본 프로토콜은 궤도 셰이커 모델을 사용하여 투명 응력 응용을 위해 내피 세포 성장을 6웰 플레이트의 특정 영역으로 제한하는 코팅 방법을 설명합니다. 내피성에 대한 흐름의 효과를 연구하는 일반적인 방법은 궤도 셰이커에 다중 잘 배양 판에서 내피 세포를 배양하는 것입니다. 궤도 셰이커는 우물 주위를 회전하는 파도를 유도합니다.
우물의 중심에 있는 세포는 죽상 경화증으로 이끌어 내는 것으로 생각되는 흐름의 종류를 경험합니다. 보호로 생각 되는 가장자리 경험 흐름에 가까운 세포. 각 영역에 있는 세포의 속성은 그(것)들이 경험하는 깎아지른 듯한 응력에 달려 있는 가정됩니다.
그러나 이 논리에는 잠재적인 바닥이 있습니다. 내피 세포는 흐름 의존적 방식으로 중재자를 방출합니다. 이 중재자는 소용돌이 치는 매체에 있는 균일한 농도에 도달하고 그러므로 풀어 놓인 것 보다는 다른 지역에 있는 세포에 영향을 미칩니다.
이는 전단이 세포 행동에 미치는 실제 효과를 손상시키거나 숨길 수 있습니다. 효과는 소용돌이 잘 시스템에 국한되지 않습니다. 병렬 플레이트 흐름 챔버와 같은 간단한 모델에서도 발생할 수 있습니다.
그것은 시스템의 한 부분에서 세포를 성장하 여 피할 수 있다. 여기서는 중앙또는 소용돌이의 가장자리에서만 셀 접착을 허용하는 방법을 설명합니다. 스테인레스 스틸 모듈의 제조.
제공된 엔지니어링 도면에 따라 316등급 스테인리스 스틸에서 스테인리스 스틸 모듈을 제작합니다. PDM의 3D 프린팅은 제공된 엔지니어링 도면에 따라 SOLIDWORKS를 사용하여 PDM 금형의 3D CAD 모델을 준비합니다.
CAD 모델을 STL 파일로 내보내고 STL 파일을 큐라 2.6.2로 가져옵니다. 모델을 초당 50밀리미터의 인쇄 속도로 레이어로 슬라이스하고 60%의 채우기 밀도가 있는 레이어로 모델을 GCode로 내보냅니다. 인쇄를 위해 Ultimaker 3D 프린터에 업로드했습니다.
폴리락산을 인쇄 재료로 사용하십시오. PDMS 링의 주조. PDMS 베이스와 경화제를 90.9%의 염기및 9.1%의 경화제의 비율로 잘 섞는다.
잘 혼합된 용액을 3D 프팅 금형에 붓습니다. 진공 탈기 챔버에서 거품을 제거합니다. 80도 용광로에서 1 시간 동안 치료하십시오.
PDMS 링이 실온으로 냉각되도록 합니다. 그런 다음 경화 된 PDMS 링을 금형에서 조심스럽게 제거하십시오. 1%의 플로론 F-127 의 준비.
푸론 F-127의 5 그램을 무게. 유리 병에 붓습니다. 그런 다음 유리 병에 밀리-Q 물 100마리를 넣습니다.
이것은 5 % 플로론 F-127 솔루션을 제공합니다. 모든 플로론 F-127 분말이 물에 잠겨 있는지 확인합니다. 액체 살균 주기 프로그램을 사용하여 캡을 닫고 자동 복제합니다.
사용 전에 실온으로 용액을 식히십시오. 오토클레이브 밀리-Q 물 40mil에 5%의 플로론 F-127 용액 10mil을 추가하여 1%의 플로론 F-127 솔루션을 만듭니다. 바이오 세이프티 캐비닛 후드에서 희석을 수행합니다.
실온에서 1%와 5%의 플로론 F-127을 모두 보관하십시오. 6 웰 플레이트의 코팅. 자동 클러브 스테인레스 스틸 모듈, PDMS 링 및 핀셋을 사용하기 전에 사용할 수 있습니다.
BSC 후드에서 모든 후속 절차를 수행하고 멸균을 보장하기 위해 무균 기술을 관찰하십시오. 핀셋을 사용하여 PDMS 링을 6웰에 배치합니다. PDMS 링의 외부 림을 사용하여 PDMS 링을 웰 내에서 동심으로 정렬합니다.
참고, 비 조직 배양 처리 웰 플레이트만 사용해야 합니다. 핀셋을 사용하여 PDMS 링 위에 스테인레스 스틸 모듈을 놓습니다. 내부 고정 링 펜치의 팁을 고정 링의 그립 홀드에 삽입합니다.
홀더를 짜서 고정 링의 직경을 줄입니다. 6-well에 넣고 스테인레스 스틸 모듈에 단단히 누르고 펜치를 방출하여 PDMS 링을 웰에 고정시하십시오. PDMS 링 및 스테인레스 스틸 모듈의 개방을 통해 관심 영역에 따라 마이크로 리터 섬유 네틴 당 5 마이크로 그램의 1 마일을 우물의 중심 또는 가장자리에 추가합니다.
섬유넥틴 용액이 관심 의 모든 영역을 커버 할 수 있도록 플레이트를 소용돌이. 95%의 공기와 5%CO2 미만의 가습 인큐베이터에서 37도에서 30분 동안 배양하십시오. 우물에서 섬유네틴 용액을 제거합니다.
그리고 지금 PBS와 두 번 씻어. 완료되면, 완전히 우물에서 PBS를 제거합니다. 웰에서 고정 링, 스테인레스 스틸 모듈 및 PDMS 링을 제거합니다.
1.5 mil의 1%플루론 F-127을 우물에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양하여 코팅되지 않은 표면을 통과합니다. 플루론 F-127 용액을 우물에서 제거하고 PBS로 세 번 세척하십시오. 씻으면 코팅된 코팅을 즉시 사용하거나 코팅된 PBS 층과 함께 최대 4도까지 보관하십시오.
내피 세포의 파종. 혈혈계및 종자(180, 000)를 사용하여 세포를 전온 세포 배양 배지의 1.5mil에서 코팅된 6웰 플레이트로 카운트한다. 우물 판을 측면으로 흔들어 세포가 우물에서 균등하게 분포되도록 합니다.
하룻밤 사이에 95%의 공기와 5%의 CO2 아래에서 37도 가습 인큐베이터에 둡니다. 궤도 셰이커를 사용하여 전단 응력 응용 프로그램입니다. 세포는 성장의 3 일 후에 합류에 도달해야 합니다.
배지를 사전 경고 세포 배양 배지의 1.9 mil로 교체하여 2밀리미터의 높이를 달성한다. 가습된 인큐베이터에 궤도 셰이커의 플랫폼에 우물 판을 놓고 3 일 동안 150 RPM에서 소용돌이. 선택 사항, 전단의 이틀 후, 사이토카인은 세포 배양 배지에 첨가하여 사이토카인과 깎아지른 듯한 스트레스 사이의 상호 작용을 조사할 수 있다.
치료 후, 다른 하루 동안 세포를 전단. 이 연구에서는, TNF-알파세포를 활성화하기 위하여 이용되었다. 전단 응력 적용 3일 후에 분석을 수행합니다.
현미경 이미지는 Pluronic F-127이 섬유넥틴 코팅없이 지역에 HUVEC 접착을 방지한 것을 보여줍니다. 24시간 후, 그림 A에서 72시간, 그림 C에서, 32시간 후, 푸론 F-127의 통과 전에 섬유네틴으로 전처리되지 않은 우물 표면의 일부에 HUVEC가 부착되지 않았다. Pluronic F-127 패시베이션없이, HUVECs는 섬유 네틴없이 표면에 부착되었다, 파종 후 24 시간, 그림 B에서, 그리고 72 시간 더 증식, 그림 D.에서 스케일 바는 500 마이크로미터에 동일하다.
핵 붉은 얼룩은 전체 우물의 가장자리에, 중앙에, A, 및 B의 형태를 보여줍니다. 스케일 바는 백 마이크로미터와 같습니다. A와 B는 또한 ZO-1의 면역 염색에 의해 묘사된 세포 윤곽을 보여줍니다.
모서리에 있는 셀의 정렬 및 신장은 중앙에 있지 않습니다. 그것은 핵 형상 지수에 유의한 차이를 보여줍니다, 전체 잘 자란 HUVEC 사이의 둥근을 나타내는 및 분할 된 우물 치료 또는 TNF 알파 처리 HUVECs에 대한 볼 수 있었다. 세포는 우물의 가장자리 근처에 더 길었다.
TNF 알파 처리 HUVECs에서 더 큰 신장에 대한 경향은 위치에 걸쳐 일관되게 중요하지 않았다. 다른 방사형 위치에서 A, 처리되지 않은 및 B, TNF 알파 처리 HUVECs의 밀도 수에서 전체 및 분할 된 우물 사이에는 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다. 두 경우 모두, 우물의 중심보다 가장자리에 단위 영역 당 더 많은 세포가 있었다.
결론적으로, 우리가 여기에서 설명한 방법은 플라스틱 기반 세포 배양 시스템의 소용돌이 또는 실제로 한 영역에서 세포를 성장시킬 수 있습니다. 즉, 한 유형의 흐름을 경험하는 한 부분의 세포는 다른 흐름이 발생하는 다른 영역에서 세포에서 방출되는 중재자에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 의미합니다. 뿐만 아니라, 우리는 세포가 그밖 지구에서 성장되거나 없이 한 지역에서 성장한 세포를 볼 수 있습니다.
이를 통해 이러한 수용성 중재자의 효과를 입증할 수 있습니다. 순진한 세포에 조건부 배지의 효과 테스트 는 동일한 것을 허용. 조건 매체를 분석함으로써, 중재자를 식별할 수 있다.
