>Placone, A. L., Qui&#241;ones-Hinojosa, A., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+astrocytes+in+the+progression+of+brain+cancer:+complicating+the+picture+of+the+tumor+microenvironment.">The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment.</a> Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).</li><li>Rath, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+Enhance+the+Invasion+Potential+of+Glioblastoma+Stem-Like+Cells.">Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells.</a> PLoS One. 8 (1), e54752 (2013).</li></ol>

Burada önerilen yöntemimiz, geleneksel kromojenik immünhistokimyayla boyanan histolojik örneklerin analizinde niceliksel bir yaklaşımdır. Bu tür analizler için güncel metodoloji, bağımsız patologlar tarafından derecelendirilen benzer boyama protokollerini içerir. Bu yöntem güvenilir olmuştur, ancak birçok uygulama için, tümör ile ilişkili heterojenliği daha iyi anlamak ve in vitro çalışmalar için tümörlerin doğru yeniden özetlenmesi gibi, hücresel makyajın daha kesin bir şekilde anlaş...

En yaygın ve malign beyin kanseri olan Glioblastoma (GBM), birincil tümör hacminden çevreleyen sağlıklı beyin parankimine 1 , 2 oranlarında dağılmış istila ile karakterizedir. Bu dağınık istila, tümörün tamamen kesilmesini zorlaştırır ve tedaviden sonra kalan istilacı kanser hücreleri, kaçınılmaz nüksetmenin en yaygın nedenidir 2 , 3 , 4 . Daha önce, diffüz glioma hücre invazyonunu inhibe ederek terapötik açıdan faydalı 5 bulduk, ancak GBM istilasına katkıda bulunan kompleks mekanizmalar hakkında çok az şey biliniyordu. Tümör mikro ortamı veya kanseri çevreleyen doku, çoklu kanserlerde tümörlerin ilerlemesinde rol oynadı 6 , 7 . Glioblastoma tümör mikro ortamı, pEkstraselüler matriks, çözünür faktörler ve biyofiziksel faktörlerin yanı sıra, astrositler, mikroglia ve oligodendrositler gibi çok sayıda glial hücrenin oluşturduğu benzersiz bir şekilde karmaşıktır. Deneysel olarak, astrositler ve mikrogliaların glioma progresyonunu ve istilasını 8 , 9 , 10 arttırdığı gösterilmiştir, ancak doğal insan beyninin mikro ortamındaki tüm glial hücrelerin kompozisyonu bilinmemektedir. Daha önce, mikro çevre bileşenleri, glioblastoma mikro ortamının hücresel bileşenlerini nicel olarak analiz ederek ve analizlerimizi orantısal bir tehlike modeli 11 içine dahil ederek, hastanın hayatta kalmasını öngörebildiğini gösterdi. Burada, glioblastoma hastasından tümör rezeksiyonlarının tümör hacmi ve komşu bölgelerindeki glial hücrelerin popülasyonlarının tanımlanması için nicel analiz metodunu açıklıyoruzs. Glial hücre popülasyonlarını tanımlamak için kromojenik immünohistokimya ve her glial popülasyon için boyamanın yüzde kapsama oranını analiz etmek için ImageJ kullanılmıştır. Kapsam yüzdesinin değerlendirilmesi, özellikle kanser hücreleriyle etkileşimlerden etkilenen hücrelerin morfolojik farklılıklarını belirlemek için basit bir ölçüm oluşturur. Histopatolojik boyamanın nicelleştirilmesi için yapılan önceki çalışmalar, hematoksilin ve eozin 12 veya Masson&#39;s trikrom 13 gibi standart boyayı antikor esaslı immünhistokimyasal boyanmanın özgüllüğünden yararlanmayan boyayı kullanır. Metodumuz, kompleks glioblastoma mikro ortamını aydınlatmak için kullanmayı düşündüğümüz, glioblastoma hasta tümör rezeksiyonlarında glial popülasyonları doğrudan ölçmek için geliştirilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3P</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>High pH antigen unmasking solution</td><td>Vector Labs</td><td>H-3301</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Amresco</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-ALDH1L1&amp;nbsp;</td><td>abcam&amp;nbsp;</td><td>ab56777</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Iba1&amp;nbsp;</td><td>abcam&amp;nbsp;</td><td>ab5076</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1&amp;nbsp;</td><td>abcam&amp;nbsp;</td><td>ab53041</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS anti-goat</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit)</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7500</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB substrate</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin counterstain</td><td>ThermoScientific</td><td>72404</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice Mounting Media</td><td>Amresco</td><td>H157-475</td><td></td></tr><tr><td>Aperio Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Super HT PAP Pen</td><td>Research Products International</td><td>195506</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative immunohistochemistry of the cellular microenvironment in patient glioblastoma resections

Tümör mikro ortamındaki artan ilgiyle, ölümcül ve en invaziv beyin kanseri olan glioblastomun hasta örnekleri içindeki mikro çevre bileşenlerini spesifik olarak belirlemek için bir yöntem geliştirdik. Kantitatif yöntemler hastalıklı dokuları doğru bir biçimde tanımlamak için yararlı değildir, aynı zamanda potansiyel olarak daha doğru prognoz, teşhis ve doku mühendisliğindeki sistemlerin ve replasmanların geliştirilmesine katkıda bulunabilirler. Glioblastomada, mikroglia ve astrositler gibi glial hücreler, patoloğun derecelendirmesine dayalı zayıf prognoz ile bağımsız olarak ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, bu hücrelerin ve diğer glial hücre bileşenlerinin durumu nicel olarak iyi tanımlanmamıştır. Bu, bu glial hücreleri işaretleyen büyük süreçler nedeniyle zor olabilir. Dahası, histolojik analizlerin çoğu, genel doku örneğine veya yalnızca tümör hacmine odaklanır; zira bölgeleri esas alan kantifikasyonları tasvir ederÇok heterojen dokuda. Burada, glioblastoma hastalarından tümör rezeksiyonlarının tümör hacmi ve komşu bölgelerindeki glial hücrelerin popülasyonlarının tanımlanması ve nicel olarak analiz edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Hastanın tümör rezeksiyonlarında glial hücre popülasyonlarını ve ImageJ&#39;de kromojenik immünohistokimya kullandık ve her glial popülasyon için boyama yüzdesini analiz ettik. Bu tekniklerle, glioma tümör mikro ortamının bölgeleri boyunca glial hücreleri daha iyi tarif edebiliyoruz.

Bu analiz için, tümör rezeksiyonlarımızda iki bölgenin (esas olarak diffüz istilalı kanser hücreli sağlıklı dokudan oluşan primer tümör hacmi ve komşu bölgeler), hematoksilin ve eozin boyalı hastada nöropatologların işbirliği yaptığı tespit edildi ( Şekil 1A , 1B ) örnekleri. Her hasta örneği içinde, astrositler ( Şekil 1C ), mikroglia ( Şekil 1D ) ve...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections at JoVE.com

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Hasta Glioblastoma Rezeksiyonlarında Hücresel Mikro Çevrenin Kantitatif İmmünohistokimyası

Bu protokol, kromojenik immünhistokimya ve ImageJ kullanılarak glioblastoma hasta rezeksiyonlarında tümör mikro çevre bileşenlerini nicel olarak tanımlamak için geliştirildi.

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

quantitative-immunohistochemistry-cellular-microenvironment-patient

Research

JoVE Journal

Medicine

9.6K Görüntüleme.  University of Virginia.  Bu protokol, kromojenik immünhistokimya ve ImageJ kullanılarak glioblastoma hasta rezeksiyonlarında tümör mikro çevre bileşenlerini nicel olarak tanımlamak için geliştirildi. 

Video: Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased understanding of the molecular events that give rise to glioblastomas, this cancer still remains highly refractory to conventional treatment. Surgical resection of high grade brain tumors is rarely complete due to the highly infiltrative nature of glioblastoma cells. Therapeutic approaches which attenuate glioblastoma cell invasion therefore is an attractive option. Our laboratory and others have shown that tumor associated macrophages and microglia (resident brain macrophages) strongly stimulate glioblastoma invasion. The protocol described in this paper is used to model glioblastoma-macrophage/microglia interaction using in vitro culture assays. This approach can greatly facilitate the development and/or discovery of drugs that disrupt the communication with the macrophages that enables this malignant behavior. We have established two robust coculture invasion assays where microglia/macrophages stimulate glioma cell invasion by 5 - 10 fold. Glioblastoma cells labelled with a fluorescent marker or constitutively expressing a fluorescent protein are plated without and with macrophages/microglia on matrix-coated polycarbonate chamber inserts or embedded in a three dimensional matrix. Cell invasion is assessed by using fluorescent microscopy to image and count only invasive cells on the underside of the filter. Using these assays, several pharmacological inhibitors (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib, and Semapimod), have been identified which block macrophage/microglia stimulated glioblastoma invasion.

Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Kanser Araştırmaları

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for immunotherapies. Recent clinical advances in immunotherapy highlight the need for reproducible methods to accurately and thoroughly characterize the tumor and its associated immune infiltrate. Tumor enzymatic digestion and flow cytometric analysis allow broad characterization of numerous immune cell subsets and phenotypes; however, depth of analysis is often limited by fluorophore restrictions on panel design and the need to acquire large tumor samples to observe rare immune populations of interest. Thus, we have developed an effective and high throughput method for separating and enriching the tumor immune infiltrate from the non-immune tumor components. The described tumor digestion and centrifugal density-based separation technique allows separate characterization of tumor and tumor immune infiltrate fractions and preserves cellular viability, and thus, provides a broad characterization of the tumor immunologic state. This method was used to characterize the extensive spatial immune heterogeneity in solid tumors, which further demonstrates the need for consistent whole tumor immunologic profiling techniques. Overall, this method provides an effective and adaptable technique for the immunologic characterization of subcutaneous solid murine tumors; as such, this tool can be used to better characterize the tumoral immunologic features and in the preclinical evaluation of novel immunotherapeutic strategies.

Here we describe a method to separate and enrich components of the tumor immune and non-immune microenvironment in established subcutaneous tumors. This technique allows for the separate analysis of tumor immune infiltrate and non-immune tumor fractions which can permit comprehensive characterization of the tumor immune microenvironment.

Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as biomarkers with applications in diagnosis, prognosis, classification, state of tumor progression, and cell differentiation state. These analyses of biomarkers are also useful to characterize tumor neurospheres (NS) generated from glioma patients and glioma models. Tumor NS provide a valuable in vitro model to assess different features of the tumor from which they are derived and can more accurately mirror glioma biology. Here we describe a detailed method to analyze biomarkers in tumor NS using immunohistochemistry (IHC) on paraffin-embedded tumor NS.

Neurospheres grown as 3D cultures constitute a powerful tool to study glioma biology. Here we present a protocol to perform immunohistochemistry while maintaining the 3D structure of glioma neurospheres through paraffin embedding. This method enables the characterization of glioma neurosphere properties such as stemness and neural differentiation.

Biyolojik gliyom immünhistokimya parafin gömülü 3D tümörü Neurosphere kültürü üzerinde tarafından değerlendirilmesi

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell cultures that preserve the genomic profile of the parental tumors, for use in patient specific in vitro and in vivo models, has the potential to revolutionize the preclinical development of new treatments for glioblastoma tailored to the molecular characteristics of each tumor.
Starting with fresh high grade astrocytoma tumors dissociated into single cells, we use the neurosphere assay as an enrichment method for cells presenting cancer stem cell phenotype, including expression of neural stem cell markers, long term self-renewal in vitro, and the ability to form orthotopic xenograft tumors. This method has been previously proposed, and is now in use by several investigators. Based on our experience of dissociating and culturing 125 glioblastoma specimens, we arrived at the detailed protocol we present here, suitable for routine neurosphere culturing of high grade astrocytomas and large scale expansion of tumorigenic cells for preclinical studies. We report on the efficiency of successful long term cultures using this protocol&#160;and suggest affordable alternatives for culturing dissociated glioblastoma cells that fail to grow as neurospheres. We also describe in detail a protocol for preserving the neurospheres 3D architecture for immunohistochemistry. Cell cultures enriched in CSCs, capable of generating orthotopic xenograft models that preserve the molecular signatures and heterogeneity of GBMs, are becoming increasingly popular for the study of the biology of GBMs and for the improved design of preclinical testing of potential therapies.

Protocol for propagation of dissociated high grade glioma surgical specimens in serum-free neurosphere medium to select for cells with cancer stem cell phenotype. For specimens that fail to grow as neurospheres, an alternative protocol is suggested. A paraffin embedding technique for maintaining the 3D neurosphere architecture for immunocytochemistry is described.

Klinik Olarak İlgili Hayvan Modellerinde ve 3D İmmün entrikalarda Kullanılmak Üzere Cerrahi Örneklerden Yüksek Dereceli Glioma Hücre Kültürünün Optimizasyonu

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

Tıp

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically complex tumors, with a high degree of proteomic variability across both the tumor itself and its heterogenous microenvironment. The malignant potential of these tumors is enhanced by the dysregulation of proteins involved in several key pathways, including processes that maintain cellular stability and preserve the structural integrity of the microenvironment. Although there have been numerous bulk and single-cell glioma analyses, there is a relative paucity of spatial stratification of these proteomic data. Understanding differences in spatial distribution of tumorigenic factors and immune cell populations between the intrinsic tumor, invasive edge, and microenvironment offers valuable insight into the mechanisms underlying tumor proliferation and propagation. Digital spatial profiling (DSP) represents a powerful technology that can form the foundation for these important multilayer analyses.
DSP is a method that efficiently quantifies protein expression within user-specified spatial regions in a tissue specimen. DSP is ideal for studying the differential expression of multiple proteins within and across regions of distinction, enabling multiple levels of quantitative and qualitative analysis. The DSP protocol is systematic and user-friendly, allowing for customized spatial analysis of proteomic data. In this experiment, tissue microarrays are constructed from archived glioblastoma core biopsies. Next, a panel of antibodies is selected, targeting proteins of interest within the sample. The antibodies, which are preconjugated to UV-photocleavable DNA oligonucleotides, are then incubated with the tissue sample overnight. Under fluorescence microscopy visualization of the antibodies, regions of interest (ROIs) within which to quantify protein expression are defined with the samples. UV light is then directed at each ROI, cleaving the DNA oligonucleotides. The oligonucleotides are microaspirated and counted within each ROI, quantifying the corresponding protein on a spatial basis.

Proteomic dysregulation plays an important role in the spread of diffusely infiltrating gliomas, but several relevant proteins remain unidentified. Digital spatial processing (DSP) offers an efficient, high-throughput approach for characterizing the differential expression of candidate proteins that may contribute to the invasion and migration of infiltrative gliomas.

Yetişkin Tipi Yaygın Olarak Sızan Gliomada Mikroçevrenin Karakterizasyonu için Dijital Uzamsal Profilleme

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

Tümör Mikroçevresinin Multipleks İmmünofloresan ve Mekansal Görüntü Analizi

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending on its composition and the interactions between cancer cells and peri-tumoral cells, the TME may affect cancer progression. The characterization of tumors and their complex microenvironment could improve the understanding of cancer diseases and may help scientists and clinicians to discover new biomarkers.
We recently developed several multiplex immunofluorescence (mIF) panels based on tyramide signal amplification (TSA) for the characterization of the TME in colorectal cancer, head and neck squamous cell carcinoma, melanoma, and lung cancer. Once the staining and scanning of the corresponding panels are completed, the samples are analyzed on an image analysis software. The spatial position and the staining of each cell are then exported from this quantification software into R. We developed R scripts that allow us not only to analyze the density of each cell type in several tumor compartments (e.g. the center of the tumor, the margin of the tumor, and the stroma) but also to perform distance-based analyses between different cell types.
This particular workflow adds a spatial dimension to the classical density analysis already routinely performed for several markers. mIF analysis could allow scientists to have a better understanding of the complex interaction between cancer cells and the TME and to discover new predictive biomarkers of response to treatments, such as immune checkpoint inhibitors, and targeted therapies.

Yazar Spot Işığı: Tümör Mikroçevresinin Klinik ve Biyolojik Değerlendirmesi için Mekansal Görüntü Analizi ile Birleştirilmiş Multipleks İmmünofloresan  

In this article, a protocol for manual tyramide signal amplification (TSA) multiplex immunofluorescence (mIF) combined with image analysis and spatial analysis is described. This protocol can be used with formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) sections for the staining of two to six antigens per slide depending on the slide scanner available in the laboratory.

Multipleks İmmünofloresan, Tümör Mikroçevresinin Klinik ve Biyolojik Değerlendirmesi için Uzamsal Görüntü Analizi ile Kombine Edildi

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

Orthotopic insan Glioblastoma Multiforme Xenografts fare modelleri sitotoksik bağışıklık hücrelerinin stereotaksik evlat edinen Transfer

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

Hasta Glioblastoma Rezeksiyonlarında Hücresel Mikro Çevrenin Kantitatif İmmünohistokimyası

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu

Biyolojik gliyom immünhistokimya parafin gömülü 3D tümörü Neurosphere kültürü üzerinde tarafından değerlendirilmesi

Klinik Olarak İlgili Hayvan Modellerinde ve 3D İmmün entrikalarda Kullanılmak Üzere Cerrahi Örneklerden Yüksek Dereceli Glioma Hücre Kültürünün Optimizasyonu

Yetişkin Tipi Yaygın Olarak Sızan Gliomada Mikroçevrenin Karakterizasyonu için Dijital Uzamsal Profilleme

Multipleks İmmünofloresan, Tümör Mikroçevresinin Klinik ve Biyolojik Değerlendirmesi için Uzamsal Görüntü Analizi ile Kombine Edildi

Multipleks İmmünofloresan, Tümör Mikroçevresinin Klinik ve Biyolojik Değerlendirmesi için Uzamsal Görüntü Analizi ile Kombine Edildi

Multipleks İmmünofloresan, Tümör Mikroçevresinin Klinik ve Biyolojik Değerlendirmesi için Uzamsal Görüntü Analizi ile Kombine Edildi

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Orthotopic insan Glioblastoma Multiforme Xenografts fare modelleri sitotoksik bağışıklık hücrelerinin stereotaksik evlat edinen Transfer