이 작품은 NIH/NHLBI R56 HL128646 및 Mindich 보건 개발 연구소 (MCHDI) (노스다코타)에 ISMMS에 의해 투자 되었다. E.B.는 NIH/NIDCR Traineeship T32 HD075735에 의해 지원 됩니다. 현미경 및 이미지 분석 Tisch 암 연구소의 마운트 시 나이 P30 CA196521-암 센터 지원 그랜트에 의해 부분에서 지원 되는 시내산에서 아이 칸 의학 학교에서 현미경 코어에서 수행 되었다.

여기에서 설명한 모든 방법을 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 아이 칸의과 시내산에서.
 1. 수확 및 처리 심장 초승달 단계 배아 <ol><li>비옥한 스 터 드 남성으로 비옥한 여성 마우스 친구.</li>
	<li>확인 질 결합의 존재에 대 한 플러그 무딘 프로브 또는 집게를 사용 하 여. 플러그 감지 당일 정오 배아 간주 됩니다 하루 (E) (참조 그림 1A 전체 타임 라인에 대 한) 0.5. 
	참고: 플러그 확인 되어야 합니다 아침에, 그들은 하루 내내 손실.</li>
	<li>8 번째 날 (E8.25)의 아침에 희생 임신 댐 공동 2 흡입, 또는 지역 및 기관 규정. 
	참고: 정확한 타이밍 종속 스트레인 수 및 형태에 의해 실험적으로 결정 되어야 합니다.</li>
	<li>발산을 최소화 하 고 지역을 청소 70% 에탄올과 마우스의 복 부를 스프레이. 피부와 체 벽을 통해 복 부 절 개를 수행 하 여는 내장 노출.</li>
	<li>자 궁을 찾아서 동물에서 전체 자 궁 경적을 조심 스럽게 제거 합니다. 자 궁 끝에 진행 하는 동안 자 궁에서 지방 트리밍 한 수 란 관, 위에서 절단 하 여 시작 합니다. 자 궁 경부를 통과 하 고는 다른 수 란 관, 전체 자 궁 출시를 절단의 상단 끝에 계속.</li>
	<li>장소 10 cm에 궁 요리와 성 식 염 수 (PBS, pH 7.4)를 초과 피를 씻어 버퍼링. 서브는 배아를 포함 하는 각 deciduum 사이 mesometrium를 절단 하 여 자 궁 해 부. 신선한 PBS 가진 6 cm 접시에 배아를 전송.</li>
	<li>해 부 현미경을 사용 하 여 미세 집게 (#5) decidual 조직에서 자 궁 조직을 제거.</li>
	<li>사용 하 여 집게, 신중 하 게 태아를 계시 하기 위하여 deciduum의 배아 절반의 팁을 슬라이스. 태아를 밖으로 밀어를 조심 스럽게 태아를 꺼내 deciduum 꼬집어.</li>
	<li>배아 ( 그림 1B)의 형태를 손상 없이 최대한 멀리 extraembryonic 조직 해 부.</li>
	<li>신선한 PBS 가진 1.5 mL 튜브에 배아를 배치 하 고 얼음에 배치를 전송 피 펫을 사용 합니다. 계속 하기 전에 1.7-1.9 나머지 배아에 대 한 반복.</li>
	<li>Aspirate PBS 그리고 PBS 가진 한 번 린스입니다. PBS를 발음. 
	참고: 손상 또는 배아를 건조 하지 않고 가능한 많은 PBS를 제거 하려고 합니다. 솔루션의 수동 제거 모든 단계에서 배아의 손실을 방지 하기 위해 좋습니다.</li>
	실시간에서 1 시간에 대 한 PBS에 <li>수정 배아 4 %paraformaldehyde (PFA) 
	참고: 배아에 고정 될 수 있는 오버 나이트 (O/N) 4 ° c.</li>
	<li>PBS로 3 회 린스입니다. 면역 형광 검사 진행 준비가 될 때까지 4 ° C에서 배아를 유지. 
	참고: 포인트를 일시 중지 합니다. 태아 수 있습니다 안전 하 게 저장 PBS에 4 ° C에서 몇 주 동안.</li>
</ol> 2. 면역 형광 검사 얼룩 참고: 외피 조건 아래 서로 다른 일정에 맞게 조정 될 수 있다. 부드러운 진동 또는 모든 긴 인큐베이션 단계 락의 사용은 권장.
<ol><li>PBS를 제거 하 고 차단 버퍼 (0.5% 사포닌, 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에)의 1 mL을 추가.</li>
	<li>품 어 실시간에 적어도 4 h 이 또한에서 할 수 있습니다 O/N 4 ° c.</li>
	<li>블로킹 버퍼를 제거 하 고 기본 항 체 혼합물 희석 블로킹 버퍼에 추가. O/N 4 ° c.에 품 어 
	참고: 항 체에 대 한 참조 자료 섹션 사용 하 고 희석을 제안 했다. 항 체 희석은 실험적으로 결정 되어야 합니다. 심장 초승달에 대 한 참조 얼룩으로 Nkx2-5의 사용 권장 이며 다운스트림 핵심 이미지 세분화 및 분석 단계.</li>
	<li>포부에 의해 1 차 항 체를 제거.</li>
	<li>1 h 각 0.1%에 대 한 3 번 세척 PBS에 트리톤.</li>
	<li>세척 제거 하 고 차단 버퍼에 희석 하는 이차 항 체 혼합물을 추가 합니다. 실시간에서 3 h에 대 한 품 어 이 또한에서 할 수 있습니다 O/N 4 ° c.</li>
	<li>워시 1 h 각 0.1%에 대 한 3 회 PBS에 트리톤. 이 또한에서 할 수 있습니다 O/N 4 ° c.</li>
	<li>Counterstain 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) PBS에 10 분 대 한 
	참고:이 counterstain 수행할 수 있습니다 동시에 이차 항 체.</li>
	<li>세척 2 번 5 분 각각 0.1%와 PBS에서 트리톤.</li>
	<li>천천히 방지 페이드 설치 미디어 (2 %w / v n-틸 gallate (nPG), 90% 글리세롤, 1 x PBS;에 배아를 일시 중단 자세한 내용은 대 한 참조 자료 섹션). 장착 하기 전에 적어도 1 시간을 equilibrate 수 있습니다. 부드럽게 배아 방지 페이드 솔루션에 수 있도록 주기적으로 튜브 영화. 
	참고: 포인트를 일시 중지 합니다. 배아 마운트 이미지 준비까지 방지 페이드 솔루션에서 며칠 동안 저장 될 수 있다.</li>
</ol> 3. 현미경 검사 법에 대 한 배아를 장착 <ol><li>준비 현미경 슬라이드 더블 막대기 테이프 또는 실리콘 스페이서를 사용 하 여 장착. 더블 막대기 테이프를 사용 하는 경우 5-6 층 약 15-20 m m의 두 개의 병렬 스택 떨어져 확인 합니다. 이 배아를 놓고 coverslip ( 그림 1C) 확보에 충분 한 공간을 떠날 것 이다.</li>
	<li>는 슬라이드 더블 막대기 테이프 사이 안티 페이드의 15 µ L 드롭 장소. 신중 하 게 슬라이드에 하나의 배아를 전송. 
	참고: 둘 이상의 태아를 슬라이드에 배치할 수 있습니다. 그러나, 이후의 방향 단계 더 어려운 여러 개의 배아, 그리고 긴 기간 이미징 사진 표백 될 수 있습니다.</li>
	<li>미세 집게를 사용 하 여 해 부 현미경, 아래 위치 태아는 앞쪽 면 슬라이드의 긴 축에 맞춰 몸 축 슬라이드에서. 그림 1C 장착 설치의 회로도 참조 하십시오.</li>
	<li>신중 하 게 장소는 coverslip 샘플 더블 막대기 테이프의 한 스택에 한쪽을 쉬고 부드럽게 될 때까지 다른 테이프 연락처는 coverslip를 낮은 집게를 사용 하 여. 
	참고: 3.3 및 3.4 단계는 영상에 대 한 배아의 올바른 방향을 위해 중요 합니다. 앞쪽 방향으로 후부 따라 coverslip 낮추어 태아 롤 하지 해야 하 고 심장 초승달 지역 슬라이드 이미지는 거꾸로 한 현미경에 이상적입니다에서 방향이 있을 것입니다.</li>
	<li>는 피 펫을 사용 하 여 추가 방지 페이드 슬라이드 샘플 저장/이미징 동안 밖으로 죽기에서 유지 하는 coverslip 사이 추가.</li>
</ol> 4. Confocal 영상 <ol><li>취득 이미지 보기의 한 필드에서 캡처 전체 심장 초승달 지역에 대 한 수 높은 배율 목표를 사용 하 여. 나이 키스 트 샘플링 속도 사용 하 여 x-y-z 복 치수를 결정. 대부분의 현미경 제조 업체 해야한다는 &#34; 최적화 &#34; 나이 키스 트 샘플링 되도록 버튼. 
	참고: Nkx2-5에 대 한 얼룩는 도움이 여기, 그것 심장 초승달 지역 전체 윤곽을 그리 다 것입니다. 작은 Z 단계 크기 (오버 샘플링) 더 나은 3D 모델링 결과 얻을 것 이다 하지만 확장된 수집 시간 및 몇 가지 샘플에 대 한 표백으로 이어질 수 있습니다.</li>
	<li>이미징 표준 최고의 이미징 방법을 사용 하 여 매개 변수를 설정 합니다. 즉, 가장 낮은 가능한 레이저 강도 사용 하 여 각 fluorophore에 대 한 좋은 신호 대 잡음 비율을 달성 하 고 이득 선택 수준 신호를 흠뻑 젖 게 하지 않고 넓은 동적 범위를 생성 하는 오프셋을. 
	참고: 매개 변수 사이의 직접 비교 샘플 이미지와 일치 수 있습니다. 이것은 다운스트림 3D 분석 및 정량화에 대 한 특히 중요 하다.</li>
</ol> 5. 이미지 분석 및 양적 3D 모델링 참고: 이 프로토콜에 대 한 이미지는 Imaris 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 분석 되었다. 비슷한 분석 대체 패키지를 사용 하 여 있을 수 있습니다. 아래 설명 참조 채널 (즉 Nkx2-5)에 대 한 분석 파이프라인 및 한 실험적인 채널 (즉 YFP) 포함 한다. 추가 채널 단계 반복을 통해 분석할 수 있습니다. 아래 분석을 복제를 사용할 수 있는 제공 된 예제 데이터 집합 되었습니다.
<ol><li>Imaris 경기장 보기에 원시 이미지 데이터 세트를 로드 하 고 Surpass 보기에서 원하는 배아에 대 한 파일을 엽니다. 데이터는 성능 측정 (최대) 모드에서 3 차원 보기에 로드 됩니다. 디스플레이 조정 창을 열고만 참조 채널을 선택 합니다.</li>
	<li>더 좋은 시각화를 위해 필요한 경우 이미지의 임계값을 조정 합니다. 이 분석 조정 감마 신호 대 잡음 비율 세분화를 위한 너무 낮은 경우. 
	참고: 지금까지 있는 비 선형 조정, 감마 보정을 수행 하는 경우에 조정 된 이미지 강도 측정 또는 비교에 사용할 수 없습니다. 이 단계에서 신호 대 잡음 비율을 만족 하지 않으면 더 이미지 사전 처리 (즉, 조명 수정, 가우스 흐림 또는 다른 필터링)을 수행할 수 있습니다. 데이터 집합에 있는 모든 이미지에 대 한 같은 전처리 단계를 수행 해야 합니다 사전 처리를 수행 하려는 경우.</li>
	<li>표면 알고리즘 대화를 사용 하 여 참조 채널에 대 한 새로운 표면을 작성.
	<ol><li>선택은 &#34;만 지역의 관심을 세그먼트 &#34; 확인란.</li>
		<li>경계 상자 영역으로 참조 얼룩에 의해 delineated 관심 (ROI, 즉 심장 초승달 영역) 영역 포함 되도록 조정.</li>
		<li>소스 채널 드롭다운 메뉴에서 참조 채널을 선택합니다. 스무 딩 (z 복 크기와 같음)에 대 한 기본 설정은 일반적으로 충분 하지만 경험적 최적화 필요할 수 있습니다. 이 분석에 대 한 사용 하 여 부드럽게 반 z 복-크기.</li>
		<li>절대 강도 의해 임계 처리 수행입니다. 표면 채널 신호 넘어 확장 되지 않습니다 있도록 조정 슬라이더를 사용 하 여 하한값. 
		참고: 셀 쉽게 delineated 될 수 있는 특정 이미지를 포함 시킬 수 있습니다는 &#34; 개체를 감 동적 분할 &#34; 알고리즘 추가 배경에서 신호를 분리 하.</li>
		<li>복 번호 또는 볼륨 개체를 필터링 하 고 거부 배경 (작거나 Nkx2-5 지역 이외의 지역에서 발견) 개체는 알고리즘 생성 될 수 있습니다. 알고리즘 완료.</li>
	</ol></li> <li>새로 만든된 표면을 사용 하 여 실험 채널에 대 한 마스크 채널을 만듭니다.
	<ol><li>선택 사용 선택은 &#34; 마스크 Sel... ͟ &#34; 편집 창에서 함수.</li>
		<li>관심 (즉 YFP)의 실험적인 채널을 선택합니다. 있는지 확인은 &#34; 마스크를 적용 하기 전에 채널을 중복 &#34; 확인란이.</li>
	</ol></li> <li>디스플레이 조정에 창만 마스크 채널을 선택 합니다. 5.3 5.3.5 단계를 수행 하 여 마스크 채널 새로운 서피스를 생성. 
	참고:이 시점에서 그것은 도움이 될 수 있습니다 3D 모델의 시각화를 촉진 하기 위하여 각 마스크의 모양을 조정: 각 서피스를 선택 하 고 필요에 따라 색상 탭 조정 기본 색상 및 투명도 선택. 표면 색상 중첩 때 병합 하지 마십시오.</li>
	<li>선정 각 표면 체적 데이터를 얻으려면 통계 탭을 선택 합니다. 에 &#34; 상세 &#34; 하위 탭, 선택 &#34; 평균 값 &#34; 드롭-다운 메뉴에서. 생성 된 테이블의 금액 열에 표면의 총 볼륨을 찾을 수 있습니다. 
	참고: 생성 된 표면에 잘못 된 조각 (즉, 배경 신호에서 제외 되지 않습니다 동안 세분화 또는 주요 표면에서 불연속 조각) 있으면 그것은 해야 할 수 있습니다 총 볼륨을 수동으로 계산 또는 볼륨 또는 복의 수에 의해 표면 필터 및 신호 세그먼트에만 계산에 포함 됩니다. 표면의 각 부분에 대 한 볼륨을 선택 하 여 찾을 수 있습니다 &#34; 모든 값 &#34; 드롭-다운 메뉴에서. 해당 영역이 제외 값 결정에 에이즈 노란색 표시 되도록 각 값을 선택 하면.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

위의 프로토콜 후 이식 마우스 배아의 높은 품질의 전체 마운트 면역 형광 이미지에서 양적 데이터를 얻기 위한 전략을 설명 합니다. 올바르게 수행 하는 경우이 단계를 통해 생성 된 3 차원 체적 데이터 태아 내의 여러 도메인의 비교 및 intersectional 분석에 사용할 수 있습니다. 잘 설립 참조 구조에 비해 소설 세포 인구를 조사할 때 설명 하는 접근을 마스킹 표면 신호 특정 사용입니다.
<p class="j...

Organogenesis의 연구는 오랫동안 발전 태아에 전체적 이벤트의 관찰에 의존 했다. 이러한 연구는 자주 정의 참조 인구의 라벨 형광 염료 또는 조합에서 혈통 추적 기자 들의 사용에 의존 합니다. 1 이러한 라벨의 상대적 위치를 비교 하 여 정보 출처, 운동, 또는 관심의 인구의 궁극적인 기여에 얻을 수 수 있습니다. 이식 및 운명 매핑 실험 다음 개발된 배아에 기여에 대 한 검사의 관심, 셀의 시작 지점을 정의 하 형태학 랜드마크 또는 비 운동 계보에 염료의 주입을 사용 합니다. 2 , 3 , 4 , 5 유전 계보 추적 실험 실험 조작 없이 라벨 세포 인구에 사용 되는 잘 정의 된 기자 대립 유전자와 동일한 개념을 사용 합니다. 이러한 접근 키 높은 공간 해상도, 실험의 위치 및 참조 레이블을 확인 하는 기능입니다. 이러한 방식을 사전 이식 개발에 뛰어난 진행 굴복 했다 고 explant organogenesis 연구. 6 , 7 , 8 , 9
심장 morphogenesis 기반이 발달 이벤트 최근 몇 년 동안에서 점점 더 잘 설명 되었습니다. 10 연구의이 분야의 주요 발견 중 하나는 고유 마커의 식에 의해 구별 될 수 있다 조상 인구 수의 설명 이다. 11 이 인구는 첫번째와 두 번째 심장 필드 (FHF SHF), 배아 날 (E) 8.25 마우스 개발에 태아의 앞쪽 측면에서 심장 초승달 내 존재는 포함 됩니다. 12 이 인구 넓은 필드 현미경 검사 법, 면역 형광 분석, 조직 수준 정보 및 직렬 단면화를 제공 하 높은 세포 해상도을 제공의 결합을 통해 검사 자주 2 차원 공간 정보입니다. 13 따라서, 이러한 연구는 크게 고급 심장 개발에 대 한 우리의 이해 하는 동안 사용할 수 있는 방법을 제한 morphogenesis의 깊이 정량 분석에 검사 하는 방법에 대 한 필요성을 만들어,이 단계는 이러한 인구 전체 유기 체 수준에서의 조직.
최근 confocal 현미경 검사 법 및 3D 이미지 분석 허용 셀 및 구조에서 현장에서 의 고해상도 높은 처리량 알고리즘 개조를 비교적 쉽게 따라서 성패 상세한 연구에 대 한 복잡 한 세포 구조입니다. 14 컴퓨팅 파워의 증가와 큰 데이터 관리 알고리즘, 데이터 집합, 이미지의 크기의 지 수 증가 처리 하기 위해 필요한 두 개발 분석 이제 자동화할 수 있습니다 완전히. 15 영상 데이터 세트의 자동 분석 수 있는 이점이 되 고의 편견, 하지만 입력된 데이터 집합;의 품질 안정 그것은 절대적, 다음, 최고의 품질, 편견된 분석을 지키는 모범 사례 수집 및 이미지 사전 처리 하는 동안 사용 됩니다. 16 프로토콜 수 완전히 자동화 되 고 재현성에 대 한 공유와 독점 소프트웨어에 의해 사용 되는 알고리즘은 쉽게 친숙 현대 독점을가지고 과학자 들에 의해 사용 되는 라이브러리를 통해 사용할 수 또는 오픈 소스 개발자 도구입니다. 17
다음 프로토콜 organogenesis, 심장 개발 하는 동안 심장 초승달의 형성에의 한 잘 정의 된 모델에 이러한 분석을 수행 하기 위해 필요한 단계를 설명 합니다. 특히,이 프로토콜 (1) 수확 하는 방법에 설명 합니다 및 심장 초승달 단계 태아를 해 부, (2) 참조 (Nkx2-5)에 대 한 전체 마운트 면역 형광 검사 수행 및 실험 (Foxa2Cre:YFP18,19) 마커, (3) 준비 하 고 배아 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미지 그리고 마지막으로 (4) 분석 하 고 계량 고급 3 차원 접근을 사용 하 여 결과 이미지. 심장 초승달에 적절 한 수정, 예를 들어, 사용 된다 초기 somite 단계 배아를 gastrula에서 여러 계보의 분석을 위해이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Blunt probe</td><td>Roboz</td><td>RS-9580</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8022</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>RPI</td><td>A4490</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Nkx2-5</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-8697</td><td>Used at 1:100-1:500</td></tr><tr><td>Chicken anti-GFP</td><td>abcam</td><td>ab13970</td><td>Used at 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Islet1</td><td>abcam</td><td>ab109517</td><td>Used at 1:100</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Hcn4</td><td>Millipore</td><td>AB5808</td><td>Used at 1:100</td></tr><tr><td>488 anti-chicken</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-546-155</td><td>Reconstituted in water and stored at -20 &amp;deg;C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.</td></tr><tr><td>555 anti-goat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21432</td><td>Used at 1:500</td></tr><tr><td>647 anti-rabbit</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-606-152</td><td>Reconstituted in water and stored at -20 &amp;deg;C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>n-Propyl gallate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2370</td><td>Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution.</td></tr><tr><td>Superfrost Plus microscopy slides</td><td>VWR Scientific</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>22x22 mm coverslips</td><td>VWR Scientific</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 8.4.1</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative whole-mount immunofluorescence analysis of cardiac progenitor populations in mouse embryos

적 발전 이미징 기술 사용 하 여 광범위 하 게 배아 개발의 증가 된 이해에 기여 하고있다. 사전 이식 개발 및 organogenesis는 연구의 두 영역을 크게이 진보, 사전 이식 배아 이미징 또는 vivo 장기 전 직접 얻을 수 있는 데이터의 높은 품질에서 benefitted 있다. 사전 이식 배아는 특히 높은 공간 해상도와 데이터 굴복 했다, 하는 동안 후기 3 차원 개조를 덜 의무가 있다. 운명 매핑 또는 유전 계보 추적 함께 알려진된 미 발달 구조에 대 한 높은-품질 3 차원 또는 체적 데이터를 가져오는 embryogenesis 동안 일어나 전체적 사건의 보다 포괄적인 분석을 위해 수 있게 됩니다.
이 프로토콜 있도록 라벨, 시각화, 및 개발 심장 초승달 내 조상 세포 인구의 정량화에 대 한 키 구조 형성 심장 개발 하는 동안 전체 마운트 면역 형광 접근 방식을 설명 합니다. 접근 같은 디자인은 모두 세포 및 조직 수준의 정보를 얻을 수 있는 방법. Confocal 현미경 검사 법 및 이미지 처리를 사용 하 여이 프로토콜 허용 함으로써 지역화 및 특정 조상 인구 중의 조직 분석 하는 기능을 제공 하는 심장 초승달의 3 차원 공간 재구성 심장 개발의이 중요 한 단계. 중요 한 것은, 참조 항 체의 사용은 심장 초승달의 연속 마스킹 및 초승달 일대의 후속 양적 측정에 대 한 수 있습니다. 이 프로토콜만 초기 심장 개발의 상세한 검사를 사용 하지 않습니다 하지만 적응과 초기 somite 단계 마우스 배아를 gastrula에 대부분 기관 시스템에 적용 되어야 합니다.

최종 데이터 분석의 품질 크게 (1) 무결성과 해 부 배아 및 (2) 높은 특이성 항 체의 사용, (3) 적절 한 설치 매개 변수를 이미징의 형태에 따라 달라 집니다. 손상 된 배아는 표면 생성 프로세스를 혼동 하 고 정량 분석을 방해 합니다. 제대로 해 부 및 무대 태아의 예는 그림 2B에 표시 됩니다. 배아는 항 체 자주 바인딩하는 것입니다 비-특히 노른자위 낭...

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Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

여기, 우리는 전체 마운트 면역 형광 검사 및 초기 단계 마우스 배아의 양적 volumetric 분석 이미지 기반에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 질적 및 양적 개발, 심장 구조를 평가 하 고 다른 기관 체계에 광범위 하 게 적응할 수 있을 수 있습니다 제안에 대 한 강력한 접근으로이 방법을 제시.

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

quantitative-whole-mount-immunofluorescence-analysis-cardiac

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K 조회수.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. 여기, 우리는 전체 마운트 면역 형광 검사 및 초기 단계 마우스 배아의 양적 volumetric 분석 이미지 기반에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 질적 및 양적 개발, 심장 구조를 평가 하 고 다른 기관 체계에 광범위 하 게 적응할 수 있을 수 있습니다 제안에 대 한 강력한 접근으로이 방법을 제시.

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Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

연구

발생학

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are extremely scarce, but expanded CPCs could be useful for cell therapy. A prerequisite for their use is their ability to differentiate in a controlled manner into the various cardiac lineages using defined and efficient protocols. In addition, upon in vitro expansion, CPCs isolated from patients or preclinical disease models may offer fruitful research tools for the investigation of disease mechanisms.
Current studies use different markers to identify CPCs. However, not all of them are expressed in humans, which limits the translational impact of some preclinical studies. Differentiation protocols that are applicable irrespective of the isolation technique and marker expression will allow for the standardized expansion and priming of CPCs for cell therapy purpose. Here we describe that the priming of CPCs under a low fetal bovine serum (FBS) concentration and low cell density conditions facilitates the endothelial differentiation of CPCs. Using two different subpopulations of mouse and rat CPCs, we show that laminin is a more suitable substrate than fibronectin for this purpose under the following protocol: after culturing for 2 - 3 days in medium including supplements that maintain multipotency and with 3.5% FBS, CPCs are seeded on laminin at &#60;60% confluence and cultured in supplement-free medium with low concentrations of FBS (0.1%) for 20 - 24 hours before differentiation in endothelial differentiation medium. Because CPCs are a heterogeneous population, serum concentrations and incubation times may need to be adjusted depending on the properties of the respective CPC subpopulation. Considering this, the technique can be applied to other types of CPCs as well and provides a useful method to investigate the potential and mechanisms of differentiation and how they are affected by disease when using CPCs isolated from respective disease models.

This protocol describes an endothelial differentiation technique for cardiac progenitor cells. It particularly focuses on how serum concentration and cell-seeding density affect the endothelial differentiation potential.

낮은 혈 청 조건 하에서 심장 조상 세포에서 내 피 분화의 유도

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart disease. The development of the primitive cardiac valves involves the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of endocardial cells from the atrioventricular canal (AVC) and outflow tract (OFT) regions of the heart in response to local inductive myocardial and endocardial signals. Once the cells delaminate and invade the extracellular matrix (cardiac jelly) located between the endocardium and the myocardium, the primitive endocardial cushions (EC) are formed. This process implies that the endocardium has to fill the gaps left by the delaminated cells and has to reorganize itself to converge (narrow) or extend (lengthen) along an axis. Current research has implicated the planar cell polarity (PCP) pathway in regulating the subcellular localization of the factors involved in this process. Classically, the initial phases of cardiac valve development have been studied in cross-sections of embryonic hearts or in ex vivo AVC or OFT explants cultured on collagen gels. These approaches allow the analysis of apico-basal polarity but do not allow the analysis of cell behavior within the plane of the epithelium or of the morphological changes of migrating cells. Here, we show an experimental approach that allows the visualization of the endocardium at valvulogenic regions as a planar field of cells. This experimental approach provides the opportunity to study PCP, planar topology, and intercellular communication within the endocardium of the OFT and AVC during valve development. Deciphering new cellular mechanisms involved in cardiac valve morphogenesis may contribute to understanding congenital heart disease associated with endocardial cushion defects.

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Classically, the endocardium of the mouse embryonic valve primordium has been analyzed using transversal, coronal, or sagittal sections. Our novel approach for en face, two-dimensional imaging of the endocardium at valvulogenic regions allows planar polarity and cell rearrangement analysis of the endocardium during valve development.

엔 페이스 마우스 배아에서 평면 형태형성 분석을 위한 심내막 쿠션 준비

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail specific developmental stages in a still snapshot, live imaging captures dynamic morphogenetic events, such as cell migration, shape changes, and differentiation, by imaging the embryo as it develops. This complements fixed analysis and expands the understanding of how organs develop during embryogenesis. Despite its advantages, live imaging is rarely used in mouse models because of its technical challenges. Early mouse embryos are sensitive when cultured ex vivo and require efficient handling. To facilitate a broader use of live imaging in mouse developmental research, this paper presents a detailed protocol for two-photon live microscopy that allows long-term acquisition in mouse embryos. In addition to the protocol, tips are provided on embryo handling and culture optimization. This will help understand key events in early mouse organogenesis, enhancing the understanding of cardiovascular progenitor biology.

We present a detailed protocol for mouse embryo culture and imaging that enables 3D + time imaging of cardiac progenitor cells. This video-toolkit addresses the key skills required for successful live imaging otherwise hard to acquire from text-only publications.

생쥐 배아에서 초기 심장 전구체의 생생한 영상

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

생물학

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

개발 배아 마우스 심장 밸브 지역에서 단백질 분리

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

요약

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배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

단백질 발현의 정량 분석은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

낮은 혈 청 조건 하에서 심장 조상 세포에서 내 피 분화의 유도

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

엔 페이스 마우스 배아에서 평면 형태형성 분석을 위한 심내막 쿠션 준비

생쥐 배아에서 초기 심장 전구체의 생생한 영상

배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출

개발 배아 마우스 심장 밸브 지역에서 단백질 분리

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

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배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

낮은 혈 청 조건 하에서 심장 조상 세포에서 내 피 분화의 유도

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

엔 페이스 마우스 배아에서 평면 형태형성 분석을 위한 심내막 쿠션 준비

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배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출

개발 배아 마우스 심장 밸브 지역에서 단백질 분리

단백질 발현의 정량 분석은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기