우리는 에리카 테일러가이 원고를 편집 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 부여는 건강의 국가 학회 (P01 HL098053, P01 AG033561 R01 HL054732) R.B., 박사 후 연구 보충 (R01 HL085481)와 친목 (AAUW)에서 S.B.D., 및 S.B.D.에는 미국 심장 협회에서 교부 금에 의해 투자 되었다 그리고 R.T.B.

1. 프로토콜을 먹이 HFD <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg" /> 표 1. 비행 음식 레시피. 
이 표에서 우리의 제어 음식을 준비 하는 데 사용 하는 다른 재료를 요약 합니다. 일단, 음식의 10 mL 작은 유리병에 부 어 냉각 이며, 장기 저장을 위한 4 ° C에 저장.
<ol><li>HFD 준비 <ol><li>높은 지방 식품의 1kg를 만들기 위해 미리 만든 정상 비행 음식의 700 g의 무게 (표 1 참조) 및 분석 균형을 사용 하 여 두 개의 별도 용기에 코코넛 오일의 300 g.</li>
		<li>는 내용을 완전히 용 해 될 때까지 각 컨테이너는 전자 레인지에서 개별적으로 열. 비행 음식 컨테이너에 코코넛 오일 붓으십시오. 기름은 비행 거리 음식으로 잘 혼합 때까지 털 다를 사용 하 여 저 어. 
		참고: 아무 음식이 나 기름 덩어리는 표시 되어야 합니다. 날 식품은 전자 레인지에 때, 음식을 혼합 끓는 방지를 1 분 간격으로 중지.</li>
		<li>다시 높은 지방 음식 무게. 총 중량 1kg (음식 + 코코넛 오일의 300 g 700 g) 미만의 경우 추가 물 (약 10ml) 난방 중 증발에 대 한 보상 하 고 다시을 무게 1 kg.</li>
		<li>부 어 잘 혼합된 약 10 mL 유리병 (유리병 볼륨의 약 25%) 당 높은 지방 음식. 다음으로, 투박한 파리를 방지 하기 위해 커버 &#39; 오염. 실 온에서 1 시간을 기다린 다음 4 주 스토리지에 대 한 4 ° C에 튜브까지 전송. 
		참고: 일반 음식 (NF) 제어 음식으로 사용 됩니다. 또한 유리병 당 NF의 10 mL (유리병 볼륨의 약 25%)를 붓는 다. HFD 음식에 대 한 NF의 30%를 코코넛 오일 바꿉니다. 제어 및 실험 조건, 파리 NF와 HFD (10 mL 유리병 당 음식의)의 동일한 금액을 부여 했다.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg" /> 그림 1 . 초파리 먹이 HFD. 
체계는 (와 코코넛 오일의 추가) 제어 식품 (코코넛 오일-NF의 추가 없이 일반 다이어트) 또는 HFD 파리에 대 한 다른 먹이 단계를 보여 줍니다. 전체 과정 초기 성인 파리 컬렉션 후 10 일 소요 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="2"> <li>HFD D. melanogaster의 먹이 참고:이 프로토콜 제어 음식과 HFD 먹이 어떤 비행 라인와 호환 되는 절차를 포함. 제어 및 실험 파리 같은 금액 음식 NF (HFD)를 포함 하는 튜브에 배치 됩니다.
	<ol><li>파리 anesthetize를 사용 하 여 CO 2. 
		참고: 새로운 일에 대 한 읽기를 참조 하십시오 모금에 D. melanogaster 처리에 대 한 21.</li>
		<li>0-5를 수집 튜브 및 (튀기)에 의해 전송에서 하루 오래 된 파리 NF (실 온에서 이전 예 열)를 포함 하는 새로운 튜브에 파리. 21 5 추가 일에 대 한 파리 시대 하자 ° c.</li>
		<li>5 일의 끝에, 4에서 HFD와 NF를 포함 된 튜브에 밖으로 ° c. 
		참고: 찬 온도, 파리 생활 스트레스 수로 튜브를 사용 하기 전에 따뜻하게 실 온에서 30 분 동안 앉아 보자.</li>
		<li>물티슈를 사용 하 여, 깨끗 하 고 튜브의 측면에서 과잉 액체를 제거.</li>
		<li>에 대 한 필터 종이의 작은 조각을 삽입 1 cm x 3 cm, 어떤 과잉 액체를 흡수 하 고 지방 음식으로. 
		참고:이 단계는 파리 HFD 음식에 집착 하는 것을 방지 하는 것이 중요.</li>
		<li>그런 다음 전송 높은 지방 음식에 파리 (튀기). 5 일 동안 가로 그들 측에, (서 안) 21-22 ° C에서 튜브를 하다. 
		참고: 방지이 부분적으로 높은 지방 음식, 막대기 음식 및 다이를 파리를 일으키는 녹아 수로 높은 온도.</li>
		<li>후 5 일, (튀기)에 의해 전송 그들의 용기를 30 분 동안 비어 있도록 음식 없이 새로운 튜브에 NF를 HFD 파리. 다음으로, 무게는 파리를 진행. 
		참고:이 HFD 먹이 프로토콜에에서 중요 한 단계 중 하나는 잘 혼합된 HFD, 무료로 비행 음식이 나 압축 된 오일의 어떤 덩어리를 준비 하는. 균질 혼합 및 HFD 45-30 ° C에 냉각 하는 것이 좋습니다, 튜브에 붓는 고 4 ° C. 적절 한 나이에 음식을 저장 하기 전에 제어 및 실험 파리의 정합은 제어 영양 및 환경 조건 사전 뿐만 아니라 중요 한 HFD 먹이 하. 단계에서 먹이, 제어 및 실험 파리 제공 되어야 합니다 NF와 HFD의 동일한 금액. 결코 밀된 튜브 또는 병 (transgenerational 효과 피하기 위해)에서 파리를 수집 합니다. 항상 NF와 HFD 식이 제한이 나 다른 crowding 효과 피하기 위해 먹이 동안 유리병 당 최대 25 파리를 넣어. HFD는 30%의 코코넛 오일으로 구성 되어, 따라서 22 ° C의 위 온도 일으키는 기름진 음식에 다 막대기 파리 HFD 녹아 부분적으로 수 있습니다. HFD는에 파리를 놓기 전에 어떤 잔여 기름 제거 하는 음식에서 어떤 초과 액체를 흡수 하는 필터 종이 삽입 튜브 청소. HFD에 파리의 인큐베이션 기간 동안 튜브 파리에 대 한 지방 없는 수평 표면을 제공 하기 위해 그들의 측면에 누워 있다.</li>
	</ol></li> <li>파리 무게 <ol><li>각 유전자 형 및 성별 테스트를 사용 하 여 매우 민감한 규모 미리 레이블, 빈 1.7 mL 튜브 무게를 기록 하.</li>
		<li>비행 마 취 또는 CO 2를 사용 하 여 anesthetize의 동일한 유전자 형, 성별, 36 파리 수집 및 1.7 mL 튜브 무게 중 하나로 브러시로 상태를 먹이.</li>
		<li>같은 매우 민감한 규모와 파리를 포함 하는 튜브 무게.</li>
		<li>결정이 수식에 따라 평균 비행 무게: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg" /> 참고:이 프로토콜에서 파리의 수는 36.</li>
		<li>플래시 동결 1.7 mL 튜브 2 분 수집에 대 한 액체 질소에 폭락에 의해 파리를 포함 하 고 상자에 튜브를 넣어. 그런 다음 전송 상자-80 ° C (바람직 온도)를 스토리지에 대 한 태그 분석 결과 함께 사용 될 때까지. 
		주의: 매우 낮은 온도에서 액체 질소가 이다. 적절 한 개인 보호 장비를 사용 하십시오.</li>
	</ol></li></ol> 2. 태그 분석 결과 <ol><li>태그 표준 농도의 준비 <ol><li>PBT의 500 mL를 준비 (PBS 1 X 0.05% 트리톤).</li>
		<li>사용 0.5 mL 튜브와 태그 솔루션 (자료 테이블), 준비의 공백 (PBT만) 100 µ L (2 µ g / µ L, 1 µ g / µ L, 0.5 µ g / µ L, 0.25 µ µ g/L는; 6 표준 태그 농도의 100 µ L 0.125 µ µ g/l는; 0.0625 µ µ g/L는)는 PBT와.</li>
		<li>얼음에 튜브를 놓고 파리를 연 삭 진행.</li>
	</ol></li> <li>파리를 연 삭 <ol><li>-80 ° C (1.3 단계)에서 냉동된 파리를 꺼내. 얼음에 파리를 포함 하는 튜브를 전송</li>
		<li>첫째, 96-잘 볼 디스펜서로 분쇄 볼 2mm 금속, 작은 붓을 사용 하 여 추가 공 제거.</li>
		금속 알갱이 접시에 직접 전송 공 디스펜서와 플립 위에 거꾸로 <li>장소 96 잘 연마 플레이트. 잘 당 한 공 이어야 한다.</li>
		<li>PBT의 600 µ L 96 잘 연마 플레이트의 각 행에 추가 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여.</li>
		<li>집게, 추가 3 당 잘 난다. 파리 각 행/96-잘이 격판덮개의 우물에서의 유전자 형, 성별 및 식품 상태를 나타냅니다.</li>
		<li>단단히 모자가 96 잘 접시에 놓습니다. 테이프는 누설을 상단에 배치 될 수 있습니다.</li>
		<li>제대로 연 삭 기계 연 삭 96 잘 접시를 놓습니다. 최고 속도와 프레스 기계를 설정 &#34; 실행 &#34;을 3 분에 대 한 파리</li>
		<li>후 3 분, 연 삭을 중지 하 고 격판덮개 원심 분리 진행: centrifu4000 x g, 4 ° c.에서 15 분 동안 ge 원심, 후 관리는 상쾌한 펠 릿 혼합 하지 않도록 신중 하 게 연 삭 접시.</li>
	</ol></li> <li>샘플 로드 및 태그 콘텐츠 결정 <ol><li>새로운 분 광 광도 계 96 잘 접시를 가져가 라. 접시의 각 행에 태그 시 약의 200 µ L 로드 다중 채널 피 펫을 사용 하 여.</li>
		<li>빈을 만들려면 첫 번째 행의 첫 번째 우물에 PBT의 부하 20 µ L. 아래로 pipetting으로 혼합. 거품 형성 방지.</li>
		<li>나머지에 (2.1.2 단계)에서 각 표준 희석의 부하 20 µ L 웰 스의 첫 번째 행과 아래로 pipetting으로 믹스. 거품 형성 방지.</li>
		<li>상쾌한의 20 µ L을 연 삭 플레이트의 각 행에서 분 광 광도 계 96 잘 접시에 해당 하는 행 전송 다중 채널 피 펫을 사용 하 여. 여기저기 잘 혼합 플라스틱. 거품 형성 방지.</li>
		<li>다음, 가스 투과성 호 96 잘 접시 위에 배치.</li>
		<li>품 어 10 분 동안 37 ° C에서 접시 
		참고: 우물에 거품 경우 원심에서 모든 거품을 제거 하려면 2000 x g 2 분 접시. 거품의 존재는 흡 광도 읽기에 방해가 됩니다.</li>
		<li>읽기 550 플레이트의 각의 흡 광도 nm 호환 microplate 리더를 사용 하 여. 다음, 표준 곡선을 추적 하 고 알 수 없는 샘플의 농도 [µ g / µ L] 결정.</li>
		<li>태그 콘텐츠 당 평균 비행 중량의 양을 결정 하는 다음 수식을 사용 하 여: 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg" /> 참고:이 프로토콜 3 파리의 PBT 600 µ L에 다진 했다; 결과, 비행 당 평균 볼륨 200 µ L.</li>
	</ol></li> <li>Bradford 분석 실험 그리고 단백질 콘텐츠 태그 콘텐츠의 정규화 <ol><li>7을 준비 하는 것은 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 표준 희석의 100 µ L (75 µ g/mL, 100 µ g/mL, 150 µ g/mL, 200 µ g/mL; 250 µ g/mL; 500 µ g/mL; 1000 µ g/mL)는 PBT와.</li>
		<li>새 96 잘 접시 하 고 접시의 각 행에 1 X Bradford 시의 200 µ L 로드.</li>
		<li>에 첫 번째 행의 첫 번째 잘 만들 빈 PBT의 10 µ L를 추가. 아래로 pipetting으로 혼합. 거품 형성 방지.</li>
		<li>나머지에 각 표준 희석의 추가 10 µ L 웰 스의 첫 번째 행과 아래로 pipetting으로 믹스. 거품 형성 방지.</li>
		<li>96 잘 접시에 해당 하는 행에 연마 플레이트의 각 행에서의 표면에 뜨는 10 µ L을 전송 다중 채널 피 펫을 사용 하 여. 여기저기 잘 혼합 플라스틱. 거품 형성 방지.</li>
		<li>96 잘 접시 위에 가스 투과성 호 장소.</li>
		<li>품 5 분 동안 실내 온도에 격판덮개. 우물에 거품 경우 원심에서 그들을 제거 하려면 2000 x g 2 분 접시. 
		참고: 거품의 존재는 흡 광도 읽기에 방해가 됩니다.</li>
		<li>읽기 빈의 흡 광도, 표준, 595에서 알 수 없는 샘플을 분 광 광도 계를 사용 하 여 nm. 표준 곡선을 사용 하 여 각 행에 있는 샘플의 농도 [µ g / µ L] 결정.</li>
		<li>정상화 단백질 수준 다음 수식을 사용 하 여 콘텐츠 태그: 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg" /></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+prevalence+of+overweight+and+obesity+in+children+and+adults+during+1980-2013:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2013.">Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013.</a> Lancet. 384, 766-781 (2014).</li><li>Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229 Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm">https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm</a> (2015)</li><li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+development+in+Drosophila+and+its+relationship+to+vertebrates.">Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates.</a> Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).</li><li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Drosophila+melanogaster+to+map+human+cancer+pathways.">Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways.</a> Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).</li><li>Chan, H. Y., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila models of human neurodegenerative disease.</a> Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).</li><li>Levine, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+sequences+homologous+to+a+protein+coding+region+conserved+between+homeotic+genes+of+Drosophila.">Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila.</a> Cell. 38, 667-673 (1984).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).</li><li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+an+emerging+model+for+cardiac+disease.">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342, 1-11 (2004).</li><li>Noyes, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expression+of+the+Drosophila+adipokinetic+hormone+gene.">Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene.</a> Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).</li><li>Rajan, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+flies+and+men:+insights+on+organismal+metabolism+from+fruit+flies.">Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies.</a> BMC Biol. 11, 38 (2013).</li><li>Rulifson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies:+growth+and+diabetic+phenotypes.">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296, 1118-1120 (2002).</li><li>Birse, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fat-diet-induced+obesity+and+heart+dysfunction+are+regulated+by+the+TOR+pathway+in+Drosophila.">High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila.</a> Cell Metab. 12, 533-544 (2010).</li><li>Musselman, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-sugar+diet+produces+obesity+and+insulin+resistance+in+wild-type+Drosophila.">A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila.</a> Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).</li><li>Diop, S. B., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+Insights+into+Diabetic+Cardiomyopathy+from+Drosophila.">Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila.</a> Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).</li><li>Williams, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Obesity-Linked+Gene+Nudt3+Drosophila+Homolog+Aps+Is+Associated+With+Insulin+Signaling.">The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling.</a> Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).</li><li>Morris, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+diet-induced+insulin+resistance+in+adult+Drosophila+melanogaster.">Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster.</a> Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).</li><li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gene+tinman+is+required+for+specification+of+the+heart+and+visceral+muscles+in+Drosophila.">The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila.</a> Development. 118, 719-729 (1993).</li><li>Erkkila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fatty+acids+and+cardiovascular+disease:+an+epidemiological+approach.">Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach.</a> Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).</li><li>Ganz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+diet+feeding+results+in+gender+specific+steatohepatitis+and+inflammasome+activation.">High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation.</a> World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).</li><li>Wang, C. Y., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance.">A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance.</a> Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).</li><li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).</li><li>Mathews, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+Dimorphism+of+Body+Size+Is+Controlled+by+Dosage+of+the+X-Chromosomal+Gene+Myc+and+by+the+Sex-Determining+Gene+tra+in+Drosophila.">Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila.</a> Genetics. 205, 1215-1228 (2017).</li><li>Golay, A., Bobbioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dietary+fat+in+obesity.">The role of dietary fat in obesity.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 21, 2-11 (1997).</li><li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1/Spargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase.">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Rep. 10, 1-13 (2015).</li><li>Chatterjee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+metabolic+adaptation+to+fasting+by+dILP6-induced+insulin+signaling+in+Drosophila+oenocytes.">Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).</li><li>Palanker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+HNF4+regulates+lipid+mobilization+and+beta-oxidation.">Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation.</a> Cell Metab. 9, 228-239 (2009).</li><li>Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+high-fat+diet+in+stress+response+of+Drosophila.">Role of high-fat diet in stress response of Drosophila.</a> PLoS One. 7, 42587 (2012).</li><li>Kitahara, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+class+III+obesity+(BMI+of+40-59+kg/m2)+and+mortality:+a+pooled+analysis+of+20+prospective+studies.">Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies.</a> PLoS Med. 11, 1001673 (2014).</li><li>Reis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+five+lipid+extraction+solvent+systems+for+lipidomic+studies+of+human+LDL.">A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL.</a> J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).</li><li>Turne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercritical+fluid+extraction+and+chromatography+for+fat-soluble+vitamin+analysis.">Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis.</a> J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).</li><li>Na, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+model+of+high+sugar+diet-induced+cardiomyopathy.">Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy.</a> PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).</li></ol>

저자는 공개 없다.

생쥐에서 비만 유도 개월19,20걸릴 수 있습니다. 파리에서 프로토콜을 먹이이 HFD 과잉 지방 축적의 문제에 일의 또는 더 적은, 18 h ( 그림 2참조) 후 지방 축적 증가 일으키는 유도 수 있습니다. HFD 설명 프로토콜 먹이 포도 당 콘텐츠 12 증가 하 고 Bmm lipase와 PGC-1 식24감소. 이것은 지방 질 및 ...

우리는 비만, 및 그것의 관련된 경제적 부담이는 세계적인 문제1시간 에입니다. 매 3 미국인 중 2 개는 체중 또는 비만 관련된 심장 병 리, 성인 인구2내에서 죽음의 주요 원인으로. 새로운 효율적인 방법은 적절 하 게 구성 요소 유전 및 분자 모형 유기 체를 사용 하 여 변화 증후군의 규칙에 연루 조사 필요 합니다. 이러한 이유로, 우리 과일 파리 초파리 모델 생쥐와 인간3,4,,56을 포함 한 포유류와 함께 가장 기본적인 생물 학적 프로세스를 공유 하기 때문에 선택 합니다. 초파리의 게놈은 높게 진화 하는 동안 보존 하지만 전반적으로 훨씬 더 작은 적은 유전자 복제와 대사 복잡성,4 많은 인간 질병 내포 하는 근본적인 메커니즘을 이해 하기에 적합 , 7 , 8. 또한, 특성 프로세스 지방 조직, 창 자에 의해 실시 하 고 췌 비행에 포도 당 및 지질 물질 대사에, 예를 들어 인간9, 와 유사한 규제 기능을 중재 10,11. 또한, 비만, 인슐린 저항 및 당뇨병 인간에서의 제어에 관련 된 기본적인 분자 경로 초파리 melanogaster12,,1314 보존 기능 , 15 , 16. 같은 더 높은 유기 체 초파리 는 포유류 심장3,17의 유사한 과정에 의해 개발 하는 동안 형성 되는 뛰는 심장. 따라서, 안정적인 HFD 프로토콜 및 높은 처리량 태그 분석 결과, 초파리의 유전 도구 상자를 사용 하 여 효율적인 심사 목적에 맞게 먹이의 개발 연구 하 고 근본적인 유전 기초를 이해 하는 중요 한 수단을 제공 기본 복잡 한 대사 질환입니다.
HFD 음식 자체 포화 지방산 대사 증후군18와 관련 된 것으로 알려진의 주로 구성 되는 코코넛 오일 보충 표준 실험실 비행 음식에서 이루어집니다. 귀하는 초파리 에서 프로토콜 먹이 되는 것을 효과적으로 그리고 reproducibly 우리의 최적화 HFD organismal 지방 함량의 문제에 증가 유도 비만 모델 포유류, 설치류, 개월19,20걸릴 수 있습니다, 일12,14. 이 프로토콜, 높은 처리량 태그 분석 결과와 함께에서 유전적 요인, 환경 영향과 새로운 변조기의 뚱뚱한 물질 대사를 마약 후보자의 효과 대 한 효율적인 대량 검사를 수 있습니다. 이러한 프로토콜은 가능성이 결과 이해 및 비만 비만 관련 된 인간의 병 리 전투 관련.
먹이 프로토콜 다목적 이며 단일 포화 또는 불포화 지방산의 신진 대사와 기능 효과 연구에 적용할 수 있습니다. 이 높은 처리량 태그 분석 결과 사용 하 여 D. melanogaster에 국한 되지 않습니다 하지만 작은 모형 유기 체 표 피와 거친 세포 외 매트릭스 (예를 들어, 다른 초파리 종, C. 선 충의 다양 한 적응 수 있습니다. 다른 신흥 무척 추 동물 모형 유기 체) 개발, 성인 또는 변화 질병의 단계의 모든 단계에서 다른 환경, 유전적 또는 생리 적인 조건 하에서 지방 콘텐츠를 측정 하. 태그 분석 결과 무료 지방산, 글리세롤, 글리세롤 3 인산 염 그리고 마지막으로 H2O2 와 4-aminoantipyrine (4-AAP) 3, 5-반응으로 태그 저하 효소 반응의 일련의 색채 측정에 기반 dichloro-2-hydroxybenzene 된 (3, 5 DHBS) 96-잘 분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 된 빨간 색된 제품을 생산 하

<table width="924">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Talboys Ball dropper/bead Dispenser</td>
			<td style="width:209px;">Talboys</td>
			<td style="width:148px;">#: 930150</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Talboys High Throughput Homogenizer</td>
			<td style="width:209px;">Talboys</td>
			<td style="width:148px;">#: 930145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="width:400px;height:17px;">Grinding Balls, Stainless Steel&#160;</td>
			<td style="width:209px;">OPS Diagnostics, LLC</td>
			<td style="width:148px;"># GBSS 156-5000-01</td>
			<td>5000 balls</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Masterblock 96 Well deep Microplates</td>
			<td style="width:209px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:148px;"># T-3058-1</td>
			<td>case of 80 plates</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="width:400px;height:22px;">Greiner&#160; 96 well microplate flat bottom</td>
			<td style="width:209px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:148px;"># M4436</td>
			<td>40 plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Greiner CapMat for sealing multiwell plates</td>
			<td style="width:209px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:148px;"># C3606</td>
			<td>50 sealing plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Reagent Reservoirs&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:148px;"># 1192T71</td>
			<td>12/PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Finnpipette 4661040</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td># 4661040</td>
			<td>1-10 ul multipipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Finnpipette 4661070</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td># 4661070</td>
			<td>30-300ul multipipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Finnpipette 4661020</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td>#4661020</td>
			<td>10-100ul multipipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multichannel tips</td>
			<td style="width:209px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td># P3131-S</td>
			<td>for 10 uL pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Multichannel tips</td>
			<td style="width:209px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td># P3133-S</td>
			<td>for 200 uL pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Multichannel tips</td>
			<td style="width:209px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td>#P1125</td>
			<td>for 100 uL pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Roboz Surgical</td>
			<td># 5 Dumonts</td>
			<td>Super fine forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64</td>
			<td style="width:209px;">Cole-Parmer scientific experts</td>
			<td># EW-11333-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance</td>
			<td style="width:209px;">Cole-Parmer scientific experts</td>
			<td># EW-11333-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">96-Well microplate Centrifuge</td>
			<td style="width:209px;">Hettich Zentrifugen</td>
			<td style="width:148px;"># Rotina 420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:209px;">Molecular devices</td>
			<td style="width:148px;"># SpectraMax 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator</td>
			<td style="width:209px;">Biostad</td>
			<td style="width:148px;"># 3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Infinity Triglycerides reagent</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:148px;"># TR22421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Triglyceride Standard</td>
			<td style="width:209px;">Stanbio</td>
			<td style="width:148px;">#2103 - 030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Quick Start Bradford Protein Assay</td>
			<td style="width:209px;">Bio-RAD</td>
			<td style="width:148px;"># 500-0205</td>
			<td>1x dye Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Coconut oil</td>
			<td style="width:209px;">Nutiva</td>
			<td># 692752200014</td>
			<td>15 0z jar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:148px;"># AM9625</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:209px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:148px;"># 9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Gas-permeable Foil</td>
			<td style="width:209px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:148px;"># 740675</td>
			<td>50 pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">filter Paper</td>
			<td style="width:209px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;"># 28317-241</td>
			<td>Pack of 100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Drosophila vials</td>
			<td style="width:209px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 32-116SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick Start Bovine Serum Albumin Standard</td>
			<td style="width:209px;">Bio-Rad</td>
			<td># 5000206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">FlyNap Anesthetic</td>
			<td style="width:209px;">Carolina</td>
			<td style="width:148px;"># 173025</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipes Low-Lint</td>
			<td style="width:209px;">Uline</td>
			<td style="width:148px;"># S-8115</td>
			<td>1-Ply, 4.4 x 8.4&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high fat diet feeding and high throughput triacylglyceride assay in drosophila melanogaster

심장 질환은 인간의 죽음은 전세계의 번호 하나 원인이 다. 수많은 연구 비만 심장 기능 상실 사이 강한 연결 인간, 하지만 더 많은 도구 및 연구 노력 하는 데 필요한 더 관련 된 메커니즘을 명료 하 게. 세기 동안, 초파리 의 유전자 매우 온순한 모델이 되었습니다 핵심 유전자 및 분자 경로 매우 종에 걸쳐 보존 될 입증의 발견에. 많은 생물학 과정 및 질병 메커니즘 기능 개발 (예를 들어, 몸 계획, 심장), 암, 신경 질환 등 즉석에서 보존 하 고. 최근, 비만 심장 질환 모형 유기 체에서와 같은 보조 병 리의 연구는 인간의 신진 대사 증후군에 관련 된 주요 레 귤 레이 터의 식별에 매우 중요 한 역할을 했다.
여기, 우리는 비만, 즉, 과도 한 지방 축적을 유발 하 고 태그 축적의 형태로 지방 콘텐츠를 모니터링 하는 효율적인 프로토콜을 개발 하는 효율적인 도구로이 모델 유기 체를 사용 하 여 제안 합니다. 높은 보존 뿐만 아니라, 하지만 덜 복잡 한 게놈 비행 또한 빠른 실험, 비용 효율성과 결합에 대 한 짧은 수명이 있다. 높은 지방 다이어트 (HFD) 비만 지방 콘텐츠에 높은 재현할 것을 목표로 관련된 증가 측정 하기 위한 높은 처리량 triacylglyceride (태그) 분석 결과 유도 하기 위해 초파리 에서 먹이 기를 위한 상세한 프로토콜을 제공 하는이 종이 대규모 유전자 또는 화학 심사에 대 한 효율적인. 효율적으로 규제 메커니즘 비만에 참여 조사 뿐 아니라 신약 개발에 약물의 효과의 빠른 테스트를 위해 발견에 대 한 표준화 된 플랫폼을 제공 하는 새로운 기회를 제공 하는 이러한 프로토콜 또는 비만, 당뇨병 및 대사 관련된 질환의 예방.

D. melanogaster, 다른 종족과 경우는 성적인이 형태 성 남성 및 여성22사이. 그것은 잘 알려진 여성은 남성22보다 그들의 인체에 더 많은 지방, 더 큰입니다. 우리의 프로토콜의 효율성을 테스트 하려면 우리 차이 태그 콘텐츠 남성과 여성 표준 실험실 wildtype (w1118)의 파리 확인 하려면 태그 분석을 수행 합니다. 데이터는...

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High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

높은 지방 다이어트 먹이 초파리 Melanogaster 의 높은 처리량 Triacylglyceride 분석 결과

이것은 높은 지방 다이어트를 먹이 초파리, 이해 기본적인 분자 메커니즘 lipotoxicity에 연루에 대 한 모델에서에서 비만 유발 하는 프로토콜 이다. 초파리 와 다양 한 식이, 환경, 유전적 또는 생리 적인 조건 하에서 (곤충) 잠재적으로 다른 모델에 지방 축적을 측정 하기 위한 높은 처리량 triacylglyceride 분석 결과를 제공 합니다.

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

high-fat-diet-feeding-high-throughput-triacylglyceride-assay

Research

JoVE Journal

Genetics

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

11.1K 조회수.  Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute. 이것은 높은 지방 다이어트를 먹이 초파리, 이해 기본적인 분자 메커니즘 lipotoxicity에 연루에 대 한 모델에서에서 비만 유발 하는 프로토콜 이다. 초파리 와 다양 한 식이, 환경, 유전적 또는 생리 적인 조건 하에서 (곤충) 잠재적으로 다른 모델에 지방 축적을 측정 하기 위한 높은 처리량 triacylglyceride 분석 결과를 제공 합니다.

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

연구

유전학

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

온도에 민감한 치명적인 돌연변이의 높은 처리량 로봇 보조 절연에<em&gt; 클라 미도 모나스의 reinhardtii에서</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for understanding the development and evolution of morphological phenotypes. Abdominal pigmentation in Drosophila melanogaster has been particularly useful, allowing researchers to identify the loci that underlie inter- and intraspecific variations in morphology. Hitherto, however, D. melanogaster abdominal pigmentation has been largely assayed qualitatively, through scoring, rather than quantitatively, which limits the forms of statistical analysis that can be applied to pigmentation data. This work describes a new methodology that allows for the quantification of various aspects of the abdominal pigmentation pattern of adult D. melanogaster. The protocol includes specimen mounting, image capture, data extraction, and analysis. All the software used for image capture and analysis feature macros written for open-source image analysis. The advantage of this approach is the ability to precisely measure pigmentation traits using a methodology that is highly reproducible across different imaging systems. While the technique has been used to measure variation in the tergal pigmentation patterns of adult D. melanogaster, the methodology is flexible and broadly applicable to pigmentation patterns in myriad different organisms.

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

This work presents a method to quickly and precisely quantify the abdominal pigmentation of Drosophila melanogaster using digital image analysis. This method streamlines the procedures between phenotype acquisition and data analysis and includes specimen mounting, image acquisition, pixel value extraction, and trait measurement.

복부 색소 침착 정량화<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

오버랩2 방법으로 시너지 약물 조합의 높은 처리량 식별

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

음향 나노 디스펜싱 기술을 사용한 고처리량 DNA 플라스미드 멀티플렉싱 및 트랜스펙션

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

살모넬라에서 피트니스의 높은 처리량 분석을 위한 디지털 PCR 기반 경쟁 지수

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...