저자들은 Shanghai First People &#39;s Hospital (HY)의 초기 기금 인 Shanghai Institute of Higher Learning (HY)의 특별 임용 (Eastern Scholar) 교수 프로그램, Shanghai Jiaotong의 Gaofeng Clinical Medicine Grant 지원에 대한 지원을 인정하고자합니다. (HY), 캐나다의 Crohn &#39;s and Colitis Foundation (CCFC) (SET 및 HY)의 기금으로 구성되어 있습니다.

1. 세포 배양 배지 및 시약의 준비 <ol><li> RPMI - 1640 매체에 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 2 MM L - 글루타민과 1 MM 나트륨 피루 베이트의 보충제를 추가하여 완벽한 세포 배양 매체 R10을 준비합니다. <ol><li> NF - κB / AP - 1 활성화 제어하에 SEAP의 표현을 유지하기 위해 R10에 항생제 Zeocin (200 μg / ML)을 추가하여 선택 배지 R10 - Z를 준비합니다. SEAP 및 루시퍼 라제 리포터 유전자를 발현하는 세포를 선택하기 위해서는 Zeocin (100 μg / mL)과 blasticidin (10 μg / mL)을 모두 R10에 첨가하십시오 (R10-ZB). </li></ol></li><li> 클린 125 mL의 유리제 플라스크에 100 ㎖의 초순수, 독소없는 물 (E · G., 정량화 - 청색) 기판 분말 한 파우치를 용해하여 SEAP 기질 용액을 준비한다. <ol><li> 용액을 부드럽게 소용돌이면 37 ° C에서 1 시간 동안 배양하여 완충액이 완전히 용해되도록하십시오. </li> &lt;멸균을 보장하기 위해 0.2 μm 멤브레인을 사용하여 용액을 여과하고 (4) 사용 전 2 주에서 최대 4 ℃에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 멸균 50 ML 원심 분리기 튜브에 25 ML ultrapure, endotoxin 무료 물에 기판 파우더 ( 예 : QUANTI-Luc)의 한 주머니를 용해하여 루시 페라 제 기질 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 분말을 완전히 녹인 후 즉시 용액을 사용하십시오. 또는 사용하기 전에 4 ° C (최대 1 주일) 또는 -20 ° C (최대 1 개월)에 보관하십시오. 주의 : 두 가지 용액 모두가 빛에 민감하므로 가능한 경우 항상 빛에 노출시키지 마십시오. 솔루션의 여러 번의 동결 - 해동 사이클은 기판의 불안정을 초래하고 수명을 단축시킬 수 있습니다. </li></ol></li><li> 500㎍ / mL의 농도를 갖도록 분자량 디메틸 술폭 시드 (DMSO)에있는 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)의 스톡 용액을 준비하십시오. 원액의 분액을 만듭니다 (500 μL 튜브에 10 μL)를 넣고 -20 ° C에 보관하십시오. </li><li> 5 mg / mL의 농도로 멸균 된 내 독소가없는 물에 LPS (E-coli K12) 저장 용액을 준비하고 -20 ° C에서 장기 보관을위한 분량을 만드십시오. 사용하기 전에 -20 ℃에서 100 μg / mL 및 저장 농도의 인산염 완충 식염수 (PBS)에 스톡 LPS를 희석하여 작동 LPS 솔루션을 준비합니다. 주의 : 배양 물의 시약 준비는 바이오 안전성 캐비닛에서 수행해야하며 사용하기 전에 모든 용기를 멸균해야합니다. PMA와 LPS 용액의 반복 된 동결 - 해동주기는 피해야한다. </li></ol> 2. THP-1 리포터 세포 유래 대 식세포의 배양 <ol><li> 2 개의 THP-1 리포터 세포주를 사용하십시오 : THP-1-XBlue 및 THP-1- 이중 세포. 전자는 NF-κB / AP-1에 의해 제어되는 SEAP 리포터 유전자를 가지고 있으며, 후자는 이중 리포터 유전자 시스템, 동일한 SEAP 리포터 유전자 및 IRF 조절 루시퍼 라제 유전자를 갖는다. 그만큼ir 배양 절차는 선발 배양 배지를 제외하고 동일하다. <ol><li> R10 배지 10 ML에서 작업 세포 주식 (~ 5 X 10 6 셀)을 해동, 5 분 300 XG에서 세포를 스핀. 10 ML의 R10 매체에 Resuspend 세포 및 T75 문화 플라스크로 전송. 세포가 1 x 106 세포 / mL의 밀도에 도달 할 때까지 2-3 일마다 배지를 교환하십시오. </li><li> 세포 성장이 용량에 도달하면, 통로 세포는 2-5 × 105 세포 / ㎖의 범위에 세포 밀도를 감소시키기 때문에, 세포 성장을 계속할 수있다. </li><li> 적어도 1 회 통과 한 후, 선택 배지에서 세포를 배양하기 시작하십시오 : THP-1-XBlue의 경우 R10-Z, THP-1- 이중의 경우 R10-ZB. 선택 배양 배지로 적어도 1 회 통과시켜 세포를 배양 한 후, 세포를 실험 할 준비가된다. 주의 : 세포의 과증식은 심각한 세포 사멸로 이어질 수 있습니다. 세포 생존율은&gt; 98 %를 유지해야합니다. 통과 번호를 셀로 기록하십시오.ls는 많은 구절 (&gt; 20 구절) 후에 다르게 행동 할 수 있습니다. 참고 : 세포 배양 플라스크는 비용을 절감하기 위해 여러 번 재사용 할 수 있습니다. 그러나,이 연습은 다른 플라스크 사이의 일반적인 오염과 교차 오염의 위험을 증가시킬 수 있습니다 (동시에 다른 세포주를 취급 할 경우). 배지 교환 및 세포 통과 동안 원심 분리는 300 xg에서 5 분으로 설정됩니다. </li></ol></li><li> 리포터 세포 분석을 수행하려면 세포를 96 웰 평면 세포 배양 플레이트에 넣고 대 식세포로 분화하십시오. 절차는 다음에서 설명합니다. <ol><li> 플라스크에서 원심 분리기 튜브에 세포를 전송, 5 분 300 XG에서 세포를 스핀 다운하고 1 X 10 6 세포 / ML의 농도로 R10 매체에 resuspend. 50 ng / ML의 최종 농도와 세포 현탁액에 PMA 솔루션의 aliquots을 추가합니다. </li><li> 96 - 우리의 각 우물에 세포 현탁액의 100 μL를 전송멀티 채널 피펫을 사용하여 2 개의 플레이트로 분리 하였다. 24 시간 동안 37 (세포 배양기에서)에서 플레이트를 품어. </li><li> 부화 후, 신중하게 진공 흡입기 (또는 다중 채널 피펫과)를 사용하여 문화 매체를 제거하고 부드럽게 PBS (100 μL / 잘) 두 번 세포를 씻어; 각 우물에 신선한 R10 매체 100 μL를 추가합니다. 기자 분석을 실시하기 전에 인큐베이터에서 2 일 동안 세포를 휴식. 주의 : 휴식 단계는 PMA 자극 후 세포가 평상시의 조용한 상태로 진정 될 수있게하는 데 매우 중요합니다. 이것은 비 자극 조건 하에서 리포터 유전자의 백그라운드 신호를 현저하게 감소시킬 수있다. 참고 : PMA로 24 자극 후, 세포는 우물 바닥에 세포 접착의 특징과 pseudopodia의 형태 학적 특징과 함께 macrophage 같은 표현형으로 차별화됩니다. </li></ol></li></ol> 3. 리포터 세포를 이용한 잠재적 인 TLR4 나노 억제제의 스크리닝 </p&gt; 참고 : TLR4 신호 전달은 MyD88 의존 경로와 TRIF 의존 경로를 모두 사용하기 때문에 광범위한 TLR 신호 전달 경로를 포괄하는 주요 대상으로 선택됩니다. THP-1-XBlue 리포터 세포는 주로 NF-κB / AP-1 활성화를 검사하는 데 사용되는 반면 THP-1-Dual 세포는 TRIF 의존적 신호 전달에서 IRF 활성화를 위해 사용됩니다. <ol><li> 선별 검사 전에 용량 - 반응 곡선을 생성하여 최적의 피폭 선량을 확인하십시오. <ol><li> 작동 LPS 솔루션을 R10 배지 (log10 규모로 희석)에서 최종 농도 0.01 - 100 ng / ML로 희석합니다. 플레이트 디자인을 레이아웃하고 96 - 웰 둥근 바닥 문화 접시에 희석하십시오. 희석 후 각 웰에 최소 110 μL의 용액이 있는지 확인하십시오. </li><li> 진공 흡입기를 사용하여 세포 배양 플레이트 (2.2.3 항)에서 배양 배지를 부드럽게 제거합니다. </li><li> 희석 플레이트 (3.1.1)에서 준비된 R10 배지를 함유 한 LPS를 옮긴다.표본의 배치에 따라 배양 판에 묻는다. 24 시간 동안 37 (세포 배양기에서)에서 플레이트를 품어. </li><li> 24 시간 후 조심스럽게 상등액 (80 μL / well)을 새로운 96-well 둥근 바닥 판에 옮긴다. 이 용액에 대해 비색 및 / 또는 루시퍼 레이션 루미 네 센스 분석을 즉시 수행하거나 분석 개발 전에 4 ° C (수 시간) 또는 -20 ° C (일)에 보관하십시오. 참고 : 실험 및 데이터 분석을 위해 판 레이아웃의 디자인이 간단하고 명확해야합니다. 각 조건에 대해 2-4 복제본을 고려해야합니다. 항상 음성 대조군 (LPS null)을 포함하십시오. 이중 세포는 대 식세포로 분화 된 후 NF-κB / AP-1 활성화의 상대적으로 높은 배경을 가지고 있으므로 NF-κB / AP-1 활성화에 THP-1-XBlue 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 NF-κB / AP-1 및 IRF 활성화를보고하는 데 이중 세포를 사용하는 것이 가능합니다. </li></ol></li><li> 색상 개발IRF 활성화에 대한 NF-κB / AP-1 활성화 및 루시퍼 라 아제 발광 분석을위한 이미 트 (imetric) 분석. <ol><li> NF - κB / AP - 1 활성화를 평가하기 위해 각 샘플의 상등액 20 μL를 새로운 96- 웰 평평한 바닥 배양 플레이트에 옮기십시오. 예열 된 SEAP 기질 용액 180 μL를 각 웰에 첨가한다. 37에서 플레이트를 품어 1 - 2 H 색상 개발 (짙은 파란색으로 핑크색)을 허용합니다. 플레이트 판독기에서 655 nm에서 흡수를 수집합니다. 주의 : 배양 시간은 발색 (30 분에서 밤새 배양)에 따라 달라질 수 있습니다. 발색의 포화 (OD&gt; 3)를 피하면서 가장 어두운 색상의 광학 농도 (OD)가 1 이상이 될 때까지 기다리는 것이 좋습니다. </li><li> IRF 활성화 분석을 위해 각 샘플의 상등액 10 μL를 96- 웰 투명 평면 바닥 판에 옮긴다. 루시퍼 레이즈 용액 (50 μL)을 넣고 즉시 발광 w잘 ~. 참고 : 자동 주입 기능이있는 발광 판 판독기를 사용하여 우물에서 우물로, 그리고 판에서 판으로의 판독시 일관성을 보장 할 것을 적극 권장합니다. 기질 용액을 수동으로 주사하는 경우 각 웰에 대해 일관된 배양 시간 및 판독 설정을 보장하십시오. </li></ol></li><li> 10 ng / mL LPS 자극 (3.1 기준)으로 다양한 peptide-GNP 잡종에 대한 screening assay를 수행하십시오. 리포터 분석 개발을 위해 3.2에서 동일한 절차를 따르십시오. <ol><li> 원심 분리 방법을 사용하여 펩타이드 - GNP 잡종을 R10 배지에서 200nM로 농축시킨다. 30 분 동안 18,000 xg에서 하이브리드 솔루션 (10 NM)의 20 볼륨을 원심 분리하고 신중하게 표면에 버려집니다. 튜브에 하이브리드 (튜브의 하단)를 수집하여 PBS로 두 번 씻어서 R10 배지의 한 부피에 하이브리드를 다시 부순다. </li><li> 같은 양의 농축 된 잡종과하이브리드 및 LPS의 최종 농도가 각각 100 nM 및 10 ng / mL가되도록 R10 배지를 함유하는 LPS (20 ng / mL). </li><li> 배양 플레이트 (2.2.3)에서 배양 배지를 제거하고 혼합 용액 100 μL를 각 웰에 첨가하십시오 (각 조건별로 3 복제). 음성 대조군 (중간 정도)과 LPS 대조군 (잡종이없는 10 ng / mL LPS)을 포함한다. </li><li> 37 ° C에서 24 시간 부화 후, 튜브에 각 우물의 매체를 전송하고 30 분 18,000 XG, 4 ° C에서 튜브를 원심 분리기. 96- 웰 둥근 바닥 플레이트에 뜨는 (50-80 μL / 튜브)을 수집하고 3.2에서 설명한대로 리포터 분석을 수행합니다. 주의 : 원심 분리 후 상청액을 버릴 때는 튜브의 바닥에서 잡종을 동요시키지 마십시오. NOTE : 단계 3.3.4의 원심 분리는 비 - 내재화 된 나노 입자 잡종을 배양 배지에서 제거하는 데 매우 중요하며, 교배종과의 교잡을 피할 수있다로리 메트릭 / 루미넌스 독서. 이것은 금 나노 입자가 크기와 응집에 따라 넓은 파장의 빛을 흡수 할 수 있기 때문입니다. </li></ol></li></ol> 4. 잠재적 후보자의 억제 효과 검증 참고 : 선별 검사에서 잠재적 후보자의 억제 효과를 확인하기 위해 두 가지 방법이 사용됩니다. 하나는 고정 하이브리드 농도 (또는 그 반대 방향)에서 각성제 (LPS)의 용량 반응을 검사하는 것입니다. 다른 하나는 immunoblotting을 통해 NF-κB / AP-1 및 IRF3 신호의 저해를 직접 관찰하는 것입니다. <ol><li> 접근법 1에서, 3.3에 설명 된 것과 동일한 절차에 따라 1 ng / mL 및 10 ng / mL에서 리드 하이브리드 및 2 개의 LPS 농도 100 nM으로 리포터 분석을 수행합니다. 비교를위한 하이브리드 컨트롤로서 비활성 하이브리드 (스크리닝 결과에 근거)를 포함시킨다. </li><li> 면역 블로 팅 접근법에 대해서는 표준 experimental 절차. <ol><li> R10 배지에서 THP-1 세포를 배양하고 세포를 12- 웰 배양 플레이트 (2 × 106 세포 / 웰)에 접종하고 24 시간 동안 50 ng / mL PMA로 세포를 처리하여 대식 세포로 분화시킨다 2 일 동안. </li><li> 세포 분화 후 시간이 지남에 따라 (최대 4 시간) 잡종 (100nM)의 유무에 관계없이 10ng / mL LPS로 세포를 자극합니다. 다양한 시점 (0, 5, 15, 30, 60, 120 및 240 분)에서 immunoblotting을 위해 세포 용 해물을 준비하십시오. 비활성 하이브리드를 컨트롤로 포함하십시오. </li><li> IκBα, 인산화 된 p65 및 인산화 된 IRF3의 신호를 조사하여 NF-κB 및 IRF3의 활성화에 대한지도 교배종의 억제 효과를 검사합니다. 내부 통제로 β-actin과 총 IRF3 신호를 조사하십시오. 참고 : 신호 변환은 종종 훨씬 빠르게 (몇 시간 내에) 발생하고 리포터 효소 SEAP 및 루시퍼 라제 (24 시간)의 발현이 발생합니다. 또한 perfor에 매우 좋습니다다른 검증 방법으로서 24 시간에서 테스트 된 잡종의 생존 능력 분석. </li></ol></li></ol> 5. TLR 특이성 평가 참고 : 리드 펩타이드 - GNP 하이브리드의 TLR 특이성을 조사하기 위해 TLR2, TLR3 및 TLR5를 비롯한 다른 TLR 신호 전달 경로가 테스트됩니다. THP-1 유래 대 식세포 인해 TLR7, 팔의 부족과 대 식세포 (34) 9 표현이 TLR에의 자극에 잘 반응하지 않기 때문에 TLR7, 8, 9는 제외됩니다. <ol><li> TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (폴리 I : C) 및 TLR5 (플라 젤 린)에 특이적인 리간드를 다양한 농도로 (1 ng / mL ~ 25 μg / mL) 절차 3.1 및 3.2. </li><li> 납 하이브리드 (100 nM)와 각 TLR 리간드의 혼합물을 5.1에서 얻은 농도로 처리하여 납 h의 억제 특이성을 평가합니다이브 리드는 3.3에 설명 된 실험 절차에 따라. 비활성 하이브리드를 비교 대조군으로 포함시킵니다. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+high-density+lipoprotein-like+nanoparticles+potently+inhibit+cell+signaling+and+production+of+inflammatory+mediators+induced+by+lipopolysaccharide+binding+Toll-like+receptor+4.">Synthetic high-density lipoprotein-like nanoparticles potently inhibit cell signaling and production of inflammatory mediators induced by lipopolysaccharide binding Toll-like receptor 4.</a> Biomaterials. 100, 67-75 (2016).</li><li>He, C., Hu, Y., Yin, L., Tang, C., Yin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+particle+size+and+surface+charge+on+cellular+uptake+and+biodistribution+of+polymeric+nanoparticles.">Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles.</a> Biomaterials. 31 (13), 3657-3666 (2010).</li><li>Hirn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size-dependent+and+surface+charge-dependent+biodistribution+of+gold+nanoparticles+after+intravenous+administration.">Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration.</a> Eur J Pharm Biopharm. 77 (3), 407-416 (2011).</li><li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery.">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nat Biotechnol. 33 (9), 941-951 (2015).</li><li>Arvizo, R. 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Y., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+the+cellular+uptake+of+physiologically+stable+peptide-gold+nanoparticle+hybrids+with+single+amino+acids.">Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50 (41), 9643-9646 (2011).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid+Structure+Determines+the+Immune+Responses+Generated+by+Peptide-Gold+Nanoparticle+Hybrids.">Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids.</a> Particle &amp; Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid-Dependent+Attenuation+of+Toll-like+Receptor+Signaling+by+Peptide-Gold+Nanoparticle+Hybrids.">Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids.</a> ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+pH+modulation+by+peptide-gold+nanoparticle+hybrids+enables+potent+anti-inflammatory+activity+in+phagocytic+immune+cells.">Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells.</a> Biomaterials. 111, 90-102 (2016).</li><li>Ospelt, C., Gay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLRs+and+chronic+inflammation.">TLRs and chronic inflammation.</a> Int J Biochem Cell Biol. 42 (4), 495-505 (2010).</li><li>Kuznik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+endosomal+TLR+inhibition+by+antimalarial+drugs+and+imidazoquinolines.">Mechanism of endosomal TLR inhibition by antimalarial drugs and imidazoquinolines.</a> J Immunol. 186 (8), 4794-4804 (2011).</li><li>Lee, S. J., Silverman, E., Bargman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+antimalarial+agents+in+the+treatment+of+SLE+and+lupus+nephritis.">The role of antimalarial agents in the treatment of SLE and lupus nephritis.</a> Nat Rev Nephrol. 7 (12), 718-729 (2011).</li><li>Mullarkey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endotoxin+response+by+e5564,+a+novel+Toll-like+receptor+4-directed+endotoxin+antagonist.">Inhibition of endotoxin response by e5564, a novel Toll-like receptor 4-directed endotoxin antagonist.</a> J Pharmacol Exp Ther. 304 (3), 1093-1102 (2003).</li><li>Barochia, A., Solomon, S., Cui, X., Natanson, C., Eichacker, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eritoran+tetrasodium+(E5564)+treatment+for+sepsis:+review+of+preclinical+and+clinical+studies.">Eritoran tetrasodium (E5564) treatment for sepsis: review of preclinical and clinical studies.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 7 (4), 479-494 (2011).</li><li>Rossignol, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety,+pharmacokinetics,+pharmacodynamics,+and+plasma+lipoprotein+distribution+of+eritoran+(E5564)+during+continuous+intravenous+infusion+into+healthy+volunteers.">Safety, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and plasma lipoprotein distribution of eritoran (E5564) during continuous intravenous infusion into healthy volunteers.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3233-3240 (2004).</li><li>Rossignol, D. P., Wong, N., Noveck, R., Lynn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+pharmacodynamic+activity+of+eritoran+tetrasodium,+a+TLR4+antagonist,+during+intermittent+intravenous+infusion+into+normal+volunteers.">Continuous pharmacodynamic activity of eritoran tetrasodium, a TLR4 antagonist, during intermittent intravenous infusion into normal volunteers.</a> Innate Immun. 14 (6), 383-394 (2008).</li><li>Tidswell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+2+trial+of+eritoran+tetrasodium+(E5564),+a+toll-like+receptor+4+antagonist,+in+patients+with+severe+sepsis.">Phase 2 trial of eritoran tetrasodium (E5564), a toll-like receptor 4 antagonist, in patients with severe sepsis.</a> Crit Care Med. 38 (1), 72-83 (2010).</li><li>Opal, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+eritoran,+an+antagonist+of+MD2-TLR4,+on+mortality+in+patients+with+severe+sepsis:+the+ACCESS+randomized+trial.">Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: the ACCESS randomized trial.</a> JAMA. 309 (11), 1154-1162 (2013).</li><li>Fung, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+screening+of+marine+sponge+extracts+for+anti-inflammatory+agents+combined+with+chemical+genomics+identifies+girolline+as+an+inhibitor+of+protein+synthesis.">Unbiased screening of marine sponge extracts for anti-inflammatory agents combined with chemical genomics identifies girolline as an inhibitor of protein synthesis.</a> ACS Chem Biol. 9 (1), 247-257 (2014).</li></ol>

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TLR은 많은 염증성 질환의 발병 기전에 관여하기 때문에 면역 반응 및 염증 상태의 조절을위한 치료 표적으로 부상하고있다. 그러나, TLR 신호 전달 경로를 억제하는 치료제의 임상 개발은 지금까지 제한된 성공을 거두었 다. TLR7과 TLR9를 억제하는 항 말라리아제 인 하이드 록시 클로로퀸 (hydroxychloroquine)은 임상 적으로 사용됩니다 35 , 36 . 마찬가지로, 화?...

Toll-like receptors (TLRs)는 감염에 대한 첫 번째 방어선에 기여하는 타고난 면역 체계의 핵심 요소 중 하나입니다. TLRs는 병원체 관련 분자 패턴 (또는 PAMPs)의 레퍼토리를 인식하고 신호 전달의 계단식을 통해 방위 반응을 탑재하여 침입 병원체를 감지하는 책임이 있습니다 1 , 2 . 확인 된 10 개의 인간 TLR이 있습니다. 리간드가 불분명 한 TLR10을 제외하고, 각각의 TLR은 구별되고 보존 된 PAMP 군을 인식 할 수있다. 예를 들어, 주로 세포 표면에 위치한 TLR2와 TLR4는 그람 양성균과 그람 음성균의 지단백질과 당지질을 각각 검출 할 수 있습니다. 주로 엔도 솜 구획에 존재하는 TLR3, TLR7 / 8 및 TLR9는 바이러스 및 세균으로부터 RNA 및 DNA 생성물을 감지 할 수 있습니다 3 . PAMPs에 의해 자극되면 TLR은 pro-inf를 방출하여 필수 면역 반응을 유발합니다염증 매개체, 효과기 면역 세포의 모집 및 활성화, 후속 적응 면역 현상 조정 4 . TLR 신호 전달은 두 가지 주요 경로 5 , 6 으로 간단히 분류 할 수 있습니다. 하나는 어댑터 단백질 골수 분화 인자 88 (MyD88) - MyD88- 의존 경로에 의존한다. TLR3을 제외한 모든 TLR은 활성화 된 B 세포 (NF-κB)와 mitogen-associated protein kinases (MAPKs)의 핵 인자 κ-light-chain-enhancer를 활성화시키기 위해이 경로를 이용하여 TNF-α와 같은 전 염증성 매개체의 발현을 유도한다. α, IL-6, IL-8 등이있다. 두 번째 경로는 인터페론 (IFN) 조절 인자 (IRFs)와 NF-κB를 활성화시키기 위해 TIR 도메인 함유 어댑터 유도 인터페론 -β (TRIF), 즉 TRIF 의존적 경로 또는 MyD88 독립적 경로를 사용하여 I 형 IFN. 손상되지 않은 TLR 신호미생물 및 바이러스 감염으로부터 우리의 일상적인 보호에 중요합니다. TLR 신호 전달 경로의 결함은 면역 결핍을 초래할 수 있으며 종종 인간의 건강에 해로울 수 있습니다. 7 그러나 TLR 신호는 &#39;양날의 검&#39;이며 과도한 통제되지 않은 TLR 활성화는 해롭다. 과도한 TLR 반응은 많은 급성 및 만성 인간 염증성 질환에서 병인 발생에 기여합니다 8 , 9 . 예를 들어, 전신성 염증 및 다기관 손상으로 특징 지어지는 패혈증은 주로 패혈증 병태 생리학 10 , 11 , 12 에서 중요한 역할을하는 TLR2 및 TLR4와 함께 감염에 대한 급성, 압도적 인 면역 반응 때문입니다. 또한, TLR5는 낭포 성 섬유증 환자의 만성 폐 염증에 기여하는 것으로 밝혀졌습니다 13, 14 . 또한, 조절 이상 엔도 좀 TLR 신호 전달 (예를 들어, TLR7 및 TLR9)을 강하게 전신성 홍 반성 루푸스 (SLE) 및 류마티스 관절염 (RA) (15, 16)를 포함한 여러자가 면역 질환의 발생 및 진행과 연관된다. 이러한 수렴되는 증거는 TLR 신호가 많은 염증성 질환 17에 대한 잠재적 인 치료 표적임을 확인합니다. TLR 응답의 약리학 규제 많은 염증성 질환에 유용 할 것으로 예상되지만, 불행히도, 현재 TLR 9, 17, 18 시그널링 억제 임상 가능한 매우 적은 화합물이있다. 이것은 부분적으로 면역 항상성과 병리에 관련된 TLR 경로의 복잡성과 중복으로 인한 것입니다. 따라서, 소설, poten 검색다중 TLR 신호 전달 경로를 표적으로하는 치료제는 근본적인 차이를 메워 줄 수 있으며 TLR 억제제를 진료소로 진출시키는 문제를 극복 할 수 있습니다. 나노 과학과 나노 기술의 급속한 발전에 비추어 볼 때, 나노 디바이스는 고유 한 특성 19 , 20 , 23 으로 인해 차세대 TLR 변조기로 부상하고 있습니다. 나노 크기는 이러한 나노 치료제가보다 나은 생체 분포와 지속적인 순환을 가능하게합니다 24 , 25 , 26 . 이들은 원하는 약물 동태 학 및 약물 동태 프로파일 27 , 28 , 29 를 충족시키기 위해 더 기능화 될 수있다. 보다 흥미롭게도,이 새로운 나노 디바이스의 생체 활성은 그 고유 한 특성에 기인한다.단순히 치료제의 전달 수단으로서의 역할을하기보다는 특정 의료 응용 분야에 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 고밀도 지단백질 (HDL) 유사 나노 입자는 TLR4 리간드 LPS 23 을 제거함으로써 TLR4 신호 전달을 억제하도록 설계되었습니다. 또한, 우리는 펩타이드 - 금 나노 입자 하이브리드 시스템을 개발했다.이 시스템은 장식 된 펩타이드가 금 나노 입자의 표면 특성을 변화시켜 다양한 생체 활성 30 , 31 , 32 , 33 을 가질 수있게한다. 이것은 차세대 나노 치료제로서 그들에게 특별한 종류의 약물 (또는 &quot;나노 약물&quot;)을 만듭니다. 이 프로토콜에서는 탐식 면역 세포에서 여러 TLR 신호 전달 경로를 강력하게 억제 할 수있는 새로운 종류의 펩타이드 - 금 나노 입자 (peptide-GNP) 하이브리드를 확인하는 접근법을 제시합니다 32 , </sup&gt; 33 . 이 접근법은 상업적으로 이용 가능한 THP-1 리포터 세포주를 기반으로합니다. 기자 세포는 2 개의 안정한 유도 성 기자 구조로 이루어져있다. 하나는 전사 인자 NF-κB 및 활성화 제 단백질 1 (AP-1)에 의해 유도되는 프로모터의 제어하에 분비 된 배아 알칼라인 포스파타제 (SEAP) 유전자를 보유한다. 다른 하나는 인터페론 조절 인자 (IRFs)에 의해 유도되는 프로모터의 조절하에 분비 된 루시 페라 제 리포터 유전자를 함유한다. TLR 자극시, 신호 전달은 NF-κB / AP-1 및 / 또는 IRFs의 활성화를 유도하며, SEF 및 / 또는 루시퍼 라제를 비밀하기 위해 리포터 유전자를 활성화시킨다. 이러한 이벤트는 분광 광도계 또는 루미넌스로 대응하는 기질 시약을 사용하여 쉽게 검출 할 수 있습니다. 이전에 확립 된 peptide-GNP 잡종 라이브러리를 스크리닝하기 위해이 방법을 사용하여 우리는 TLR4 신호 전달 경로를 강력하게 억제 할 수있는 납 후보 물질을 동정했다. 리드 펩티드 -그런 다음 GNP 잡종을 면역 블로 팅의 또 다른 생화학 적 접근법을 사용하여 검증하고 다른 TLR 경로를 평가했다. 이러한 접근법은 TLR 신호 전달 경로를 표적으로하는 신규 약제의 신속하고 효과적인 스크리닝을 가능하게한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>THP-1-XBlue reporter cell</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>thpx-sp</td>
			<td>keep cell culture passage under 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1-Dual repoter cell</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>thpd-nfis</td>
			<td>keep cell culture passage under 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 (no L-glutamine)</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>SH30096.02</td>
			<td>Warm up to 37 &#176;C before use; add supplements to make a complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (qualified)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12484028</td>
			<td>Heat inactivated; 10% in RPMI-1640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30034.02</td>
			<td>2 mM in the complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>1 mM in the complete medium R10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, 1X, without calcium, magnesium</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>Use for cell washing and reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUANTI-Blue</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>rep-qb1</td>
			<td>SEAP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUANTI-Luc</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>rep-qlc2</td>
			<td>Luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-zn-1</td>
			<td>Selection antibiotics for reporter cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>anti-bl-1</td>
			<td>Selection antibiotics for reporter cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO) for molecular biology</td>
			<td>Sigmal-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>Use for reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for molecular biology</td>
			<td>Sigmal-Aldrich</td>
			<td>P1585-1MG</td>
			<td>Use for cell differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli K12</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-eklps</td>
			<td>TLR4 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pam3CSK4</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-pms</td>
			<td>TLR2/1 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly (I:C) HMW</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-pic</td>
			<td>TLR3 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flagellin from S. Typhimurium (FLA-ST), ultrapure</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-epstfla</td>
			<td>TLR5 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax Plus 384 microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Read colorimetric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200 Pro multimode microplate reader with injectors</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Read luminiscience</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge 22R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Temperature controlled micro-centrifugator (up to 18,000 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X-15R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Temperature controlled general purpose centrifugator (for cell culture use)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar assay plate, 96-well white with clear flat bottom, tissue culure treated</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3903</td>
			<td>Used for luminiscence assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening bioactive nanoparticles in phagocytic immune cells for inhibitors of toll-like receptor signaling

Toll-like receptor (TLR) 반응의 약리학 적 조절은 많은 염증성 질환의 치료에 큰 도움이됩니다. 그러나, TLR 신호 전달을 약화시키기 위해 지금까지 이용 가능한 제한된 화합물이 있으며, 임상 적으로 임상 적으로 승인 된 TLR 억제제 (항 말라리아 약물 하이드 록시 클로로퀸)는 없다. 나노 기술의 급속한 발전에 비추어, 나노 장치를 이용한 면역 반응의 조작은 이러한 질병을 치료하기위한 새로운 전략을 제공 할 수 있습니다. 본 발명자들은 식세포 면역 세포에서 TLR 신호 전달을 억제하는 신규 한 생체 활성 나노 입자를 신속하게 동정하기위한 고 처리량 스크리닝 방법을 제시한다. 이 스크리닝 플랫폼은 표색계 및 루시퍼 라제 분석법을 갖춘 THP-1 세포 기반 리포터 세포를 기반으로합니다. 리포터 세포는 두 개의 유도 성 리포터 구조물의 안정한 통합에 의해 인간 THP-1 단핵구 세포주로부터 조작된다. 하나는 분비 된 배아 알칼리 포스파타제 (SEAP) 유전자를 발현한다(NF-κB 및 AP-1에 의해 유도되는 프로모터의 조절하에), 다른 하나는 인터페론 조절 인자 (IRFs)에 의해 유도 가능한 프로모터의 조절하에 분비 된 루시퍼 라제 리포터 유전자를 발현한다. TLR 자극에 따라, 이어서 상응하는 기질 시약을 사용하여 검출 할 수있는 SEAP 및 / 또는 루시퍼 라제를 생산할 수있다. 이전의 연구에서 확립 된 펩타이드 - 금 나노 입자 (GNP) 하이브리드 라이브러리를 예로 들면 본 발명자들은 프로토 타입 리간드 인 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)에 의해 유발 된 TLR4 신호 전달 캐스케이드의 두 팔을 효과적으로 억제 할 수있는 펩티드 - GNP 하이브리드를 확인했다. 연구 결과는 면역 블로 팅을 포함한 표준 생화학 기술로 검증되었습니다. 추가 분석 결과,이 납 하이브리드는 TLR2, 3, 4 및 5를 비롯한 여러 TLR 경로에 작용하는 광범위한 저해 스펙트럼을 가지고 있음이 입증되었습니다.이 실험적 접근 방식은ra nanoparticle (또는 다른 치료 화합물)은 식균 성 면역 세포에서 특이 적 TLR 신호 전달을 조절할 수있다.

전체 실험 접근법은 그림 1에 나와 있습니다. 두 개의 THP-1 리포터 세포주 인 THP-1-XBlue와 THP-1-Dual은 각각 NF-κB / AP-1 및 IRF의 활성화를 조사하여 TLR 반응을 빠르게 스크리닝합니다. NF-κB / AP-1의 활성화는 SEAP 표색 분석에 의해 검출 될 수있는 반면, IRF 활성화는 루시퍼 라제 발광에 의해 모니터링된다. 단핵 세포 THP-1 세포는 선천성 식세포 면역 세포에 ?...

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Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

Toll-like receptor (TLR) 신호 전달은 많은 인간 염증성 질환의 병태 생리학에서 중요한 역할을하며, 생체 활성 나노 입자에 의한 TLR 반응을 조절하는 것은 많은 염증성 질환에서 유익한 것으로 기대된다. THP-1 세포 기반 리포터 세포는 TLR 신호 전달의 새로운 억제제를 확인하기위한 다양하고 강력한 스크리닝 플랫폼을 제공합니다.

Toll-like Receptor Signaling의 억제제에 대한 식세포 면역 세포에서의 생체 활성 나노 입자의 스크리닝

Pharmacological regulation of Toll-like receptor (TLR) responses holds great promise in the treatment of many inflammatory diseases. However, there have ...

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12.3K 조회수.  Shanghai Jiaotong University School of Medicine.  Toll-like receptor (TLR) 신호 전달은 많은 인간 염증성 질환의 병태 생리학에서 중요한 역할을하며, 생체 활성 나노 입자에 의한 TLR 반응을 조절하는 것은 많은 염증성 질환에서 유익한 것으로 기대된다. THP-1 세포 기반 리포터 세포는 TLR 신호 전달의 새로운 억제제를 확인하기위한 다양하고 강력한 스크리닝 플랫폼을 제공합니다. 

비디오: Screening Bioactive Nanoparticles in Phagocytic Immune Cells for Inhibitors of Toll-like Receptor Signaling

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

면역 결함 마우스의 확립과 인간 Retinoblastoma 종양의 전파

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

연구

의학

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be addressed as a matter of great urgency1-4. Multiple complementary 'omics' approaches have provided clues as to the genetic risk factors and pathogenic mechanisms underlying numerous neurodegenerative diseases, but most findings still require functional validation5. For example, a recent genome wide association study for Parkinson's Disease (PD), identified many new loci as risk factors for the disease, but the underlying causative variant(s) or pathogenic mechanism is not known6, 7. As each associated region can contain several genes, the functional evaluation of each of the genes on phenotypes associated with the disease, using traditional cell biology techniques would take too long. 
	There is also a need to understand the molecular networks that link genetic mutations to the phenotypes they cause. It is expected that disease phenotypes are the result of multiple interactions that have been disrupted. Reconstruction of these networks using traditional molecular methods would be time consuming. Moreover, network predictions from independent studies of individual components, the reductionism approach, will probably underestimate the network complexity8. This underestimation could, in part, explain the low success rate of drug approval due to undesirable or toxic side effects. Gaining a network perspective of disease related pathways using HT/HC cellular screening approaches, and identifying key nodes within these pathways, could lead to the identification of targets that are more suited for therapeutic intervention.
	High-throughput screening (HTS) is an ideal methodology to address these issues9-12. but traditional methods were one dimensional whole-well cell assays, that used simplistic readouts for complex biological processes. They were unable to simultaneously quantify the many phenotypes observed in neurodegenerative diseases such as axonal transport deficits or alterations in morphology properties13, 14. This approach could not be used to investigate the dynamic nature of cellular processes or pathogenic events that occur in a subset of cells. To quantify such features one has to move to multi-dimensional phenotypes termed high-content screening (HCS)4, 15-17. HCS is the cell-based quantification of several processes simultaneously, which provides a more detailed representation of the cellular response to various perturbations compared to HTS. 
	HCS has many advantages over HTS18, 19, but conducting a high-throughput (HT)-high-content (HC) screen in neuronal models is problematic due to high cost, environmental variation and human error. In order to detect cellular responses on a 'phenomics' scale using HC imaging one has to reduce variation and error, while increasing sensitivity and reproducibility. 
	Herein we describe a method to accurately and reliably conduct shRNA screens using automated cell culturing20 and HC imaging in neuronal cellular models. We describe how we have used this methodology to identify modulators for one particular protein, DJ1, which when mutated causes autosomal recessive parkinsonism21. 
	Combining the versatility of HC imaging with HT methods, it is possible to accurately quantify a plethora of phenotypes. This could subsequently be utilized to advance our understanding of the genome, the pathways involved in disease pathogenesis as well as identify potential therapeutic targets.

We describe a methodology combining automated cell culturing with high-content imaging to visualize and quantify multiple cellular processes and structures, in a high-throughput manner. Such methods can aid in the further functional annotation of genomes as well as identify disease gene networks and potential drug targets.

Neurodegenerative 질병 높은 콘텐츠 심사

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

태아 마우스 모델에서 Bioactive 에이전트의 Intratracheal 관리를위한 소설 외과 접근

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Zebrafish Autochthonous 종양 모델을 사용하여 흑종 조절을위한 검사

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

비정상적인 유사 분열과 관련된 세포의 죽음은 라이브 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

급성 백혈병의 치료에 대한 티로신 키나제 억제제의 전임상 평가

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

유방암 세포에서 에스트로겐 조절 마이크로 RNA의 프로파일

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

소프트 한천 콜로니 형성 분석의 활용은 유방암 세포에서 종양 유발의 억제를 확인하는

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.