Name: quantitative immunohistochemistry of the cellular microenvironment in patient glioblastoma resections
Uploaded: 2017-07-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
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Die Autoren danken Drs. Fahad Bafakih und Jim Mandell für die Erfassung und Identifizierung von Patientenproben, Garrett F. Beeghly für die Unterstützung der Immunhistochemie sowie die Biorepository und Tissue Research Facility, das Herz-Kreislauf-Forschungszentrum Histology Core und die Biomolekulare Analyse-Fazilität an der University of Virginia für die Unterstützung mit Probenerfassung, Immunhistochemie und Bildgebung.

Dieses Protokoll identifiziert zelluläre Komponenten in Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Proben, wie es für klinische Patientenproben typisch ist. Paraffin Einbettung ermöglicht die beste Aufrechterhaltung der Zell-und Gewebe-Morphologie sowie eine bessere Langlebigkeit der Abschnitte. Die Proben für diese Analyse wurden durch die University of Virginia Biorepository und Tissue Research Facility zugegriffen. Patientenproben wurden von einem Neuropathologen ausgewählt, der auf einer endgültigen Diagnose des Glioblastoms (Astrozytom, WHO-Grad IV) basierte, der zwischen 2010 und 2013 an der Universität von Virginia Tumorresektionen abgeschlossen hatte und vor dieser Analyse entdeckt wurde 11 . 1. FFPE-Probenentparaffinierung und Rehydratation HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls ist spezifisch für FFPE-Proben. Während Paraffin-eingebettete Proben für diese Analyse aufgrund der Konservierung von zellulären und t nützlicher sein könnenIssue Morphologie, diese Analyse kann auch mit eingefrorenen Abschnitten durchgeführt werden. Bei Verwendung von gefrorenen Abschnitten kann dieser Teil weggelassen werden und gehen direkt zur chromogenen Immunhistochemie über. <ol><li> Führen Sie die folgenden Waschungen für jeweils 5 min aus: Xylol, Xylol, 100% Ethanol, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol, entionisiertes Wasser, entionisiertes Wasser </li></ol> 2. Antigen Retrieval HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls ist notwendig, um die bei der Formalin-Fixierung von FFPE-Proben gebildeten Methylenbrücken zu brechen und Antigen-Stellen für Antikörper zu binden. <ol><li> Verdünnen Sie die Tris-basierte Hoch-pH-Antigen-Entmaskungslösung bei der Herstellerempfehlung in destilliertem Wasser. </li><li> Führen Sie eine wärmevermittelte Antigen-Retrieval mit einer Mikrowelle durch. Andere Formen der wärmevermittelten Retrieval (wie Dampfkochtopf, Gemüsedampfer oder kochendes Wasser) würden ebenfalls ausreichen. <ol><li> Die verdünnte Entlüftungslösung in eine nicht versiegelte mikrowellengeeignete gebenSchiff. Legen Sie die Schienen in das Gefäß. Legen Sie Dias in Mikrowelle. </li><li> Kochen für 20 min bei hoher Leistung. Überwachen Sie die Flüssigkeitsspiegel für die Verdunstung und füllen Sie mit destilliertem Wasser nach Bedarf. </li></ol></li><li> Proben in 1 Stunde bei Raumtemperatur abkühlen lassen. </li></ol> 3. Chromogene Immunhistochemie <ol><li> Umrisse Gewebeprobe mit einem hydrophoben Stift, um das Volumen der Reagenzien zu minimieren, die notwendig sind, um die Probe zu bedecken. HINWEIS: Seien Sie sicher, dass die Gewebeproben hydratisiert werden und lassen Sie sie nicht austrocknen, da dies die Verfärbungswirkung beeinträchtigen wird. </li><li> Pipet genug Permeabilisierungslösung (Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) + 0,01% Triton-X) zur Deckung der Gewebeprobe (typischerweise etwa 100 - 200 μl). </li><li> Entfernen und verwerfen Sie die Lösung und wiederholen Sie Schritt 3.2. </li><li> Inkubieren von Proben bei Raumtemperatur mit Blockierungslösung (2,5% Pferdeserum + Permeabilisierungslösung). </li><li> Inkubieren Sie Proben über Nacht in 4 ºC mit primären Antikörpern verdünntIn Blockierlösung HINWEIS: Alle hier verwendeten Primärantikörper werden bei 1: 200 verdünnt, aber optimale Verdünnungen können mit seriellen Verdünnungen beginnend mit Herstellerempfehlung bestimmt werden. Detaillierte Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Antikörpern wurden zuvor veröffentlicht 11 . </li><li> Detektion von primären Antikörpern unter Verwendung eines Meerrettich-Peroxidase-Polymerreagenzes, das dem primären Antikörper-Wirtstier entspricht, nach dem Herstellerprotokoll. </li><li> Pipet genug Permeabilisierungslösung zur Deckung der Gewebeprobe und inkubieren für 5 min. </li><li> Entfernen und entwerfen Lösung und wiederholen Sie Schritt 3.7. </li><li> Inkubieren von Objektträgern in 0,3% H 2 O 2 in 1x TBS für 15 min. </li><li> Entwickeln Sie Proben mit einem Peroxidase-Diaminobenzidin (DAB) -Substrat für 2 - 10 min, bis die gewünschte Fleckenintensität erreicht ist. </li><li> Gegenstichproben zur Identifizierung von Zellkernen, wie z. B. mit Hämatoxylin, nach Herstellerprotokoll. </li><li> Proben mit 100%Ethanol und Xylol. </li><li> Befestigen Sie die Proben dauerhaft mit dem Montagemedium. </li></ol> 4. Zinsanweisungen <ol><li> Bild-Dias unter Hellfeld-Mikroskopie in der Lage, hochauflösende Bilder. HINWEIS: Verwenden Sie bildgebende zellulare Komponenten mit einer Auflösung von mindestens 20x. </li><li> Bewegen Sie die Kamera zu bestimmten Regionen von Interesse in Gewebeproben. </li><li> Bilder als TIFF-Dateien zur Quantifizierung speichern </li></ol> 5. Bildanalyse <ol><li> Öffnen Sie Bilder in ImageJ für die Quantifizierung der prozentualen Abdeckung. </li><li> Verwenden Sie das Threshold Color Plugin, um die lila Farbe von Hämatoxylin-gefärbten Kernen zu entfernen. </li><li> Bild in 8-Bit umwandeln. </li><li> Schwellenwert ohne dunklen Hintergrund hinzufügen. </li><li> Prozessbild unter Verwendung eines der 17 vorgespannten ImageJ-Schwellenfilter ( dh MaxEntropy), so dass nur DAB-gefärbte Teile in der Schwelle enthalten sind. HINWEIS: Wählen Sie den optimierten vorgespannten Schwellenfilter, der minimiertEs Einbeziehung der Hintergrundfärbung. Dies kann von der Qualität der Färbung und Spezifität des Antikörpers abhängen. Verwenden Sie die gleiche Schwelle für alle technischen Replikate innerhalb jeder Patientenprobe. </li><li> Schwellenwert anwenden </li><li> Messen Sie den prozentualen Bereich des Schwellenwertes. </li><li> Durchschnittliche prozentuale Flächendeckung für mehrere Regionen innerhalb jeder Probe. </li></ol>

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Unsere hier vorgeschlagene Methode ist ein quantitativer Ansatz zur Analyse von histologischen Proben, die mit der traditionellen chromogenen Immunhistochemie gefärbt wurden. Die aktuelle Methodik für diese Art von Analyse umfasst ähnliche Färbeprotokolle, gefolgt von der Einstufung durch unabhängige Pathologen. Diese Methode ist zuverlässig, aber für eine Reihe von Anwendungen ist ein präziseres Verständnis der zellulären Make-up erforderlich, wie ein besseres Verständnis der Heterogenität im Zusammenhang m...

Glioblastom (GBM), der häufigste und bösartige Hirntumor, zeichnet sich durch eine stark diffuse Invasion aus der primären Tumormasse in das umgebende gesunde Gehirnparenchym 1 , 2 aus . Diese diffuse Invasion macht den Tumor besonders schwierig, vollständig zu resezieren, und die eindringenden Krebszellen, die nach der Therapie bleiben, ist der häufigste Grund für unvermeidliches Rezidiv 2 , 3 , 4 . Bisher fanden wir die diffuse Gliom Zellinvasion Hemmung therapeutisch vorteilhaft 5, wird jedoch wenig über die komplexen Mechanismen bekannt ist GBM Invasion beitragen. Die Tumor-Mikroumgebung oder das Gewebe, das den Krebs umgibt, wurde in die Progression von Tumoren in mehreren Krebsarten 6 , 7 verwickelt. Die Glioblastom-Tumor-Mikroumgebung, in pArtikulär, ist relativ unter- charakterisiert und ist eindeutig komplex und komponiert mehrere Gliazellen wie Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten sowie extrazelluläre Matrix, lösliche Faktoren und biophysikalische Faktoren. Experimentell wurde gezeigt, dass Astrozyten und Mikroglia die Gliomprogression und Invasion 8 , 9 , 10 erhöhen, aber die Zusammensetzung aller Gliazellen in der nativen menschlichen Gehirnmikroumgebung ist unbekannt. Wir haben zuvor gezeigt, dass mikroumweltliche Komponenten das Überleben des Patienten durch quantitative Analyse der zellulären Komponenten der Glioblastom-Mikroumgebung vorhersagen und unsere Analysen in ein proportionales Gefahrenmodell 11 einbinden können. Hier beschreiben wir die quantitative Analyse Methode zur Identifizierung der Populationen von Gliazellen innerhalb der Tumor-Masse und angrenzenden Regionen der Tumor-Resektionen von Glioblastom-PatientenS. Wir verwendeten die chromogene Immunhistochemie, um die Gliazellpopulationen und ImageJ zu identifizieren, um die prozentuale Abdeckung der Färbung für jede Gliapopulation zu analysieren. Die Beurteilung der prozentualen Abdeckung schafft eine einfache Messung zur Bestimmung der morphologischen Unterschiede der Zellen, insbesondere derjenigen, die durch Wechselwirkungen mit Krebszellen betroffen sind. Frühere Studien zur Quantifizierung der histopathologischen Färbung verwenden Standardfärbung wie Hämatoxylin und Eosin 12 oder Masson&#39;s Trichrom 13 , die nicht die Spezifität der Antikörper-basierten Immunhistochemie-Färbung nutzen. Unsere Methode wurde entwickelt, um die Gliapopulationen innerhalb der Glioblastom-Patienten-Tumor-Resektionen direkt zu quantifizieren, die wir zur Aufklärung der komplexen Glioblastom-Mikroumgebung anstreben.

<table><tbody><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3P</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>High pH antigen unmasking solution</td><td>Vector Labs</td><td>H-3301</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Amresco</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-ALDH1L1&amp;nbsp;</td><td>abcam&amp;nbsp;</td><td>ab56777</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Iba1&amp;nbsp;</td><td>abcam&amp;nbsp;</td><td>ab5076</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1&amp;nbsp;</td><td>abcam&amp;nbsp;</td><td>ab53041</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS anti-goat</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit)</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7500</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB substrate</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin counterstain</td><td>ThermoScientific</td><td>72404</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice Mounting Media</td><td>Amresco</td><td>H157-475</td><td></td></tr><tr><td>Aperio Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Scanscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Super HT PAP Pen</td><td>Research Products International</td><td>195506</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative immunohistochemistry of the cellular microenvironment in patient glioblastoma resections

Mit dem wachsenden Interesse an der Tumor-Mikroumgebung haben wir uns bemüht, eine Methode zur spezifischen Bestimmung der Mikroumgebungskomponenten innerhalb von Patientenproben von Glioblastom, dem tödlichsten und am meisten invasiven Hirntumor, zu entwickeln. Es sind nicht nur quantitative Methoden, die für die genaue Beschreibung von erkrankten Geweben von Vorteil sind, sondern auch potenziell zu einer genaueren Prognose, Diagnose und Entwicklung von gewebetechnischen Systemen und Ersetzungen beitragen. Im Glioblastom wurden Gliazellen, wie Mikroglia und Astrozyten, unabhängig mit einer schlechten Prognose auf der Grundlage der Pathologieabstufung korreliert. Der Zustand dieser Zellen und anderer Gliazellenkomponenten ist jedoch nicht quantitativ gut beschrieben worden. Dies kann aufgrund der großen Prozesse, die diese Gliazellen markieren, schwierig sein. Darüber hinaus konzentrieren sich die meisten histologischen Analysen auf die gesamte Gewebeprobe oder nur innerhalb der Masse des Tumors, im Gegensatz zu der Abgrenzung von Quantifizierungen, die auf Regionen basierenHin das sehr heterogene Gewebe. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung und quantitativen Analyse der Populationen von Gliazellen innerhalb der Tumormasse und angrenzenden Regionen der Tumorresektionen von Glioblastompatienten. Wir verwendeten die chromogene Immunhistochemie, um die Gliazellpopulationen bei Patienten-Tumor-Resektionen und ImageJ zu identifizieren, um die prozentuale Abdeckung der Färbung für jede Glia-Population zu analysieren. Mit diesen Techniken sind wir in der Lage, die Gliazellen in allen Regionen der Gliom-Tumor-Mikroumgebung besser zu beschreiben.

Für diese Analyse wurden zwei Interessenbereiche innerhalb unserer Tumorresektionen - die primäre Tumormasse und die angrenzenden Regionen, die in erster Linie aus gesundem Gewebe mit diffus eindringenden Krebszellen zusammengesetzt waren ( Abbildung 1A , 1B ) - durch die Zusammenarbeit von Neuropathologen an Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Patienten identifiziert Proben. Innerhalb jeder Patientenprobe wurde eine positive Färbung für ...

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Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Quantitative Immunhistochemie der zellulären Mikroumgebung bei Patienten-Glioblastom-Resektionen

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Tumor-Mikroumgebungs-Komponenten in Glioblastom-Patienten-Resektionen mit chromogener Immunhistochemie und ImageJ quantitativ zu identifizieren.

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

quantitative-immunohistochemistry-cellular-microenvironment-patient

Research

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Medicine

9.6K Aufrufe.  University of Virginia.  Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Tumor-Mikroumgebungs-Komponenten in Glioblastom-Patienten-Resektionen mit chromogener Immunhistochemie und ImageJ quantitativ zu identifizieren. 

Serie: Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased understanding of the molecular events that give rise to glioblastomas, this cancer still remains highly refractory to conventional treatment. Surgical resection of high grade brain tumors is rarely complete due to the highly infiltrative nature of glioblastoma cells. Therapeutic approaches which attenuate glioblastoma cell invasion therefore is an attractive option. Our laboratory and others have shown that tumor associated macrophages and microglia (resident brain macrophages) strongly stimulate glioblastoma invasion. The protocol described in this paper is used to model glioblastoma-macrophage/microglia interaction using in vitro culture assays. This approach can greatly facilitate the development and/or discovery of drugs that disrupt the communication with the macrophages that enables this malignant behavior. We have established two robust coculture invasion assays where microglia/macrophages stimulate glioma cell invasion by 5 - 10 fold. Glioblastoma cells labelled with a fluorescent marker or constitutively expressing a fluorescent protein are plated without and with macrophages/microglia on matrix-coated polycarbonate chamber inserts or embedded in a three dimensional matrix. Cell invasion is assessed by using fluorescent microscopy to image and count only invasive cells on the underside of the filter. Using these assays, several pharmacological inhibitors (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib, and Semapimod), have been identified which block macrophage/microglia stimulated glioblastoma invasion.

Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.

Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Forschung

Krebsforschung

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for immunotherapies. Recent clinical advances in immunotherapy highlight the need for reproducible methods to accurately and thoroughly characterize the tumor and its associated immune infiltrate. Tumor enzymatic digestion and flow cytometric analysis allow broad characterization of numerous immune cell subsets and phenotypes; however, depth of analysis is often limited by fluorophore restrictions on panel design and the need to acquire large tumor samples to observe rare immune populations of interest. Thus, we have developed an effective and high throughput method for separating and enriching the tumor immune infiltrate from the non-immune tumor components. The described tumor digestion and centrifugal density-based separation technique allows separate characterization of tumor and tumor immune infiltrate fractions and preserves cellular viability, and thus, provides a broad characterization of the tumor immunologic state. This method was used to characterize the extensive spatial immune heterogeneity in solid tumors, which further demonstrates the need for consistent whole tumor immunologic profiling techniques. Overall, this method provides an effective and adaptable technique for the immunologic characterization of subcutaneous solid murine tumors; as such, this tool can be used to better characterize the tumoral immunologic features and in the preclinical evaluation of novel immunotherapeutic strategies.

Here we describe a method to separate and enrich components of the tumor immune and non-immune microenvironment in established subcutaneous tumors. This technique allows for the separate analysis of tumor immune infiltrate and non-immune tumor fractions which can permit comprehensive characterization of the tumor immune microenvironment.

Bereicherung und Charakterisierung von dem Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebungen in etablierte subkutane murinen Tumoren

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as biomarkers with applications in diagnosis, prognosis, classification, state of tumor progression, and cell differentiation state. These analyses of biomarkers are also useful to characterize tumor neurospheres (NS) generated from glioma patients and glioma models. Tumor NS provide a valuable in vitro model to assess different features of the tumor from which they are derived and can more accurately mirror glioma biology. Here we describe a detailed method to analyze biomarkers in tumor NS using immunohistochemistry (IHC) on paraffin-embedded tumor NS.

Neurospheres grown as 3D cultures constitute a powerful tool to study glioma biology. Here we present a protocol to perform immunohistochemistry while maintaining the 3D structure of glioma neurospheres through paraffin embedding. This method enables the characterization of glioma neurosphere properties such as stemness and neural differentiation.

Bewertung von Biomarkern in Gliom von Immunohistochemistry auf Paraffin-eingebetteten 3D Gliom Neurosphäre Kulturen

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell cultures that preserve the genomic profile of the parental tumors, for use in patient specific in vitro and in vivo models, has the potential to revolutionize the preclinical development of new treatments for glioblastoma tailored to the molecular characteristics of each tumor.
Starting with fresh high grade astrocytoma tumors dissociated into single cells, we use the neurosphere assay as an enrichment method for cells presenting cancer stem cell phenotype, including expression of neural stem cell markers, long term self-renewal in vitro, and the ability to form orthotopic xenograft tumors. This method has been previously proposed, and is now in use by several investigators. Based on our experience of dissociating and culturing 125 glioblastoma specimens, we arrived at the detailed protocol we present here, suitable for routine neurosphere culturing of high grade astrocytomas and large scale expansion of tumorigenic cells for preclinical studies. We report on the efficiency of successful long term cultures using this protocol&#160;and suggest affordable alternatives for culturing dissociated glioblastoma cells that fail to grow as neurospheres. We also describe in detail a protocol for preserving the neurospheres 3D architecture for immunohistochemistry. Cell cultures enriched in CSCs, capable of generating orthotopic xenograft models that preserve the molecular signatures and heterogeneity of GBMs, are becoming increasingly popular for the study of the biology of GBMs and for the improved design of preclinical testing of potential therapies.

Protocol for propagation of dissociated high grade glioma surgical specimens in serum-free neurosphere medium to select for cells with cancer stem cell phenotype. For specimens that fail to grow as neurospheres, an alternative protocol is suggested. A paraffin embedding technique for maintaining the 3D neurosphere architecture for immunocytochemistry is described.

Optimierung der hochwertigen Gliom-Zellkultur von chirurgischen Proben für den Einsatz in klinisch relevanten Tiermodellen und 3D-Immunchemie

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

Medizin

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically complex tumors, with a high degree of proteomic variability across both the tumor itself and its heterogenous microenvironment. The malignant potential of these tumors is enhanced by the dysregulation of proteins involved in several key pathways, including processes that maintain cellular stability and preserve the structural integrity of the microenvironment. Although there have been numerous bulk and single-cell glioma analyses, there is a relative paucity of spatial stratification of these proteomic data. Understanding differences in spatial distribution of tumorigenic factors and immune cell populations between the intrinsic tumor, invasive edge, and microenvironment offers valuable insight into the mechanisms underlying tumor proliferation and propagation. Digital spatial profiling (DSP) represents a powerful technology that can form the foundation for these important multilayer analyses.
DSP is a method that efficiently quantifies protein expression within user-specified spatial regions in a tissue specimen. DSP is ideal for studying the differential expression of multiple proteins within and across regions of distinction, enabling multiple levels of quantitative and qualitative analysis. The DSP protocol is systematic and user-friendly, allowing for customized spatial analysis of proteomic data. In this experiment, tissue microarrays are constructed from archived glioblastoma core biopsies. Next, a panel of antibodies is selected, targeting proteins of interest within the sample. The antibodies, which are preconjugated to UV-photocleavable DNA oligonucleotides, are then incubated with the tissue sample overnight. Under fluorescence microscopy visualization of the antibodies, regions of interest (ROIs) within which to quantify protein expression are defined with the samples. UV light is then directed at each ROI, cleaving the DNA oligonucleotides. The oligonucleotides are microaspirated and counted within each ROI, quantifying the corresponding protein on a spatial basis.

Proteomic dysregulation plays an important role in the spread of diffusely infiltrating gliomas, but several relevant proteins remain unidentified. Digital spatial processing (DSP) offers an efficient, high-throughput approach for characterizing the differential expression of candidate proteins that may contribute to the invasion and migration of infiltrative gliomas.

Digitales räumliches Profiling zur Charakterisierung der Mikroumgebung bei diffus infiltrierenden Gliomen im Erwachsenentyp

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

Multiplex-Immunfluoreszenz und räumliche Bildanalyse der Tumormikroumgebung

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending on its composition and the interactions between cancer cells and peri-tumoral cells, the TME may affect cancer progression. The characterization of tumors and their complex microenvironment could improve the understanding of cancer diseases and may help scientists and clinicians to discover new biomarkers.
We recently developed several multiplex immunofluorescence (mIF) panels based on tyramide signal amplification (TSA) for the characterization of the TME in colorectal cancer, head and neck squamous cell carcinoma, melanoma, and lung cancer. Once the staining and scanning of the corresponding panels are completed, the samples are analyzed on an image analysis software. The spatial position and the staining of each cell are then exported from this quantification software into R. We developed R scripts that allow us not only to analyze the density of each cell type in several tumor compartments (e.g. the center of the tumor, the margin of the tumor, and the stroma) but also to perform distance-based analyses between different cell types.
This particular workflow adds a spatial dimension to the classical density analysis already routinely performed for several markers. mIF analysis could allow scientists to have a better understanding of the complex interaction between cancer cells and the TME and to discover new predictive biomarkers of response to treatments, such as immune checkpoint inhibitors, and targeted therapies.

Autor im Rampenlicht: Multiplex-Immunfluoreszenz kombiniert mit räumlicher Bildanalyse zur klinischen und biologischen Beurteilung der Tumormikroumgebung  

In this article, a protocol for manual tyramide signal amplification (TSA) multiplex immunofluorescence (mIF) combined with image analysis and spatial analysis is described. This protocol can be used with formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) sections for the staining of two to six antigens per slide depending on the slide scanner available in the laboratory.

Multiplex-Immunfluoreszenz kombiniert mit räumlicher Bildanalyse zur klinischen und biologischen Beurteilung der Tumormikroumgebung

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Immunologie und Infektion

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

Quantitative Immunhistochemie der zellulären Mikroumgebung bei Patienten-Glioblastom-Resektionen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion

Bereicherung und Charakterisierung von dem Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebungen in etablierte subkutane murinen Tumoren

Bewertung von Biomarkern in Gliom von Immunohistochemistry auf Paraffin-eingebetteten 3D Gliom Neurosphäre Kulturen

Optimierung der hochwertigen Gliom-Zellkultur von chirurgischen Proben für den Einsatz in klinisch relevanten Tiermodellen und 3D-Immunchemie

Digitales räumliches Profiling zur Charakterisierung der Mikroumgebung bei diffus infiltrierenden Gliomen im Erwachsenentyp

Multiplex-Immunfluoreszenz kombiniert mit räumlicher Bildanalyse zur klinischen und biologischen Beurteilung der Tumormikroumgebung

Multiplex-Immunfluoreszenz kombiniert mit räumlicher Bildanalyse zur klinischen und biologischen Beurteilung der Tumormikroumgebung

Multiplex-Immunfluoreszenz kombiniert mit räumlicher Bildanalyse zur klinischen und biologischen Beurteilung der Tumormikroumgebung

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate