마이크로 플레이트 피더 분석법은 Drosophila 급식 거동을 측정하는 간단하고 높은 처리량, 경제적인 방법을 제공하며 다른 보다 정교한 방법에 비해 여러 가지 이점을 제공합니다. 플레이트 판독기로 흡광도를 측정하여 소비를 정량화하면 수동 측정을 제거하고 수동 데이터 입력을 제거합니다. 데이터는 프로그래밍 방식으로 추출 및 처리에 만 전할 수 있습니다.
이러한 고처리량 분석으로 우리는 수용성 영양소, 약물, 제약 또는 독소의 소비를 정량화할 수 있으며, 다양한 곤충 종에 대한 적용을 위해 시스템을 수정할 수 있습니다. 용융 아가로즈를 시약 트로프에 붓고 다중 채널 파이펫을 사용하여 96웰 마이크로 플레이트의 각 우물에 용융 아가로즈 80 마이크로리터를 분배합니다. 남은 아가로즈를 밀봉된 가방에 최대 1주일 간 냉장 보관하고 추가 접시를 만들기 위해 재녹입니다.
배리어 스트립이 너무 느슨하면 손가락 주위에 코동을 움직여 곡률을 사용하여 채널에 고정합니다. 배리어 스트립을 배리어 스트립 채널에 삽입하여 커플러를 준비합니다. 커플러를 기아 플레이트에 부착하여 커플러가 미끄러질 수 있으므로 커플러를 사용하여 접시를 조작하지 않도록 합니다.
커플러의 각진 모서리가 마이크로 플레이트의 각진 모서리와 일치하여 올바른 방향을 유지하도록 합니다. CO2 마취 하에 3일에서 5일 된 파리를 정렬하십시오. 개별 파리를 기둥으로 감전 플레이트에 넣습니다.
배리어 스트립을 닫힌 위치로 조정하여 채우면 각 열을 닫습니다. 마이크로 플레이트 내에서 샘플 레이아웃을 신중하게 기록합니다. 기아 판이 채워지면 CO2를 제거한 후 파리가 자발적으로 회복하고 초기 마취 시간부터 6시간 동안 굶어 지을 수 있습니다.
15 밀리리터 원추형 튜브에 0.4 그램의 자당과 0.1 그램의 효모 추출물을 증류수 10 밀리리터에 녹여 액체 식품 10 밀리리터를 준비하십시오. 고체가 완전히 녹을 때까지 튜브를 소용돌이. 40 마이크로리터의 염료 스톡 솔루션을 추가하고 액체 식품을 0.45 마이크로미터 필터로 기울어진 10 밀리리터 주사기로 옮킨다.
한 번에 약 1.5밀리리터의 용액을 1.7밀리리터 마이크로센심분리기 튜브로 필터링합니다. 용액을 포함하는 주사기를 따로 설정하고 피더 플레이트 준비 중에 필요에 따라 추가 용액을 필터링합니다. 밀봉 필름으로 1536웰 마이크로 플레이트의 바닥을 밀봉하여 피더 플레이트를 준비합니다.
밀봉 패들을 사용하여 필름을 철저히 고수하십시오. 그런 다음, 면도칼로 왼쪽과 오른쪽 가장자리에서 여분의 필름을 다듬습니다. 1536-웰 마이크로 플레이트의 4개의 우물의 각 클러스터에 대해 여과된 액체 식품 컬럼의 10마이크로리터를 왼쪽 상부에 분배한다.
모든 우물이 채워지면 마이크로 플레이트의 바닥을 밀봉하는 데 사용되는 동일한 단계에 따라 밀봉 필름을 플레이트 상단에 적용합니다. 원하는 플레이트 수를 반복합니다. 10초 동안 플레이트를 200배 G로 원심분리하여 유체를 정착시합니다.
이 우물에서 축적 응축을 일으킬 수 있기 때문에 접시가 냉각 되지 않도록, 감격 측정을 가리는. 0.25 밀리미터 직경 바늘을 장착 한 바늘 프로브 도구를 장착 한 플레이트의 상부 표면의 우물을 천공하고, 동일한 순서를 사용하여 용액을 분배 할 때 사용되었던 것과 동일한 순서를 사용합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 용액 사이에 바늘을 닦아냅니다.
접시를 뒤집고 바닥에 있는 우물을 천명합니다. 뚜껑없이 630 나노미터에서 플레이트의 흡광도를 읽습니다. 결로 링이 천공 된 우물을 둘러싸고 있는지 확인하기 위해 상단 밀봉 필름에 내부 뚜껑을 놓고 외부 뚜껑을 접시에 놓습니다.
피더 플레이트를 커플러에 올려 놓아 가이드가 피더 플레이트와 기아 플레이트의 적절한 구멍을 정렬합니다. 커플러와 플레이트가 올바르게 방향을 정한지 확인합니다. 모든 피더 플레이트가 커플러에 로드되면 커플러의 배리어 스트립을 조정하여 플레이트의 우물을 엽니다.
커플러와 플레이트 어셈블리를 보조 컨테이너에 배치합니다. 각 보조 용기에 담근 종이 타월이 들어 있는 파이펫 박스의 하반부에 놓아 습도를 제공합니다. 보조 컨테이너의 뚜껑을 닫고 제어된 환경으로 옮깁니다.
파리를 22시간 동안 섭취할 수 있습니다. 노출 22시간 후에는 각 플레이트에서 죽은 파리를 확인하고 그에 따라 플레이트 레이아웃을 업데이트합니다. 모든 플레이트를 검사한 후 보조 용기 내부의 CO2를 펌핑하여 파리를 대량으로 마취시합니다.
약 60초 후에 모든 파리가 고정되어 있는지 확인합니다. 파리를 기아 판에 부드럽게 누르고 플라스틱 배리어 스트립을 교체합니다. 판독을 위해 피더 플레이트를 제거합니다.
630 나노미터에서 플레이트의 흡광도를 다시 읽어보십시오. 모든 플레이트가 판독될 때까지 프로세스를 반복합니다. 증발은 모든 우물에 대해 정량화되었고 개별 플레이트의 우물 사이에 상관 관계가 있는지 여부를 결정하는 것으로 나타났습니다.
증발 대 행 및 증발 및 열에 대한 Pearson 상관 계수는 증발 및 우물 위치 사이의 추세를 평가하기 위해 계산되었습니다. 3일에서 5일 된 캔톤-SB 플라이에 대한 소비는 프로토콜의 유효성을 확립하기 위해 정량화되었다. 파리는 1%효모 추출물을 함유한 4%의 자당 용액과 15%에탄올과 1%효모 추출물로 보충된 4%의 자당 용액 중에서 선택할 수 있었습니다.
남성과 여성 모두 에탄올과 효모 추출물로 용액에 대한 압도적인 선호도를 보였다. 피더 플레이트를 구성할 때 일관성을 유지하는 것이 필수적이며, 각 비행은 식품 부피, 증발 및 액세스와 관련하여 동일한 소비 시나리오를 제시하도록 보장합니다. 이 기술은 Drosophila 필드에 있는 연구원이 전통적인 방법에 비해 더 높은 처리량 및 더 낮은 비용으로 소비 및 선호도 행동에 대한 높은 처리량 비교량을 능력을 발휘할 수 있게 합니다.
