이 작품은 취리히 대학, IEF 마리 퀴리 그랜트에 의해 지원 되었다 (no를 부여 합니다. 아에 TransEpigen-254797), 유럽 연구 위원회의 고급 부여 (부여 없음. U.G.를 MEDEA-250358), 그리고 SystemsX.ch, 시스템 생물학에서 스위스 이니셔티브에서에서 연구 및 기술 개발 프로젝트 (그랜트 U.G.에 MecanX).

1. 꽃과 Silique 고정
<ol><li>수확 꽃과 식물에서 siliques 첫 번째 꽃의 개통에 동기화. 참고: 여기에 사용 된 실험 조건에서 식물 시작 重와 Skoog (MS)에서 토양에 이식 후 약 21 일 꽃. 씨앗은 4 ° C에서 3-4 일에 대 한 층 화와 출 아 했다/성장 22 ° C/16 h 빛과 18 ° C/8 h에서 MS 접시에 어두운 (그림 1) 동일한 조건 하에서 보관 하는 냄비에 영양분이 풍부한 토양에 묘 종을 이식 하기 전에 8 ~ 10 일 동안. 복제의 수는 특정 연구 목적에 따라 달라 집니다 하지만 각 치료에 대 한 (5 개별 공장)에서 5 inflorescences의 최소 권장 합니다. 꽃은 실험 단위, 복제 당 10 꽃의 최소 권장 합니다.</li>
	<li>Inflorescences 또는 꽃 (그림 1E-H) 작은 위 (예를 들어, 손톱이 위)를 사용 하 여 자르고 (단일 화 서/꽃 고정)을 위한 microcentrifuge 튜브 또는 (대 한 집단 fixations) 원뿔 튜브에 즉시 배치 Carnoy의, 메탄올/아세트산, 또는 FPA50 fixatives 만든 갓 포함 하는 응용 프로그램에 따라 참조 아래 얼음에. 참고: 샘플 해야 합니다 수 완전히 침수는 정착 제에.</li>
	<li>4 ° c.에서 하룻밤에 4 h에 대 한 정착 액 내 조직을 두고합니다 참고: 진공 침투는 조직으로, 속도 정착 액의 침투를 위해 사용 될 수 있지만이 조직의 구조를 보존 될 수 있습니다. 저자는 진공 침투를 구현 하지 마십시오.</li>
	<li>정착 액 제거 샘플을 충당 하기 위해 충분 한 70% 에탄올을 추가 하 고 적어도 24 h; 4 ° C에 게 반환 샘플이이 솔루션에서 무기한으로 유지할 수 있습니다. 에탄올을 제거한 후 바로 다음 단계로 진행 합니다; 해 부, 또는 SDS 개간입니다.</li>
</ol>2입니다. 아래는 Stereomicroscope 해 부
<ol><li>넣어 갓 지원 위한 작은 페 트리 접시에 배치 하는 시계 메이커의 유리에 70% 에탄올을 했다.</li>
	<li>
장소는 화 서/꽃/silique이에 갓 정착 액 고 바늘으로 집게와 주사기를 사용 하 여 stereomicroscope에서 해 부.
	<ol>
<li>시계 메이커의 유리 또는 에탄올 (권장) inflorescences의 해 부 및 찢 어 떨어져 성숙한 꽃 (sepals, 꽃잎, 오시 수 있습니다가이 단계에서 해 부의 꽃 기관으로 완전히 덮여 수 샘플을 허용 하는 유사한 장치를 사용 하 여 )을 밖으로 건조 하는 샘플의 위험을 피하기 위해.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
아래 설명 된 대로 siliques 및 슬라이드에 작은 꽃 봉 오리를 해 부.
	<ol>
<li>사전 처리 샘플 시계 메이커의 유리를 치워 고 최종 해 부에 대 한 정상적인 슬라이드를 사용 합니다.</li>
		<li>슬라이드에 관심의 샘플을 이동 하 고 신선한 70% 에탄올의 10 µ L를 추가 합니다. 최종 해 부에 신속 하 게 작업 하 고 샘플 과도 한 액체 없이 촉촉한 유지에 필요한 경우 에탄올, 10 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>Stamens에서 꽃가루 곡물 방출 단계 5.1 참조. Carpels 및 ovules 해 부를 위해 그림 2에 설명 된 절차를 따릅니다. 이 절차는 심 피, 녹색 siliques의 발달의 단계 등의 개발의 모든 단계에 적용 됩니다. 참고: 샘플; 이동에서 충분 한 에탄올 이성 경우 에탄올을 추가 하지 마십시오 아주 작은 샘플을 해 부 하는 것은 액체의 최소한에 훨씬 쉽게입니다. 항상 슬라이드에만 관심 (sepals, 꽃잎, stamens, carpels, ovules, 씨앗, 또는 꽃가루 곡물)의 장기 유지. 이 이렇게는 슬라이드와 시험, 결과 높은 동질성, 그리고 따라서 현미경 검사 (높은 수 대상 표본에 대 한 효율에 따라 장기의 두께 해당 하는 coverslip 간의 균일 한 두께 보장 한다 에 동일한 초점 비행기).</li>
	</ol>
</li>
	<li>압 종이의 작은 조각을 사용 하 여 흡수 하 고 가능한 많은 에탄올을 제거. 신속 하 게 밖으로 샘플 건조 하기 전에 (섹션 3, 4, 또는 6) 다음 단계로 진행 합니다.</li>
</ol>3. Chloral 하이드 레이트-기반 개간 및 결합 된 개간 얼룩
참고: 개간 chloral 하이드 레이트-기반에 대 한 최상의 결과 얻으려면 FPA50 소재 고정으로 얻을 수 있습니다.
<ol><li>솔루션을 비운의 장소 20 µ L (chloral 하이드 레이트/글리세롤, 수정 Hoyer의 매체, 하느님의 4½, 또는 하느님의이 키 4½ 솔루션) 견본-베어링 슬라이드에. 그들 사이 공간을 줄이고 그 대칭 이동 하 여 필요한 경우는 표본 위치 hypodermal 바늘, 주사기의 쌍을 사용 하 여 관심의 기관 아래쪽으로 직면 하는 곳. 바늘을 사용 하 여 모든 나머지 공기 거품을 제거 합니다.</li>
	<li>옆으로 coverslip 낮은 고 부드럽게, 매우 부드럽게 눌러 놓고 개간 솔루션 사이는 공간을 채우는 때까지 기다립니다. 아래는 coverslip 전체 공간을 채우기 위해 필요한 경우 최소한의 개간 솔루션을 추가 합니다.</li>
	<li>슬라이드를 슬라이드 홀더에 놓고 증기 두건에서 그것을 두고. 적어도 4 h 후와 다음 4-5 일 동안 현미경 관찰으로 이동 합니다.</li>
</ol>4. 알렉산더 얼룩과 하느님의 4½ 개간 Anthers의 결합
참고: 원래 알렉산더 프로토콜 기반으로 얼룩이 지기 전에 슬라이드에 꽃가루 곡물을 공개 합니다. 효율적이 고 더 유익한 수정 알렉산더 얼룩 지우기 절차 이며 성숙 하지만 비 dehiscent anthers 내 성숙한 꽃가루 곡물의 얼룩.
<ol><li>Dehiscent 비 anthers 오픈 하려고 갓 수확된 꽃 봉 오리를 선택 합니다. 참고: 알렉산더 얼룩이 지는 성숙한 꽃가루 곡물을 위한 효율적으로 미숙한 꽃가루 곡물을 얼룩이 되지 않습니다 때문에 어린 꽃 봉 오리를 복용 하지 마십시오. 치료에서 다른 식물과 inflorescences 수확 당 5 꽃의 최소 것이 좋습니다.</li>
	<li>꽃 봉 오리를 잠수함 충분 한 알렉산더의 솔루션과 96 잘 접시를 준비 합니다. anthers sepals 및 꽃잎을 제거 하 여 노출 하 고 알렉산더의 솔루션에서 그들을 담가. 1-3 h 연기 후드 샘플을 유지.</li>
	<li>하느님의 4½ 솔루션으로 알렉산더의 솔루션을 대체 하 고 야간 보육에 대 한 증기 두건에서 다시 다 잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 부드럽게 새 슬라이드에 지운된 꽃 봉 오리 이동 합니다. 알렉산더의 솔루션의 일부 월 발생할 수 있습니다 이후 압 지를 사용 하 여 가능한 많은 청소 솔루션을 제거.</li>
	<li>Stamens를 해 부하 고 다른 모든 조직을 제거 합니다. 절의 하느님의 4½ 솔루션을 사용 하 여 3 단계를 따릅니다.</li>
</ol>5. 꽃가루 곡물에서 제거 하는 Exine
참고: DAPI 얼룩에 대 한 Carnoy의 정착 제를 사용 하 여 것이 좋습니다.
<ol><li>섹션 1과 2에에서 설명 된 고정 및 해 부 절차를 따릅니다. 지금까지, 한 70% 에탄올의 최소 금액 내에서 슬라이드에 많은 예를 하나 있어야 한다.</li>
	<li>압 지를 사용 하 여 초과 에탄올을 제거 하 고 DAPI 솔루션의 5-10 µ L를 추가 합니다. 바늘과 주사기의 몇을 사용 하 여, 그 작은 솔루션 (예를 들어, stamen와 꽃가루 곡물을 해제 하는 다른 고정에 사용 한 주사기) 내 꽃가루 곡물 놓습니다. 경우에 솔루션을 밖으로 마르면 DAPI의 또 다른 5 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>Stamen 모든 파편을 제거는 중요 한 단계 같은 슬라이드와는 coverslip 사이 꽃가루 곡물만 남아 있습니다.</li>
	<li>coverslip 견본 베어링 슬라이드에 옆으로 낮추어 놓고 DAPI 솔루션 공간을 작성 하는 데 필요한 최소한의 금액을 추가 합니다. coverslip에 검지 손가락을 놓고 너무 부 수 없이 많은 게 빠르고, 회사, 그리고 짧은 운동 슬라이딩 합니다. 참고: 필요한 힘 및 슬라이딩 움직임의 진폭을 측정 하기 위해이 단계 한다 연습을 여러 번 검사 결과 현미경 때마다.</li>
	<li>필요한 경우 DAPI 솔루션을 추가 하 고 1 h. 넓은 필드 형광 또는 24 h. 이내 confocal 현미경 샘플을 관찰 하는 진행을 15 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 습 한 상자에 슬라이드 SDS 여부 추가 확인을 지우고이 절차를 결합 하려고 하는 장소 개선 사항을 얻을 수 있습니다.</li>
</ol>6. 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 지우기
참고: 분석, 꽃 기관 및 연구자의 기술을 해 부하는 아주 부드럽고 작은 표본에 SDS 처리 실행 될 수 있다 밖으로 하기 전에 (대 한 경험이 풍부한 연구자) 또는 해 부 단계 (덜 경험에 대 한 후 연구원) 메탄올-아세트산 소재 고정에.
<ol><li>시계 메이커의 유리, 오목 슬라이드 또는 microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 1 %SDS 실 온에서 하룻밤 0.2 N NaOH 솔루션 또는 비 해 부 해 부 샘플을 품 어.</li>
	<li>샘플과 매우 부드럽고 투명 한 모양 때문에 관심을가지고 처리 합니다. 물으로 여러 번 씻어. 참고: SDS 솔루션의 나머지 발생할 수 있습니다 강 수는 얼룩 솔루션, 예를들면, 아닐린 블루 추가할 때.</li>
	<li>비 해 부 샘플에 대 한 2, 70% 에탄올 대신 물을 사용 하 여 절에서 설명한 해 부 절차를 따릅니다. 원하는 조직 해 부, 후 잔해와 파편, 및 압 지와 어떤 과잉의 물 제거 후 얼룩 솔루션의 20-40 µ L을 추가 하 고 6.5 단계로 진행.</li>
	<li>해 부 샘플에 대 한 신중 하 게 세척 솔루션에서 샘플을 이동 및 그것 깨끗 한 슬라이드에 놓고 얼룩 솔루션의 20-40 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 옆으로 그것을 낮추는 방법으로 슬라이드에는 coverslip 장소. 알아서 하지 준비 스쿼시. 조직 너무 연약한 경우에, 장소 어떤 얇은 슬라이드 (예를 들어, 테이프 또는 깨진된 coverslip)의 모서리에 coverslip 사이 구분 기호는 coverslip 표본 분쇄 하지 않습니다 되도록 슬라이드 사이의 coverslip, 챔버 같은 공간을 떠나.</li>
	<li>습 한 상자 내에서 모든 슬라이드를 배치, 알루미늄 호 일, 표지 및 적어도 1 h. widefield 형광 또는 24 시간 이내 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 표본 관찰을 진행 4 ° C에서 그것을 배치.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

애기, 모든 꽃 발달 단계에 걸친의 단일 화 서 내의 많은 꽃 봉 오리의 존재 연구 효과 치료의 발달 기능을 특성화 하기 위한 독특한 기회를 제공 꽃 발달의 다른 단계 걸쳐 동시에. 다른 개별 공장 사이 좋은 기준점은 주 화 서의 첫 번째 꽃의 개통. 식물 꽃 동기화 하는 방식으로 처리 됩니다 만큼 가능한 (예를 들어, 4 ° C에서 층 리 동기 씨 발 아 및 따라서 꽃도 더 극대화 하는 3-4 일)...

꽃은 가장 중요 한 중 장기 적의 정의. 꽃 식물 몇 백만 90-130 년 전에 나타나1, 너무 빨리 그들의 급속 한 외관 찰스 다윈2"지독한 미스터리"로 기술 되었다 다양 하 고. 꽃 개발에 대 한 식물 연구자의 관심사는 다양 하다. 일부 연구는 전체, 또는 꽃3,,45,6의 특정 해 부, 구조, 및 기능 속성의 진화로 이해 하는 꽃의 진화 근원에 집중 . 그들에 의존 하는 성적 및 성적 재생산의 모드 뿐만 아니라 꽃 형태와 구조, 높은 변형 꽃 매우 복잡 한 구조를 확인 합니다. 유전 및 분자 조사7과 결합 될 수 있는 빛과 전자 현미경 기술을 사용 하 여 꽃 기관의 해부학 및 구조적 기능을 특성화 하기 위해 다양 한 노력을 주도하 고 있다. 또한, 과일과 씨앗, 소스 꽃은 인간과 동물 영양에 대 한 파라마운트 중요성의 이다. 따라서, 꽃 및 과일 개발의 특성화는 늘어나는 인구와 생태 보존 전략 변화 환경8 아래에 대 한 식량 안보를 포함 하 여 응용된 연구에 대 한 많은 의미는 , 9 , 10.
애기 에 꽃 개발 꽃 유도 및 꽃이 핌 (꽃의 그룹) 분열 조직에 식물 분열 조직의 변환으로 시작합니다. 꽃 primordia 옆 화 서 분열 조직11의 측면에서 시작 됩니다. 꽃 기관 primordia는 꽃의 중심에는 외부에서 동심 whorls에 점차적으로 형성 하 고 결국 sepals, 꽃잎, stamens, 및 carpels7으로 개발. 이러한 꽃 기관의 행 독특한 영양, 보호, 및 기능 (예를 들어, pollinator 매력) 다양 한 식물 종, 남성과 여성의 gametophytes, 각각12 의 개발을 유지 하는 성적인 기관 역할 , 13. gametophytes, 차례 차례로, 각 남성 (정자)의 쌍 차별화와 결합 시 여성 gametes (계란과 중앙 셀), 더블를 다음 세대, zygote, 기본 endosperm 수정 터미널 조직 지원 합니다 배아14,15의 개발. 과일, 종자 개발 성장, 성숙, 그리고 태아와, 결국, 그것의 분산의 보존을 지원 합니다. 광범위 한 연구 모델 종 애기7,,1617에 (서) 특히 다양 한 식물 종, 꽃과 배아 개발 특성화를 수행 하고있다.
꽃 발달의 이른 현미경 분석 시간이 걸리는 샘플 처리 및 파라핀 또는 수 지를 포함, 단면, 등 기법, 결합 빛 또는 전자 현미경 관찰에 근거 했다. 이러한 전통적인 현미경 기술은 돌연변이, 제자리에서 교 잡에 의해 RNA의 지역화 또는 단백질의 면역 검출의 현미경 분석 등 분자 유전자 조사와 함께에서 자주 사용 했다. 넓은 필드와 공초점 형광 현미경 검사 법, 최신의 3 차원 전산 이미지 분석 및 최소 처리 전체 산 표본에 사용 될 수 있는 분자 방법의 지속적인 세련미에에서 최근 진행 상황에 대 한 필요를 주도하 고 있다 효율적이 고 최소 샘플 처리 기술 정량 분석을 우선적으로 받을. 최근 몇 년 동안, 상당한 진행이 했다 전체-산 동물 표본에 개간 기술 개발. 그들은 렌더링 샘플 투명 수성 우 레 아 또는 설탕 기반 약 (예를 들어, 규모, SeeDB, 큐빅)을 사용 하 여18,,1920, 또는 선택적으로 후 (SDS 세제를 사용 하 여) 하는 지질을 제거 하 여 안정적인 hydrogels;에 샘플 포함 지질 제거 될 수 있다 수동 확산에 의해 달성 (예를 들어, 선명도 프로토콜21, 협정-동위-바퀴22수정) 또는 전기 이동 법 (원래 선명도 프로토콜23 , 법-프레스 토24)으로 적극적으로. 이 빠른 진행에 의해 격려 해, 일부 파생된 기술도 등장 하고있다 식물에 사용 하기 위해.
애기모델에 초점을 맞춘이 방법 종이, 우리 꽃 봉 오리, 꽃, 그리고 젊은 siliques의 적절 한 해 부와 다양 한 얼룩에 대 한 전체-마운트 샘플의 비운에 대 한 절차 및 사용 하 여 관찰 절차 설명 클래식 또는 최근 SDS 기반 개간 방법. 전 분, callose, 및 chromatin는 얼룩이 지기에 대 한 예제는 주어진 다. 이러한 절차 개선 및 적응 다른 종이 함께 사용 될 때 추가 해야 할 수도 있습니다, 하지만 그들은 많은 연구 프로젝트의 출발점은이 간단 하지만 중요 한 방법에 추가 연구를 위한 무대를 설정 됩니다 바랍니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET00102500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3686,2500</td>
			<td>100% Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320099</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ME03062500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81910-250 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>51198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>69773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77607-250ML</td>
			<td>We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clove oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8392-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4436.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>57665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malachite Green</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuchsin acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>84600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium di-Hydrogen Phosphate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1047,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>04347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6259</td>
			<td>Fluorescent brightener 28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auramine</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>10120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>19-57030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient-rich substrate</td>
			<td>Einheitserde</td>
			<td>ED73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch maker&#39;s glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No specific brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml falcon centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumond Forceps</td>
			<td>Actimed</td>
			<td>0208-5SPSF-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>DUMONT BIOLOGY</td>
			<td>0108-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD Plastipak 300013</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD Microlance 304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10143562CE</td>
			<td>cut edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>DV40008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humid box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A plastic box with damp paper towel and slide supports inside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixatives</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carnoy&#39;s (Farmer&#39;s) fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol/acetic acid fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPA50 fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clearing solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate/glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Hoyer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herr&#39;s 4&#189; clearing fluid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS/NaOH solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combined clearing and staining solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herr&#39;s IKI-4&#189;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To a standard 4&#189; (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy&#39;s fixative for quantitative starch analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexander staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr&#39;s 4&#189; solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It&#39;s used on freshly harved non-fixed material.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auramine solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor-Auramine mixture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy&#39;s and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate buffer (0.1 M)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques

분자 유전자 연구에 대 한 강력한 도구, 인 애기 thaliana 식물 생물학으로 하 고, 특히, 식물 생식 생물학에서에서 가장 눈에 띄는 모델 종 중 하나입니다. 그러나, 식물 형태학, 해부학, 그리고 ultrastructural 분석 전통적으로 포함 포함 시간과 절차 밝은 필드, 스캐닝, 및 전자 현미경 단면. 공초점 형광 현미경 검사 법, 최신의 3 차원 전산 현미경 분석, 및 최소 처리 전체 산 표본에 사용 될 분자 기술의 지속적인 세련미에 최근 진행 상황에 대 한 수요 증가를 주도하 고 있다 효율적이 고 최소 샘플 처리 기술 개발. 이 프로토콜에서 우리 애기 꽃과 siliques, 기본 기술, 청소를 제대로 해 부에 대 한 기술 설명 그리고 일부 얼룩 절차 전체-마운트의 생식 구조 관찰.

애기 는 corymb (그림 1)에서 배열 하는 양성 꽃 inflorescences 베어링 Brassicacea 가족에 속한다. 각 꽃에는 4 개의 sepals, 4 개의 꽃잎, 6 예 (4 개의 길고 2 개의 짧은), 및 4 개의 동심 whorls25,26에 배열 두 선천적인 융합된 carpels (그림 1 층-H)로 구성 된 syncarpous gynoecium는 있다. <...

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Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

전체-마운트 고 애기 꽃 기관 및 Siliques의 얼룩

이 프로토콜에서 우리 애기 꽃과 siliques, 몇 가지 기본적인 개간 기술의 적절 한 해 부에 대 한 기법을 설명 하 고 생식 구조의 전체 마운트 관측에 대 한 절차를 얼룩이 지기 선정.

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

whole-mount-clearing-staining-arabidopsis-flower-organs

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

16.6K 조회수.  University of Zurich. 이 프로토콜에서 우리 애기 꽃과 siliques, 몇 가지 기본적인 개간 기술의 적절 한 해 부에 대 한 기법을 설명 하 고 생식 구조의 전체 마운트 관측에 대 한 절차를 얼룩이 지기 선정.

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Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

오르간 문화와 마우스 Wolffian 덕트의 전체 마운트 면역 형광 염색법

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

연구

발생학

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

애기 장대 꽃 개발의 공 촛점 이미징 라이브

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜<em&gt; 노랑 초파리</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

해 부와 초파리 번데기 난소의 얼룩

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching morphogenesis and patterning, as well as immune cell distribution at a cellular level. The analysis of peripheral nerve and blood vessel anatomical structures in adult tissues provides some insights into the understanding of functional neuro-vascular wiring and neuro-vascular degeneration in pathological conditions such as wound healing. As a highly informative model system, we have focused our studies on adult ear skin, which is readily accessible for dissection. Our simple and reproducible protocol provides an accurate depiction of the cellular components in the entire skin, such as peripheral nerves (sensory axons, sympathetic axons, and Schwann cells), blood vessels (endothelial cells and vascular smooth muscle cells), and inflammatory cells. We believe this protocol will pave the way to investigate morphological abnormalities in peripheral nerves and blood vessels as well as the inflammation in the adult ear skin under different pathological conditions.

Here, we describe a high resolution whole-mount imaging method in the entire adult mouse ear skin, which enables us to visualize branching morphogenesis and patterning of peripheral nerves and blood vessels, as well as immune cell distribution.

성인 귀 피부에 대 한 전체 실장 Confocal 현미경 검사 법: 신경-혈관 분기 Morphogenesis 및 면역 세포 분포를 연구 하는 모델 시스템

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Vestibular 및 청각 감각 기관의 3 차원 Organotypic 문화

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

전체 산 면역 형광 및 교양된 마우스 난소의 여 포 정량화

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...