이 프로토콜은 흡착 단백질 층에 배양된 리포터 대식세포에서 NF-kappa-B 및 AP-1 활성의 신속한 평가를 가능하게 하고, 톨과 같은 수용체와 같은 세포 신호 경로의 기여, 그 반응에. 이 기술의 주요 장점은 단순성으로, 세포 배양 수퍼나티가 NF-kappa-B 및 AP-1 활성에 대해 간단한 효소 분석법을 사용하여 신속하게 분석할 수 있도록 하는 것입니다. 연기 후드에 20 밀리리터 유리 신발 유리 바이알에 밀리리터 최종 농도 당 20 밀리그램에서 클로로폼PMMA를 용해하여 시작합니다.
유리병에 마그네틱 스터드 바를 넣고 혼합물을 2시간 이상 저어줍니다. 모든 고체가 용해되면 PMMA 용액의 400 마이크로리터를 스핀 코팅에 계획된 조건당 각 보로실리케이트 유리 현미경 슬라이드의 중심으로 옮기고 PMMA를 분당 3, 000 회전에서 2분 동안 슬라이드로 회전시합니다. 그런 다음 스핀 코팅 슬라이드를 70% 에탄올 스프레이 클린 박스에 보관합니다.
다음으로, 생물학적 안전 캐비닛에서 멸균 집게와 무균 기술을 사용하여 PMMA 코팅 슬라이드에 8 챔버 끈적 끈적한 우물을 부착하여 각 끈적 끈적한 우물의 상단에 단단히 눌러 단단히 부착되어 있는지 확인하십시오. 모든 우물이 슬라이드에 부착하고 누출되지 않도록 현미경 슬라이드의 가장자리와 끈적 끈적한 우물을 정렬주의하십시오. 끈이 잘 부착된 슬라이드를 하룻밤 사이에 섭씨 37도에 배양하여 씰을 고정합니다.
그런 다음 다음 다음날 아침 실온에서 60분 동안 각 우물에 200마이크로리터의 세포 배양 등급 내독소가 없는 물을 첨가합니다. 인큐베이션의 끝에서, 물을 흡인, PMMA 코팅을 방해하지 않도록주의 복용. 세척당 1시간 동안 300마이크로리터의 신선한 내독소 가 없는 물로 3회, 남은 용매를 제거하기 전에 12시간 1시간, 24시간 세척을 합니다.
그런 다음 UV는 슬라이드를 30 분 동안 살균합니다. 3T3 세포 용액을 얻으려면 3T3 세포 배양자가 T150 배양 플라스크에서 70 %에 도달하면 PBS의 5 밀리리터로 각 배양을 세척하고 3 7 섭씨당 37도의 동물 기원, 재조합 세포 해리 효소5 밀리리터로 세포를 치료하십시오. 인큐베이션의 끝에서, 부드럽게 배양 당 PBS의 5 밀리리터와 효소를 중화하기 전에 세포를 분리하기 위해 앞뒤로 몇 번 각 플라스크를 기울입니다.
단일 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 해리 된 세포를 풀, 어떤 세포 덩어리를 깰 파이펫을 사용합니다. 계산 후 원심 분리로 세포를 수집합니다. 수퍼내티트를 흡인하고, 신선한 PBS에서 밀리리터 농도당 6개의 세포로 10회 10회에서 세포를 재보페한다.
그런 다음 샘플이 완전히 동결 될 때까지 최소 2 시간 동안 영하 80도 섭씨 냉동고에서 세포를 동결한 후 냉동 셀 용액을 완전히 해동 할 때까지 37도 의 수조에 놓습니다. 톨과 같은 수용체 매개 NF-kappa-B/AP-1 활성에 흡착된 단백질 층의 효과를 평가하기 위해, 적절한 크기의 플라스크에서 기자 대식세포를 70%의 합류로 성장한 후, 적절한 효소 해리 솔루션으로 세포를 분리한다. 분석 배지에서 밀리리터 농도당 5개의 세포로 7.3배 10회 세포를 다시 중단하고, 3개의 튜브 사이에서 균등하게 세포를 알리쿼트한다.
실온에서 60분 동안 TLR4 억제제의 밀리리터 당 1마이크로그램으로 세포의 첫 번째 튜브를 치료하고, 실온에서 30분 동안 안티 TLR2 항체의 밀리리터당 50마이크로그램으로 제2 튜브를 치료하고, 제3관을 실온에서 30분 동안 치료하지 않고 실온에서 둡니다. 세포가 배양하는 동안, 200 개의 소 리터와 10 %의 태아 소 혈청을 조건당 3 개의 끈적 끈적한 우물에 추가하십시오. 단백질이 적절한 실험 기간 동안 섭씨 37도에서 흡착되도록 허용한 후, 각 우물에 대한 새로운 파스퇴르 파이펫으로 단백질 용액을 흡입하고 세척당 5분 동안 250마이크로리터의 PBS마이크로리터로 끈적끈적한 우물 표면을 세 번 세척할 수 있습니다.
기자 대식세포 치료가 끝나면 각 웰에 200 마이크로리터의 세포 용액을 추가합니다. Pam3CSK4를 회로도에 도시된 TLR2 양성 대조군으로 밀리리터당 150 나노그램의 최종 농도에 추가합니다. TLR4 양성 제어를 위해, 두 개의 우물에 밀리리터 당 1.5 마이크로 그램의 최종 농도에 리포 폴리사카라이드를 추가합니다.
섭씨 37도에서 20시간 후, 20마이크로리터의 상산제20마이크로리터를 96웰 플레이트에 복제하여 20마이크로리터의 분석 매체와 배경 제어가 포함되어 있습니다. 다음으로, SEAP 리포터 분석 시약 200마이크로리터를 각 웰에 추가하고, 37°C에서 2 1/2시간 배양용용 접착제 씰로 플레이트를 덮습니다. 나머지 상체는 끈적끈적한 튜브 당 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고, 원심분리로 잔해를 퇴적시한다.
그런 다음 ELISA에 의한 다운스트림 염증 성 사이토카인 분석을 위해 영하 80도 저장을 위해 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 초중제를 전송합니다. 인큐베이션의 끝에서, 플레이트에서 접착제 씰을 제거하고, 635 나노미터에서 플래터 판독기의 흡광도를 읽습니다. PMMA 코팅 현미경 슬라이드를 70%에탄올로 1시간 동안 담그면 PMMA 코팅이 제거되고 70% 에탄올이나 UV 살균은 fPTFE 코팅 커버립의 물 접점 각도에 영향을 미치지 않습니다.
3T3 lysates의 서양 얼룩 분석은 HMGB1과 열 충격 단백질 60, 2개의 잘 문서화된 손상 관련 분자 패턴의 존재를 보여줍니다. 폴리머 표면에 용해에서 TLR 리간드의 흡착은 단백질 흡착 폴리머 표면에 20 시간 동안 기자 대식세포를 배양한 다음 효소 분석법을 통해 NF-kappa-B/AP-1 활성을 간접적으로 평가함으로써 확인할 수 있다. 이러한 활성은 TLR2 또는 TLR4 신호의 억제에 따라 감소된다.
또한, 리포터 대식세포는 흡착된 FBS 또는 플라즈마에 비해 흡착된 용액에 대응하여 NF-kappa-B/AP-1 활성을 크게 증가시켰으며 사전 흡착된 단백질은 없습니다. 또한, 혈청에서 희석된 소량의 리세이트유도는 혈청에 비해 NF-kappa-B/AP-1 응답이 현저히 증가하며, 중합체 표면에 의존하는 가장 낮은 유효 희석을 유도한다. 코팅 된 표면의 내독소 오염을 방지하기 위해 깨끗한 영역에서 작업하고 사용하지 않을 때 표면을 덮고 세포 배양 등급의 물과 버퍼를 헹구십시오.
이 절차에 따라, 면역 분석은 단백질 분비를 평가하기 위해 나머지 초중질제에서 수행될 수 있고, 대식세포는 혈류 세포측정 및 qPCR 유전자 발현 분석에 의해 분석될 수 있다.
