Bu eser Zürih Üniversitesi tarafından bir IEF Marie Curie Grant desteklenmiştir (Hayır verin. A.H. TransEpigen-254797), Avrupa Araştırma Konseyi gelişmiş verilmesi (Hayır verin. MEDEA-250358 U.G. için) ve bir araştırma ve teknoloji geliştirme projesi (grant MecanX U.G. için) SystemsX.ch, İsviçreli girişimi sistemleri Biyoloji.

1. çiçek ve Silique fiksasyon
<ol><li>Hasat çiçekler ve bitkiler siliques ilk çiçek açılışında senkronize. Not: Burada kullanılan deneysel koşullar altında yaklaşık 21 gün sonra Murashige ve Skoog (MS) plakalar üzerinden ekimi için toprak çiçekli bitkiler başlatın. Tohumları 4 ° C'de 3-4 gündür tabakalı ve germinated/MS plakaları 22 ° C/16 h ışık ve 18 ° C/8 h karanlık 8-10 gün önce besin açısından zengin toprak (şekil 1) aynı koşullarda muhafaza tencere fide dikim, yetiştirilen. Özel araştırma amaçta çoğaltır sayısını bağlıdır, ancak en az 5 çiçek (bitkilerden 5 bireysel) her tedavi için önerilir. Çiçekler deneysel birimi ise 10 çiçek REPLICATE başına en az önerilir.</li>
	<li>Çiçek veya küçük makas (örneğin, tırnak makası) kullanarak çiçek (şekil 1E-H) kesme ve onları hemen bir microcentrifuge tüp (için tek önümüzdeki/çiçek fiksasyon) veya (için toplu tespitlerin) konik tüp yerleştirin taze içeren yapılan Carnoy'nın, metanol/Asetik asit veya FPA50 Fiksajlar (uygulamaya bağlı olarak, aşağıya bakınız) buz üzerinde. Not: Örnekleri tamamen sabitleştirici ve sular altında.</li>
	<li>Mendil sabitleştirici 4 ° C'de bir gecede 4 h içinde bırak Not: Vakum infiltrasyon doku sabitleştirici penetrasyon kadar hızlandırmak için kullanılabilir, ancak bu doku yapısını koruyarak için zararlı olabilir. Yazarlar vakum infiltrasyon uygulamak değil.</li>
	<li>Sabitleştirici kaldırmak, örnekleri karşılamak için yeterli % 70 etanol eklemek ve onları 4 ° c en az 24 saat için dönmek; örnekleri Bu çözümde sonsuza kadar kalabilirsin. Etanol kaldırdıktan sonra hemen bir sonraki adıma geçin; diseksiyon veya SDS takas.</li>
</ol>2. Stereomicroscope altında diseksiyon
<ol><li>Yerine % 70 etanol küçük bir petri destek yerleştirilmiş bir saat maker's cam taze yapılmış.</li>
	<li>
Yer önümüzdeki/çiçek/silique bu taze sabitleştirici yaptı ve bir iğne ile forseps ve bir şırınga kullanarak stereomicroscope altında incelemek.
	<ol>
<li>Bir saat maker's cam veya çiçeklenme diseksiyon ve olgun çiçek (sepals, yaprakları ve bu aşamada disseke ercik can çiçek organlarını parçalıyor (önerilen) etanol ile tamamen kapalı olmak örnekleri sağlar benzer aygıtı ) örnekleri kurumasını önlemek için.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Siliques ve slayt üzerindeki küçük çiçek tomurcukları aşağıda açıklandığı gibi incelemek.
	<ol>
<li>Saat maker's cam önceden işlenmiş örnekleri ile bir kenara bırakıp normal bir slayt için son diseksiyon kullanın.</li>
		<li>Örnek ilgi slayta geçin ve taze % 70 etanol 10 µL ekleyin. Hızla son diseksiyon üzerinde çalışmak ve etanol, 10 µL örnek olmadan aşırı sıvı nemli tutmak gerekirse ekleyin.</li>
		<li>Polen taneleri stamens--dan serbest bırakmak için bkz: adım 5.1. Carpels ve ovules dissekan için Şekil 2' de açıklanan yordamı izleyin. Bu işlem gelişimi karpel yeşil siliques gelişimi aşaması dahil olmak üzere, tüm aşamaları için geçerlidir. Not: Eğer örnekleri hareket yeterli etanol etkilenmişimdir etanol eklemeyin; çok küçük örnekleri dissekan içinde en az bir miktar sıvı daha kolay olur. Her zaman sadece faiz (sepals, yaprakları, stamens, carpels, ovules, tohum veya polen taneleri) organlarının slayt üzerinde tutun. Bu yordam slayt arasındaki coverslip, muayene, bir daha yüksek homojenliği ve böylece verimliliği mikroskobik muayene (daha yüksek sayıda hedef örnekler için sonuçlanan altında organ kalınlığı karşılık gelen bir üniforma kalınlığı sağlayacak aynı odak düzlemi içinde).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Küçük bir Bloting kağıt parçası emer ve mümkün olduğunca çok etanol kaldırmak için kullanın. Hızlı bir şekilde örnek kurur önce sonraki adıma (Bölüm 3, 4 veya 6) geçin.</li>
</ol>3. kloral hidrat tabanlı takas ve kombine takas boyama
Not: En iyi sonuç için takas kloral hidrat tabanlı malzeme sabit FPA50 ile elde edilir.
<ol><li>Çözüm açıklığın yer 20 µL (kloral hidrat/gliserol, değiştirilmiş Hoyer'ın orta, Herr'ın 4½ veya Bay'nın IKI-4½ çözümleri) numune taşıyan slayt üzerinde. Şırınga bir çift hypodermal iğne ile kullanarak aralarındaki boşluğu azaltmak ve o saygısız gerektiği gibi örnekler getirin nerede faiz organı yüzleri aşağıya doğru. Kalan herhangi bir hava kabarcığı iğne kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Bir coverslip yana doğru alt ve yavaşça, yavaşça basarak yerleştirin ve takas çözüm arasındaki boşluğu doldurur kadar bekleyin. En az kliring çözüm, gerekirse coverslip altında tüm boşluğu doldurmak için ekleyin.</li>
	<li>Slayt yer bir slayt tutucu ve duman başlık altında bırakın. Mikroskobik gözlemler sonra en az 4 h ve aşağıdaki 4 – 5 gün boyunca devam edin.</li>
</ol>4. kombine boyama Alexander ve nedir Herr'ın 4½ takas
Not: Özgün Alexander Protokolü boyama önce polen taneleri slayt üzerinde bırakmadan üzerinde dayanır. Bir verimli ve daha bilgilendirici, modifiye boyama ve yordam temizlemek olduğunu olgun ama dehiscent sigara nedir içinde olgun polen taneleri boyama Alexander.
<ol><li>Dehiscent jwiles ile açmak üzere olduğunuz taze hasat çiçek tomurcukları seçin. Not: Alexander boyama olgun polen taneleri için tasarlanmıştır ve verimli bir şekilde olgunlaşmamış polen taneleri leke değil çünkü genç çiçek tomurcukları yapmayız. En az 5 çiçek başına hasat farklı bitki ve çiçek tedavi önerilir.</li>
	<li>96-şey plaka bir çiçek tomurcuğu daldırın için yeterli Alexander'ın solüsyonu ile hazırlayın. Sepals ve yaprakları kaldırarak jwiles ortaya çıkarmak ve onları Alexander'ın çözümde bırakın. Örnek 1-3 h duman başlık altında tutun.</li>
	<li>Alexander'ın çözüm Herr'ın 4½ çözüm ile değiştirin ve geri bir gecede kuluçka için duman başlık altında çok iyi tabak yerleştirin.</li>
	<li>Forseps kullanarak, yeni bir slayt üzerine temizlenmiş çiçek tomurcukları yavaşça hareket. Alexander'ın çözüm bazı etkilenmişimdir oluşabilir beri Bloting kağıt kadar takas çözüm mümkün olduğunca kaldırmak için kullanın.</li>
	<li>Stamens incelemek ve tüm diğer dokulara kaldırın. 3-Herr'ın 4½ çözüm kullanımı bölümündeki adımları izleyin.</li>
</ol>5. kaldırma Exine polen taneleri
Not: Carnoy'nın sabitleştirici DAPI boyama için kullanmanızı öneririz.
<ol><li>1 ve 2 bölümlerinde açıklandığı fiksasyon ve diseksiyon yordamları izleyin. Artık, bir slaytta yer alan en az miktarda % 70 etanol içinde birçok stamens birine olması gerekir.</li>
	<li>Aşırı etanol kaldırmak için Bloting kağıt kullanıp 5 – 10 µL DAPI çözüm ekleyebilirsiniz. Birkaç tane şırınga iğneleri ile kullanarak, polen taneleri içinde çözüm (örneğin, ercik ve diğer polen taneleri serbest bırakmak için hareketsiz için bir şırınga kullanılması) az bu miktarda serbest bırakın. Çözüm kurur, DAPI başka bir 5 µL ekleyin.</li>
	<li>Sadece polen taneleri slayt ve coverslip arasında kaldı böyle ercik tüm enkaz kaldırma önemli bir adım olduğunu.</li>
	<li>Bir coverslip yana düşürerek numune taşıyan slayt üzerinde yerleştirin ve DAPI çözüm boşluğu doldurmak için gereken en az miktarda ekleyebilirsiniz. Coverslip üzerinde bir işaret parmağı yerleştirin ve çok ezici olmadan çok yapmak hızlı, sağlam ve kısa hareket kayar. Not: gerekli kuvvet ve sürgülü hareket genliği ölçmek için bu adımı birkaç kez, sonuçlar her zaman mikroskop altında kontrol icra edilebilir.</li>
	<li>Gerekirse DAPI çözüm ekleyin ve 15 dakika 4 ° C'de karanlık nemli bir kutu içinde Slayt 1 h. örnekleri geniş alanlı floresan veya 24 h içinde confocal mikroskobu altında izlemeye devam etmek için deneyin bu yordamı daha fazla olup olmadığını kontrol etmek için takas SDS ile birleştirmek için yer geliştirmek ments elde edilebilir.</li>
</ol>6. Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) Temizleme
Not: Bağlı olarak çözümlenmesi için çiçek organ ve çok yumuşak ve küçük örnekleri incelemek için araştırmacı becerileri, SDS tedavi (için deneyimli araştırmacılar) ya da daha önce yapılabilir veya diseksiyon adım sonra (daha az deneyimli için araştırmacılar) metanol Asetik asit malzeme sabit.
<ol><li>Bir saat maker's cam, içbükey bir slayt veya bir microcentrifuge tüp disseke veya sigara disseke örneklerinde % 1 SDS ve oda sıcaklığında gecede 0.2 N NaOH çözüm kuluçkaya için kullanın.</li>
	<li>Çünkü örnek çok yumuşak ve şeffaf bir görünüme sahip bakım ile başa. Birkaç kez su ile durulayın. Not: Kalıntıları SDS çözüm için yağış ekleyerek boyama çözüm, örneğin, anilin mavi neden olabilir.</li>
	<li>Sigara disseke örnekleri için Bölüm 2, % 70 etanol yerine su kullanarak açıklanan diseksiyon yordamı izleyin. İstenen doku anatomi sonra herhangi bir kalıntıları ve enkaz ve aşırı su bir Bloting kağıt kaldırmak sonra 20-40 µL boyama çözüm ekleyin ve 6.5 adımla devam edin.</li>
	<li>Disseke örnekleri, dikkatle örnek çamaşır çözümden taşıyın ve temiz bir slayt yerleştirin ve 20-40 µL boyama çözüm ekleyin.</li>
	<li>Yavaşça bir coverslip yana düşürerek slayt üzerinde yerleştirin. Hazırlık squash değil için dikkat ediniz. Doku çok yumuşak ise, öyle ki coverslip örnek ezmek değil herhangi onun köşe (örneğin, teyp veya kırık bir coverslip), coverslip ve slayt arasında ayırıcı olarak ince yer bir odası gibi coverslip ve slayt mesafesi.</li>
	<li>Tüm slaytlar yer nemli bir kutu içinde alüminyum folyo ile kapatın ve en az 1 h. widefield floresan veya 24 saat içinde confocal mikroskobu kullanarak numune izlemeye devam etmek için 4 ° C'de yerleştirin.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Birçok çiçek tomurcukları Arabidopsistüm çiçek gelişim aşamalarında, kapsayan, tek bir önümüzdeki içinde varlığını bir tedavi ya da bir gelişimsel özelliği bir etkisi karakterize yönelik çalışmalar için eşsiz bir fırsat sunuyor aynı anda farklı gelişimin çiçek arasında. Farklı bireysel bitkiler arasında iyi bir referans noktası ana önümüzdeki ilk çiçek açıyor. Bitkiler çiçekli eşitlenir şekilde tedavi edilir (örneğin, 3-4 gün stratifikasyon 4 ° C'de en...

Çiçekler arasında en önemli organları kapalı tohumlular tanımlıyoruz. Çiçekli bitkiler ortaya çıktı bazı 90-130 milyon yıl önce1ve çeşitlendirilmiş hızlı rapid görünüşleri Charles Darwin2tarafından bir "iğrenç gizem" nitelendirildi. Bitki araştırmacılar çıkarlarını çiçek geliştirme çeşitlidir. Bir bütün veya belirli anatomik, yapısal ve işlevsel özellikleri çiçekler3,4,5,6 evrimi çiçek evrimsel kökeni anlamayla ilgili biraz araştırma odaklı . Çiçek formu ve yapısı, hem de onlara, güvenerek cinsel ve eşeysiz üremenin biçimi yüksek değişim son derece karmaşık bir yapı çiçek olun. Çiçek organlarını, genetik ve moleküler İncelemeler7ile kombine edilebilir ışık ve elektron microscopical teknikleri kullanarak anatomi ve yapısal özelliklerini tanımlamak için çeşitli çabalar yol açmıştır. Ayrıca, kaynak, meyve ve tohum, çiçek büyük önem insan ve hayvan beslenmesi için vardır. Bu nedenle, çiçek ve meyve geliştirme karakterizasyonu uygulamalı araştırma, gıda güvenliği için bir artan insan nüfusu ve ekolojik koruma stratejileri değişen çevre8 altında da dahil olmak üzere birçok etkileri vardır , 9 , 10.
Arabidopsis geliştirmede çiçek çiçek indüksiyon ve önümüzdeki (çiçek grubu) meristem için bitkisel meristem dönüşüm başlar. Çiçek primordia yanal önümüzdeki meristem11Açıl başlatılır. Çiçek organ primordia giderek çiçek ortasına dışarıdan konsantrik gözlemleyebileceğiniz form ve sonunda sepals, yaprakları, stamens ve carpels7geliştirmek. Çiçek Bu organların farklı besin, koruyucu ve fonksiyonel (örneğin, tozlayıcı cazibe) yerine farklı bitki türü, erkek ve dişi gametophytes, sırasıyla12 gelişimi sürdürülmesi cinsel organları ile rolleri , 13. gametophytes, buna karşılık, her bir çift erkek (sperm) ayırt etmek ve kadın gametler (yumurta ve merkezi hücre), üzerine birleştirmek çift döllenme nesil, zigot ve birincil endosperm oluşturmak için bir terminal doku destekleyen embriyo14,15geliştirilmesi. Meyve ve tohum geliştirme desteği büyüme, olgunlaşma ve embriyo ve sonunda, onun dağılma korunması. Kapsamlı bir araştırma modeli tür Arabidopsis7,16,17, özellikle farklı bitki türleri çiçek ve embriyo geliştirilmesinde karakterize etmek için yapıldı.
Çiçek gelişiminin erken Mikroskopik analizler zaman alıcı örnek işleme ve gözlem teknikleri, parafin veya reçine katıştırma ve kesit, gibi ışık ya da elektron mikroskobu ile birlikte dayalı idi. Bu geleneksel mikroskobik teknikler kez mutantlar, RNA Yerelleştirme in situ hibridizasyon tarafından veya IMMUNO-algılama proteinlerin microscopical analizleri gibi moleküler genetik araştırmalar ile birlikte kullanılmaya başlanmıştır. State-of--art 3 boyutlu bilgisayar destekli görüntü analizleri ve minimal işlenmiş bütün Dağı numuneler üzerinde kullanılabilir moleküler yöntemler sürekli arıtma geniş alanlı ve confocal floresan mikroskopi son ilerleme için bir ihtiyaç yol açmıştır verimli ve en az bir örnek işleme teknikleri kantitatif analizleri için tercihen mükellef bulunmaktadır. Son yıllarda, önemli bütün Dağı hayvan numune Temizleme teknikleri geliştirme konusunda ilerlemeler kaydedilmiştir. Onlar render örnek şeffaf Sulu üre veya şeker tabanlı reaktifler (örneğin, ölçek, SeeDB, kübik) kullanarak18,19,20, veya seçici (SDS deterjan kullanarak) lipidler sonra kaldırarak örnekleri istikrarlı hydrogels katıştırma; lipidler kaldırılması olabilir pasif Difüzyon tarafından elde (örneğin, değiştirilmiş NETLİK protokolü21, PAKTI-PARS-jantlar22) veya aktif Elektroforez (orijinal NETLİK protokolü23 ve hareket-PRESTO24). Bu hızlı ilerleme tarafından teşvik, türetilmiş bazı teknikler de bitkiler kullanmak için ortaya çıkıyor.
Bu yöntemleri kağıt model Arabidopsisüzerinde duruldu, biz için prosedür çiçek tomurcukları, çiçek ve genç siliques uygun diseksiyon ve tüm montaj örnekleri çeşitli boyama için takas ve gözlem yordamları kullanarak tarif Klasik veya son SDS-esaslı temizleme yöntemi. Nişasta, callose ve Kromatin boyama örnekleri verilmiştir. Her ne kadar bu yordamları daha fazla geliştirmeleri ve diğer türler ile kullanıldığında uyarlamalar ihtiyacınız, onlar için daha fazla araştırma birçok araştırma projelerinin başlangıç noktası olan bu basit ama kritik yöntemlere sahne umuyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ET00102500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3686,2500</td>
			<td>100% Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320099</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>ME03062500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>81910-250 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3783.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>51198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>69773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77607-250ML</td>
			<td>We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clove oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8392-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4436.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>57665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malachite Green</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuchsin acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>84600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td>Molecular Biology Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium di-Hydrogen Phosphate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1047,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>04347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6259</td>
			<td>Fluorescent brightener 28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auramine</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>10120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS medium</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>19-57030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient-rich substrate</td>
			<td>Einheitserde</td>
			<td>ED73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch maker&#39;s glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>No specific brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml falcon centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62406-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumond Forceps</td>
			<td>Actimed</td>
			<td>0208-5SPSF-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>DUMONT BIOLOGY</td>
			<td>0108-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD Plastipak 300013</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD Microlance 304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10143562CE</td>
			<td>cut edges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>DV40008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humid box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A plastic box with damp paper towel and slide supports inside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixatives</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carnoy&#39;s (Farmer&#39;s) fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol/acetic acid fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPA50 fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clearing solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloral hydrate/glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Hoyer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herr&#39;s 4&#189; clearing fluid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS/NaOH solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combined clearing and staining solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herr&#39;s IKI-4&#189;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To a standard 4&#189; (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy&#39;s fixative for quantitative starch analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexander staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr&#39;s 4&#189; solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It&#39;s used on freshly harved non-fixed material.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auramine solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor-Auramine mixture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy&#39;s and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate buffer (0.1 M)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aniline blue solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques

Moleküler genetik araştırmalar onun müthiş araçlar nedeniyle Arabidopsis thaliana bitki Biyoloji ve başta bitki üreme biyolojisi en önemli modeli türlerinden biridir. Ancak, bitki morfolojik, anatomik ve ultrastructural analizler geleneksel olarak zaman alıcı gömme ve yordamlar parlak alan, tarama ve elektron mikroskopi kesit olarak içerir. Confocal floresan mikroskopisi, state-of--art 3-b bilgisayar destekli Mikroskopik analizler ve minimal işlenmiş bütün Dağı numuneler üzerinde kullanılmak üzere moleküler teknikleri sürekli arıtma son ilerleme için artan bir talep yol açmıştır verimli ve en az bir örnek işleme teknikleri geliştirmek. Bu iletişim kuralı ' biz düzgün Arabidopsis çiçek ve siliques, temizleme teknikleri, temel anatomi tekniklerini tanımlamak ve bazı boyama işlemleri için bütün yapılar gözlemleri montaj.

Arabidopsis bir corymb (şekil 1) biseksüel tanzimi ile çiçek taşıyan Brassicacea ailesine ait. Her çiçek dört sepals, dört yaprakları, altı stamens (dört uzun lafın kısası iki) ve dört konsantrik gözlemleyebileceğiniz25,26yılında düzenlenmiş iki doğuştan erimiş carpels (şekil 1F-H) oluşan bir syncarpous gynoecium var. ...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques at JoVE.com

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Bütün Dağı takas ve Arabidopsis çiçek organ ve Siliques boyama

Bu iletişim kuralı, biz teknikleri için uygun diseksiyon Arabidopsis çiçek ve siliques, bazı temel Temizleme teknikleri tarif ve yordamlar yapılar gözlemleri bütün-mount için boyama seçili.

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

whole-mount-clearing-staining-arabidopsis-flower-organs

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

16.6K Görüntüleme.  University of Zurich. Bu iletişim kuralı, biz teknikleri için uygun diseksiyon Arabidopsis çiçek ve siliques, bazı temel Temizleme teknikleri tarif ve yordamlar yapılar gözlemleri bütün-mount için boyama seçili.

Video: Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Gelişim Biyolojisi

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Sineği boyanmasına ile steroidogenik organları ve İnteraktif Organlar görselleştirme için Protokoller<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching morphogenesis and patterning, as well as immune cell distribution at a cellular level. The analysis of peripheral nerve and blood vessel anatomical structures in adult tissues provides some insights into the understanding of functional neuro-vascular wiring and neuro-vascular degeneration in pathological conditions such as wound healing. As a highly informative model system, we have focused our studies on adult ear skin, which is readily accessible for dissection. Our simple and reproducible protocol provides an accurate depiction of the cellular components in the entire skin, such as peripheral nerves (sensory axons, sympathetic axons, and Schwann cells), blood vessels (endothelial cells and vascular smooth muscle cells), and inflammatory cells. We believe this protocol will pave the way to investigate morphological abnormalities in peripheral nerves and blood vessels as well as the inflammation in the adult ear skin under different pathological conditions.

Here, we describe a high resolution whole-mount imaging method in the entire adult mouse ear skin, which enables us to visualize branching morphogenesis and patterning of peripheral nerves and blood vessels, as well as immune cell distribution.

Bütün-Confocal mikroskobu yetişkin kulak cilt için mount: nöro-vasküler dallanma morfogenez ve bağışıklık hücre dağıtım modeli sistemi

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Vestibüler ve işitme duyu organları kültürleri üç boyutlu Organotypic

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Bütün Dağı ayirt ve kültürlü fare yumurtalıklarda folikül miktar

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...