이 연구는 미국 국립과학재단(National Science Foundation)의 대학원 연구 펠로우십(Graduate Research Fellowship)의 지원을 받았습니다. DGE-1745301(S.Y.), Pew-Stewart Scholar Award(S.C.), Searle Scholar Award(S.C.), Shurl and Kay Curci Foundation Research Grant(S.C.), Merkin Innovation Seed Grant(S.C.), Mallinckrodt Research Grant(S.C.) 및 Margaret E. Early Medical Research Trust 2024 보조금(SC). 사우스캐롤라이나주는 또한 NIH/NCI의 지원을 받고 있습니다 P30CA016042.

1. 세포 내 단백질 라벨링
<ol><li>원하는 세포주에서 HaloTag에 융합된 관심 단백질을 발현합니다.</li>
	<li>트랜스포손(transposon) 또는 바이러스 형질도입(viral transduction)을 사용하여 1.1과 동일한 유형의 세포에서 Halo-tagged H2B를 안정적으로 발현합니다.</li>
</ol>2. 커버슬립의 준비
<ol><li>세포 배양에 커버슬립을 사용하기 전에 커버슬립을 청소하여 자가형광 오염 물질을 제거하십시오.<ol><li>직경 25mm, #1.5 커버슬립을 세라믹 염색 랙에 장착하고 폴리프로필렌 용기에 넣습니다.</li>
		<li>커버슬립을 KOH의 1M 용액에 완전히 담그고 1시간 동안 초음파 처리합니다.</li>
		<li>커버슬립을 이중 증류수(ddH2O)로 세 번 헹굽니다.</li>
		<li>커버슬립을 100% 에탄올에 완전히 담그고 1시간 동안 초음파 처리합니다.</li>
		<li>커버슬립을 ddH2O로 희석한 20% 에탄올에 완전히 담그고 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 현미경 검사를 위한 세포 준비
알림: 세포의 오염을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 이 섹션의 단계를 수행하십시오.
<ol><li>청소된 커버슬립에 셀을 플레이트합니다. Halo-tagged 단백질이 일시적으로 발현되는 경우 이미징 2일 전에 수행합니다. Halo-tagged 단백질이 안정적으로 또는 내인성으로 발현되는 경우 이미징 1일 전에 수행합니다.<ol><li>멸균 겸자를 사용하여 커버슬립을 6웰 플레이트(세포 샘플당 커버슬립/웰 1개)에 넣고 잔류 에탄올이 증발하도록 합니다.</li>
		<li>이미징 시점까지 70%의 밀도를 달성하기 위해 적절한 수의 세포로 각 웰을 플레이트합니다. 동일한 표적 밀도를 가진 H2B-Halo를 안정적으로 발현하는 세포로 추가 웰을 도금합니다.</li>
		<li>관심 있는 Halo-tagged 단백질을 일시적으로 발현하는 경우에만 이 단계를 따르십시오. 37 °C 및 5 % CO 2 에서 24 시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 적절한 transfection 시약을 사용하고 제조업체의 지침에 따라 tagged 단백질을 인코딩하는 plasmid로 세포를 transfection합니다.</li>
		<li>37 °C 및 5 % CO 2 에서 24 시간 동안 세포를 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>관심 있는 Halo-tagged 단백질을 발현하는 세포를 non-photoactivaable Halo 리간드(예: JFX549)와 photoactivatable Halo 리간드(예: PA-JF646)로 염색합니다. 광활성화 가능한 Halo 리간드만으로 H2B-Halo를 발현하는 염색 세포. 참고: 여기에 나열된 Halo 리간드의 농도는 시작점으로 사용해야 합니다. 최적의 농도는 관심 단백질의 발현 수준과 응축수 내 국소 농도에 따라 달라집니다.<ol><li>관심 있는 Halo-tagged 단백질을 발현하는 각 세포 샘플에 대해 100nM JFX549 Halo 리간드35 및 20nM PA-JF646 Halo 리간드36 을 500μL의 적절한 세포 배지에 희석합니다. H2B-Halo를 발현하는 각 샘플에 대해 500μL의 적절한 세포 배지에 20nM PA-JF646 Halo 리간드만 희석합니다.</li>
		<li>각 웰에 대해 기존 배지를 흡인하고, 1x PBS 2mL를 추가한 다음, PBS를 흡입하고(프로토콜의 나머지 부분에서는 이를 "헹굼"이라고 함) 적절한 Halo 리간드가 포함된 배지로 교체합니다.</li>
		<li>37 °C 및 5 % CO2 에서 1 시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>PBS로 4번 헹구고 Halo 리간드가 포함되지 않은 새 배지로 교체합니다.</li>
		<li>37 °C 및 5 % CO2에서 15 분 동안 배양합니다.</li>
		<li>3.2.4 및 3.2.5 단계를 세 번 반복합니다(총 4번의 헹굼-배양 주기).</li>
		<li>멸균 겸자를 사용하여 세포가 있는 커버슬립을 현미경 스테이지와 호환되는 세포 배양 커버슬립 챔버로 옮깁니다.</li>
		<li>페놀 적색이 없는 배지를 챔버에 추가하고 이미징을 진행합니다. 즉시 이미징되지 않고 필요할 때까지 37°C 및 5%CO2 에서 샘플을 배양합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 단일 분자 이미징
참고: H2B와 관심 단백질의 체류 시간을 측정하는 독립적인 실험은 통계적으로 유의미한 결과를 생성하기 위해 수일(≥3)일에 걸쳐 수행되어야 합니다. 현미경에서 세포 샘플을 이미징하기 전에 0.1μm 염색 마이크로스피어(Table of Materials) 또는 유사한 보정 표준을 사용하여 두 카메라를 정렬합니다.
<ol><li>현미경을 준비합니다.<ol><li>현미경과 현미경을 제어하는 컴퓨터를 켭니다.</li>
		<li>현미경에서 살아있는 세포 배양 구성 요소(히터 및 CO2)를 켜고 37°C 및 5% CO2로 설정합니다. 시스템이 평형을 이룰 때까지 기다립니다.</li>
		<li>현미경의 100x TIRF 오일 이멀젼 대물렌즈에 적절한 오일 한 방울을 떨어뜨리고 세포 샘플을 현미경 스테이지에 로드합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>영상화할 세포를 식별합니다.<ol><li>명시야 조명 아래에서 세포 샘플을 이미지화하고 세포에 초점이 맞춰질 때까지 z 위치를 조정합니다.</li>
		<li>건강한 세포의 형태학적 특성을 나타내는 세포를 식별합니다.</li>
		<li>표적 세포핵만 캡처하도록 시야(FOV)를 자릅니다.</li>
		<li>레이저 조명을 사용하고 단일 분자의 최적 신호 대 잡음비를 갖는 HILO 조명41 이 달성될 때까지 TIRF 각도를 조정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>살아있는 세포의 H2B-Halo를 이미지화합니다. 참고: 이 섹션에 사용된 레이저 출력은 이 실험에만 해당되며 ex로 포함되어 있습니다.amp르. 토론에 나열된 기준에 따라 적절한 레이저 출력을 선택해야 합니다.<ol><li>다음과 같이 획득 구성을 설정합니다. 노출 시간을 500ms로 설정합니다. 각 500ms 노출 동안 PA-JF646 표지된 H2B-Halo 분자를 9.1mW, 640nm 빔으로 여기시킵니다. 프레임 사이의 데드 타임(여기에 사용된 이미징 시스템에서는 158.01μs) 동안 111μW, 405nm 빔으로 분자를 광활성화합니다.</li>
		<li>이 설정에서 2000프레임을 연속으로 캡처합니다. 광활성화 분자의 수가 충분하지 않을 때 획득 과정에서 405nm 빔의 출력을 점진적으로 증가시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>살아있는 세포에서 관심 있는 Halo-tagged 단백질을 이미지화합니다.<ol><li>장역 통과 이색성 미러를 사용하여 PA-JF646을 감지하는 카메라와 JFX549를 감지하는 카메라 간에 방출 파장을 분할합니다. 카메라 앞에 적절한 방출 필터를 사용하십시오.</li>
		<li>4.3.1에 설명된 것과 동일한 획득 구성을 다음 수정과 함께 사용합니다. JFX549 채널을 추가하여 시간 경과에 따른 Halo-tagged 단백질 응축물의 위치를 추적합니다. 10초마다 PA-JF646 채널의 획득을 유지하면서 JFX549 채널에서 하나의 프레임(500ms, 2.1mW, 561nm 여기)을 획득합니다. 이로 인해 PA-JF646 채널로 블리드스루가 발생하며, 이는 획득 후 데이터 분석에서 처리됩니다.</li>
		<li>이 설정에서 2000프레임을 연속으로 캡처합니다. 광활성화 분자의 수가 충분하지 않을 때 획득 과정에서 405nm 빔의 출력을 점진적으로 증가시킵니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 단일 분자 이미징 데이터 분석
참고: 섹션 5 전체에서 사용된 매개변수는 이 실험에만 해당되며 예제로 포함되어 있습니다. 토론에 나열된 기준에 따라 적절한 매개 변수를 선택해야 합니다.
<ol><li>처리를 위해 원시 이미징 데이터를 준비합니다.<ol><li>관심 단백질 데이터의 경우 ImageJ 또는 유사한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 원시 이미징 데이터 파일의 각 채널을 독립적인 .tif 파일로 변환합니다. H2B 데이터의 경우 동일한 방식으로 원시 이미징 데이터 파일의 단일 채널을 .tif 파일로 변환합니다. 참고: 사용 중인 획득 소프트웨어에 따라 10초마다 하나의 응축수 추적 프레임만 촬영되므로 응축수 동영상에 빈 프레임이 있을 수 있습니다. 빈 프레임은 가장 최근의 응축수 프레임으로 채워야 합니다(일부 수집 소프트웨어는 자동으로 이 작업을 수행함). 또한 응축수 추적 프레임 동안 응축수(JFX549) 채널에서 단일 분자(PA-JF646) 채널로 상당한 블리드스루가 있는 경우 해당 단일 분자 프레임을 가장 최근의 단일 분자 프레임으로 교체해야 합니다.</li>
		<li>위와 같은 이유로 두 동영상 중 하나에서 교체해야 하는 프레임이 있는 경우 Chong et al.1에서 사용할 수 있는 ImageJ 매크로인 pretracking_comb.txt를 수정하고 실행한 다음 프롬프트에 따라 해당 동영상의 최신 프레임으로 교체합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>SPT 소프트웨어, 예를 들어, Teves et al.42에서 입수할 수 있는 MTT 알고리즘(38)의 GUI 구현인 SLIMfast39를 사용하여 단일 입자 궤적을 생성한다.<ol><li>Load > Imagestack을 클릭하여 SLIMfast에서 단일 분자 동영상이 포함된 5.1.2의 파일을 로드합니다.</li>
		<li>매개변수를 설정합니다(현지화 오류율: 10-6; 디플레이션 루프: 3) OPT > 시트: 현지화를 클릭하여 현지화를 위해.</li>
		<li>매개변수를 설정합니다(피크 방출: 664nm; 지연 시간: 500 ms) OPT > Sheet: Acquisition을 클릭하여 수집합니다.</li>
		<li>단일 프레임에서 모든 분자의 국소화를 시각화하여 선택한 파라미터가 적절한지 확인합니다(TEST LOC). 적절하지 않은 경우 5.2.2 및 5.2.3 단계에서 매개 변수를 수정하고 이 단계를 반복합니다.</li>
		<li>모든 프레임에 있는 모든 분자의 국소화를 포함하는 파일을 생성합니다(LOC ALL).</li>
		<li>Load > Particle Data(파티클 데이터 로드) > SLIMfast를 클릭하여 SLIMfast의 5.2.5에서 파일을 로드합니다.</li>
		<li>파라미터 설정(최대 예상 확산 계수: 0.1μm2/s; 최대 참가자 수: 5) OPT > 시트: 추적을 클릭하여 궤적 생성.</li>
		<li>모든 분자의 궤적을 포함하는 파일(GEN TRAJ)을 생성합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Drosopoulos et al.43에서 사용할 수 있는 evalSPT39를 사용하여 tmin, 2.5초보다 짧은 궤적을 필터링하여 인위적으로 짧은 궤적을 생성하는 추적 오류를 설명합니다.<ol><li>5.2.8의 파일을 evalSPT로 로드합니다(+ 5.2.8의 파일 > OK>).</li>
		<li>매개변수를 설정합니다(최소: 5프레임; max: 5.2.8)의 최대 궤적 길이)를 사용하여 2.5초보다 짧은 궤적을 필터링합니다.</li>
		<li>필터링된 모든 궤적이 포함된 파일을 생성합니다(EXPORT DATA).</li>
	</ol></li>
	<li>관심 단백질의 궤적에 대해서만 이 단계를 따르십시오. 궤적을 응축수 내부와 응축수 외부로 분류한 다음 평균 응축수 내 체류 시간을 추출합니다. 참고: 이 섹션의 모든 코드는 Chong et al.1에서 확인할 수 있습니다.<ol><li>JFX549 채널에서 획득한 동영상의 모든 프레임을 임계값으로 설정하여 ImageJ 매크로, 핵 및 클러스터 mask_v2.txt 실행하고 프롬프트에 따라 응축수 위치를 강조 표시하는 시간 진화 바이너리 마스크로 채워진 타임랩스 동영상을 생성합니다.</li>
		<li>5.3.3에서 생성된 단일 분자 궤적을 다시 포맷합니다. MATLAB 스크립트 ConvertASCII_SlowTracking_css3.m을 사용하고 필요에 따라 파일 이름, 경로, 파라미터를 조정합니다. (매개변수: 노출, 0.5초; 해상도, 0.16μm/픽셀).</li>
		<li>MATLAB 스크립트 categorization_v4.m을 사용하여 주어진 분자가 응축수 F에서 소비하는 수명의 비율을 기준으로 궤적을 정렬하고 필요에 따라 파일 이름과 경로를 조정합니다.</li>
		<li>응축수 궤적만 사용하여 진행하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>kobs, s, kpb를 추출하고 수정된 평균 체류 시간 <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">을 계산합니다.<ol><li>MATLAB 스크립트 PLOT_ResidenceHist_css.m을 사용하고 필요에 따라 파일 이름, 경로, 파라미터를 조정하여 관심 궤적의 응축수 내 단백질에서 kobs,s를 추출합니다. (매개변수: 노출, 0.5초; StartFrameForFit, 5 프레임).</li>
		<li>MATLAB 스크립트 PLOT_ResidenceHist_css.m을 사용하고 필요에 따라 파일 이름, 경로, 파라미터를 조정하여 H2B 궤적에서 kpb를 추출합니다. (매개변수: 노출, 0.5초; StartFrameForFit, 5 프레임).</li>
		<li>응축수에 특이적으로 결합된 관심 단백질의 수정된 평균 체류 시간을 다음과 같이 계산합니다. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq07v3.jpg" style="margin: auto;"> 참고: 이동 입자를 흐리게 할 수 있을 만큼 충분히 긴 다양한 노출 시간(예: 300ms 및 800ms)이 여전히 관심 단백질의 평균 체류 시간이 동일한지 확인하기 위해 제어를 수행해야 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

단백질 상호 작용의 Live Cell Single-Molecule Imaging-Based 정량화

저자는 공개할 것이 없습니다.

여기에 제시된 프로토콜은 Irgen-Gioro et al.40에서 조사된 것과 같은 시스템을 위해 설계되었습니다. 응용 분야에 따라 프로토콜의 일부 구성 요소(예: 형광 표지 세포주 생성 방법, 형광 표지 시스템 및 사용되는 커버슬립 스타일)를 수정할 수 있습니다. 세포에서 단백질의 Halo-tagging은 주어진 실험에 더 적합한 전략에 따라 두 가지 전략을 사용하여 수행할 수 있습니다. 1) 외인성 발...

점점 더 많은 연구가 생체 분자 응축물이 세포 조직과 수많은 세포 기능(예: 전사 조절 1,2,3,4,5, DNA 손상 복구 6,7,8, 염색질 조직 9,10,11,12, X-염색체)에 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다 불활화 13,14,15 및 세포 내 신호 16,17,18. 또한, 생체 분자 응축물의 조절 장애는 암(19,20,21) 및 신경퇴행성 질환(22,23,24,25,26)을 포함한 많은 질병과 관련이 있다. 응축수 형성은 종종 일시적, 선택적, 다가 단백질-단백질, 단백질-핵산 또는 핵산-핵산 상호작용에 의해 유발된다27. 특정 조건에서 이러한 상호 작용은 액체-액체 상 분리(LLPS)로 이어질 수 있으며, 이는 막이 없는 액적에서 특정 생체 분자를 국부적으로 농축하는 밀도 전이입니다. 이러한 다가 상호작용은 종종 단백질 1,28,29의 내재적 무질서 영역(IDR)에 의해 매개됩니다. 분자 수준에서 이러한 상호 작용의 생물물리학적 특성 분석은 응축수가 널리 퍼져 있다는 점을 감안할 때 수많은 건강하고 비정상적인 세포 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 공초점 형광 현미경 기반 기술(예: 광표백(FRAP)30,31,32 후 형광 복구)는 응축물과 주변 세포 환경 간의 분자 교환이 동적임을 정성적으로 보여주기 위해 널리 사용되어 왔지만, 응축수 내 특정 생체 분자의 상호 작용 역학을 정량화하는 것은 일반적으로 기존의 공초점 현미경 또는 단일 분자를 사용하여 불가능합니다 특별한 데이터 분석 방법이 없는 현미경 검사. 이 프로토콜에 기술된 단일 입자 추적(SPT) 기법은 살아있는 세포 단일 분자 현미경(33)을 기반으로 하며, 응축수 내의 특정 단백질 간의 상호 작용 역학을 정량화하는 독특하고 강력한 도구를 제공합니다. 이러한 측정을 위한 SPT의 판독값은 응축수에서 관심 단백질의 평균 체류 시간입니다.
프로토콜은 데이터 수집과 데이터 분석의 두 부분으로 나눌 수 있습니다. 이미징 데이터 수집의 첫 번째 단계는 HaloTag34에 융합된 관심 단백질을 세포에서 발현하는 것입니다. 이를 통해 2개의 형광단으로 관심 단백질을 표지할 수 있으며, 여기서 대부분의 단백질 분자는 비광활성성 형광단(예: JFX549 Halo ligand35)으로 표지되고 그 중 작은 부분은 스펙트럼적으로 구별되고 광활성화 가능한 형광단(예: PA-JF646 Halo ligand36)으로 표지됩니다). 이를 통해 셀의 모든 응축수 위치를 동시에 획득하고 응축물에 결합 및 결합 해제하는 관심 단백질의 단일 분자 동영상을 획득할 수 있습니다. 한편, 동일한 유형의 세포는 착색질에 크게 움직이지 않는 히스톤인 Halo-tagged H2B를 안정적으로 발현하도록 변형됩니다. 그런 다음 세포를 PA-JF646 Halo 리간드로 염색하여 H2B의 단일 분자 이미징을 가능하게 합니다. 아래에서 자세히 논의되겠지만, 이 실험은 관심 단백질의 상호 작용 역학을 정밀하게 정량화할 수 있도록 광표백의 기여를 설명합니다. 그런 다음 이미징 실험을 위한 세포를 깨끗한 커버슬립에서 배양하고 HaloTag 리간드로 염색한 다음 살아있는 세포 이미징 챔버에 조립해야 합니다. 거기에서 샘플은 2채널 이미징 및 단일 분자 검출이 가능한 전반사 형광(TIRF) 현미경의 고도로 기울어진 적층 광학 시트(HILO) 조명 아래에서 이미지화됩니다. 그런 다음 방출은 두 대의 카메라로 나뉘는데, 하나는 응축수 위치를 추적하고 다른 하나는 단일 분자를 추적합니다. 획득은 자유확산 단백질을 흐리게 하고 세포(37) 내의 안정한 구조에 결합하기 때문에 이동성이 적은 단백질만을 포획하기 위해 긴 통합 시간(수백 ms 정도)으로 수행된다.
데이터 분석의 첫 번째 단계는 확립된 단일 입자 추적(SPT) 알고리즘(38,39)을 사용하여 영화의 각 프레임에서 개별 단백질 분자를 국소화하고 검출 가능한 수명 동안 각 분자에 대한 궤적으로 국소화를 조립하는 것입니다. 그런 다음 궤적은 궤적 전체에 걸친 분자의 국소화를 해당 시간1에서 모든 응축수의 국소화와 비교하여 응축수 내부의 분자를 나타내는 분자와 응축수 외부의 분자를 나타내는 궤적으로 분류됩니다.
다음으로, 생존 곡선(1 - CDF)은 모든 응축수 내 궤적의 길이를 사용하여 생성됩니다. 분자의 겉보기 평균 체류 시간은 생존 곡선을 단백질 결합의 다음 2 성분 지수 모델에 적합시킴으로써 추출됩니다.
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;">,
A는 비특이적으로 결합된 분자의 분율로, kobs,ns 및 kobs,s 는 각각 비특이적으로 결합된 분자 및 특이적으로 결합된 분자의 관찰된 해리 속도입니다. 여기서부터는 kobs,s 만 고려됩니다. 단백질 해리, ktrue, s와 형광단의 광표백, kpb의 역학은 kobs, s 에 다음과 같이 기여합니다.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;">;
따라서, 단백질 해리의 효과를 분리하기 위해, 앞서 언급한 세포주에서 H2B-Halo의 특정 해리 속도를 측정한다.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;">
H2B는 염색질에 안정적으로 통합되고 단일 분자 영화 획득의 시간 척도에서 최소한의 해리를 경험하는 단백질입니다37. 특정 해리 속도는 PA-JF646 Halo 리간드의 광표백 속도와 같습니다.
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;">.
관심있는 단백질의 평균 응축수 체류 시간, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">, 그 때
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;">.
Irgen-Gioro et al.40 의 대표적인 결과가 나타나며, 이 프로토콜은 올리고머화 도메인을 IDR에 융합하면 응축수에서 IDR의 체류 시간이 길어진다는 것을 입증하기 위해 적용되었습니다. 이 결과는 추가된 올리고머화 도메인이 LLPS를 구동하는 IDR의 동형 상호작용을 안정화시킨다는 것을 시사한다. 원칙적으로, 약간 수정된 프로토콜을 사용하는 동일한 방법을 적용하여 모든 유형의 응축물 형성에 관여하는 모든 단백질의 동형 또는 이형 상호 작용을 특성화할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m TetraSpeck microsphere</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T7279</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Diameter, #1.5 Coverslips</td>
			<td>Marienfeld Superior</td>
			<td>111650</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>593/40 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-593/40-25</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>676/37 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-676/37-25</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well TC Plate</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-105MP</td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line: U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td>Labeling of proteins in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ConvertASCII_SlowTracking_css3 
			.m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Rack</td>
			<td>Thomas</td>
			<td>24957</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Low Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-567-022</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Lab Alley</td>
			<td>EAP200-1GAL</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>evalSPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikon Ultra CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>X-13723</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Di02-R635-25x36</td>
			<td>Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUN-F Laser Unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: 405/488/561/640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nucleus and cluster mask_v2.txt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td>Labeling of proteins in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLOT_ResidenceHist_css.m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>6984-06</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pretracking_comb.txt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLIMfast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top incubation system</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: For live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwinCam dual emission image splitter</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>5800</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule measurement of protein interaction dynamics within biomolecular condensates

액체-액체 상 분리(LLPS)를 통해 형성된 생체 분자 응축물은 세포 조직과 증가하는 세포 기능에 중요한 것으로 간주되어 왔습니다. 살아있는 세포의 LLPS를 특성화하는 것도 중요한데, 비정상적인 응축은 암 및 신경퇴행성 질환을 포함한 수많은 질병과 관련이 있기 때문입니다. LLPS는 종종 본질적으로 무질서한 단백질 간의 선택적, 일시적 및 다가 상호 작용에 의해 주도됩니다. LLPS에 참여하는 단백질의 상호 작용 역학은 결합 체류 시간(RT), 즉 응축수 내에서 결합하는 데 소비하는 시간의 양으로 잘 요약됩니다. 여기에서는 응축수 내 특정 단백질의 평균 RT를 측정할 수 있는 살아있는 세포 단일 분자 이미징을 기반으로 하는 방법을 제시합니다. 개별 단백질 분자와 이들이 연관된 응축물을 동시에 시각화하고, 단일 입자 추적(SPT)을 사용하여 단일 분자 궤적을 표시한 다음, 단백질의 평균 RT를 추출하기 위해 단백질 액적 결합 모델에 궤적을 맞춥니다. 마지막으로, 이 단일 분자 이미징 방법을 적용하여 올리고머화 도메인에 융합 및 비융합될 때 LLPS 응축물에서 단백질의 평균 RT를 비교한 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 프로토콜은 LLPS에 참여하는 모든 단백질의 상호 작용 역학을 측정하는 데 광범위하게 적용할 수 있습니다.

A growing body of work suggests that biomolecular condensates play an important role in cellular organization and numerous cellular functions, e.g., transcriptional regulation1,2,3,4,5, DNA damage repair6,7,8, chromatin organization9,10,11,12, X-chromosome inactivation13,14,15, and intracellular signaling16,17,18. In addition, the dysregulation of biomolecular condensates is implicated in many diseases, including cancers19,20,21 and neurodegenerative disorders22,23,24,25,26. Condensate formation is often driven by transient, selective, and multivalent protein-protein, protein-nucleic acid, or nucleic acid-nucleic acid interactions27. Under certain conditions, these interactions can lead to liquid-liquid phase separation (LLPS), a density transition that locally enriches specific biomolecules in membraneless droplets. Such multivalent interactions are often mediated by the intrinsically disordered regions (IDRs) of proteins1,28,29. Biophysical characterization of these interactions at the molecular level is critical to our understanding of numerous healthy and aberrant cellular functions, given the pervasiveness of condensates across them. Although techniques based on confocal fluorescence microscopy, e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)30,31,32, have been widely used to qualitatively show that the molecular exchanges between condensates and the surrounding cellular environment are dynamic, quantifying the interaction dynamics of specific biomolecules within condensates is generally not possible using conventional confocal microscopy or single-molecule microscopy without specialized data analysis methods. The single-particle tracking (SPT) technique described in this protocol is based on live-cell single-molecule microscopy33 and provides a uniquely powerful tool to quantify the interaction dynamics between specific proteins within condensates. The readout of SPT for such measurement is the mean residence time of a protein of interest in the condensates.
The protocol can be broken down into two parts - data acquisition and data analysis. The first step of imaging data acquisition is to express in cells a protein of interest that is fused to a HaloTag34. This enables labeling of the protein of interest with two fluorophores, where a majority of the protein molecules are to be labeled with a non-photoactivatable fluorophore (e.g., JFX549 Halo ligand35) and a small fraction of them are to be labeled with a spectrally distinct, photoactivatable fluorophore (e.g., PA-JF646 Halo ligand36). This allows for the simultaneous acquisition of all condensate locations in the cell and the acquisition of single-molecule movies of the protein of interest binding and unbinding to the condensates. Meanwhile, the same type of cells are modified to stably express Halo-tagged H2B, a histone that is largely immobile on chromatin. The cells are then stained with the PA-JF646 Halo ligand to enable single-molecule imaging of H2B. As will be discussed in detail below, this experiment accounts for the contribution of photobleaching to enable precise quantification of the interaction dynamics of the protein of interest. Cells for imaging experiments must then be cultured on clean coverslips, stained with HaloTag ligand(s), and assembled into a live-cell imaging chamber. From there, the sample is imaged under highly inclined and laminated optical sheet (HILO) illumination on a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope capable of two-channel imaging and single-molecule detection. The emission is then split onto two cameras, one tracking condensate positions and one tracking single molecules. Acquisition is performed with a long integration time (on the order of hundreds of ms) to blur out freely-diffusing proteins and only capture proteins that are less mobile due to binding to stable structures in the cell37.
The first step of data analysis is using an established single-particle tracking (SPT) algorithm38,39 to localize individual protein molecules in each frame of the movie and assemble the localizations into a trajectory for each molecule over its detectable lifetime. The trajectories are then sorted into those representing molecules inside and those representing molecules outside the condensates by comparing the localizations of the molecules throughout their trajectories to the localizations of all the condensates at the corresponding times1.
Next, a survival curve (1 - CDF) is generated using the lengths of all the in-condensate trajectories. The apparent mean residence time of the molecules is then extracted by fitting the survival curve to the following two-component exponential model of protein binding,
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;" />,
with A as the fraction of molecules non-specifically bound and with kobs,ns and kobs,s as the observed dissociation rates of the non-specifically bound and specifically bound molecules, respectively. Only kobs,s is considered from here onward. The dynamics of both protein dissociation, ktrue,s, and photobleaching of the fluorophore, kpb, contribute to kobs,s as
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;" />;
thus, to isolate the effects of protein dissociation, the specific dissociation rate of H2B-Halo in the cell line mentioned prior is measured.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;" />
H2B is a protein that is stably integrated into chromatin and that experiences minimal dissociation in the time scale of a single-molecule movie acquisition37. Its specific dissociation rate is then equal to the photobleaching rate of the PA-JF646 Halo ligand, or
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;" />.
The mean in-condensate residence time of the protein of interest, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" />, is then
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;" />.
Representative results from Irgen-Gioro et al.40 are shown, where this protocol was applied to demonstrate that fusing an oligomerization domain to IDR results in longer residence times of the IDR in its condensates. This result suggests that the added oligomerization domain stabilizes the homotypic interactions of the IDR that drives LLPS. In principle, the same method with slightly modified protocols can be applied to characterize the homotypic or heterotypic interactions of any protein that participates in the formation of any types of condensates.

저자 스포트라이트: Evaluation of Protein-Condensate Dynamics in Live Human Cells

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

1 Our lab aims to understand the interaction behaviors<v>2 of intrinsically disordered protein regions 3 and how they play roles in transcriptional regulation 4 in healthy and diseased human cells. 5 In our lab, we develop and use novel 6 single molecule microscopy techniques 7 in combination with molecular biology, 8 biochemical and proteomic approaches 9 to study biomolecular condensates. 10 This protocol enables the quantification of the dynamics 11 by which a specific protein 12 binds to a particular type of condensate 13 in live human cells, 14 and is broadly applicable 15 to measuring the interaction dynamics of any protein 16 that participates in liquid-liquid phase separation.

여기에서는 Irgen-Gioro et al.40의 대표적인 결과를 제시하며, 이 SPT 프로토콜을 사용하여 각각의 자체 조립된 LLPS 응축물에서 두 단백질의 상호 작용 역학을 비교했습니다. TAF15(TATA-box binding protein associated factor 15)는 인간 세포에서 과발현 시 LLPS를 겪을 수 있는 IDR을 함유하고 있습니다. TAF15(IDR)를 24-서브유닛 올리고머를 형성하는 FTH1(페리틴 중쇄 1)에 융합하면 LLPS를 구동하는 보다 ?...

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많은 본질적으로 무질서한 단백질은 수많은 세포 과정에 중요한 행동인 매우 역동적인 생체 분자 응축물의 형성에 관여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포에 있는 생체 분자 응축물에서 단백질이 서로 상호 작용하는 동역학을 정량화하기 위한 단 하나 분자 화상 진찰 근거한 방법을 제시합니다.

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

single-molecule-measurement-protein-interaction-dynamics-within

Research

JoVE Journal

Biology

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

2.5K 조회수.  California Institute of Technology. 1 우리 연구실은본질적으로 무질서한 단백질 영역3의 상호 작용 행동2을 이해하고 건강한 인간 세포와 병든 인간 세포에서 전사 조절4에 어떤 역할을 하는지 이해하는 것을 목표로 합니다. 5 우리 연구실에서는 분자 생물학, 8 생화학 및 단백질체학 접근법 9과 함께 새로운 6 단일 분자 현미경 기술 7을 개발하고 사용하여 생체 분자 응축물을 연구합?...

비디오: 저자 스포트라이트: Evaluation of Protein-Condensate Dynamics in Live Human Cells

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

연구

생물학

Halo-Ligand Staining of Cells for Protein Condensate-Interaction Studies Using Single-Molecule Imaging

1 After creating the cell lines<v>2 expressing the HaloTag protein of interest and Halo-H2B, 3 prepare the halo ligand staining reagent 4 separately for both of them. 5 Rinse the cells with two milliliters of PBS. 6 Add halo ligand containing media 7 and incubate them at 37 degrees Celsius 8 with 5%carbon dioxide for one hour.9 After removing the staining media, 10 rinse the cells four times with PBS 11 and incubate them with fresh media devoid of halo ligands. 12 After four such rinse incubation cycles, 13 transfer the cover slip with cells 14 to a microscope stage compatible chamber 15 with sterile forceps. 16 Add phenol red-free media to the chamber before imaging.

단일 분자 이미징을 사용한 단백질 응축물 상호 작용 연구를 위한 세포의 Halo-Ligand 염색

Single-Molecule Imaging of Halo-Tagged Proteins to Study Protein-Condensate Interactions

1 To begin, obtain ligand stain cells<v>2 expressing halo-tagged protein of interest and halo H2B. 3 After turning on the microscope system, 4 set the live cell incubation parameters 5 and let the system equilibrate. 6 Put a drop of the oil onto 7 a 100x TIRF objective on the microscope 8 and load the cell sample onto the microscope stage.9 To identify a morphologically healthy cell, 10 adjust the Z position 11 and image the cell sample under brightfield illumination. 12 Crop the field of view to capture the target cell nucleus. 13 Using laser illumination, adjust the TIRF angle 14 to achieve hilo illumination with an optimal 15 signal to noise ratio of a single molecule.16 Then, set the exposure time to 500 milliseconds. 17 During the dead time between frames, 18 photo activate the molecules 19 with a 111 microwatt 405 nanometer beam, 20 and during each exposure, excite H2B halo molecules 21 with a 9.1 milliwatt 640 nanometer beam. 22 Initiate image capturing for 2000 frames continuously 23 and gradually increase the power of the 405 nanometer beam 24 upon reduction of photo activated molecules.25 For a halo-tagged protein of interest, 26 split emission wavelengths between two cameras 27 using a long pass dichroic mirror. 28 To the same acquisition parameters demonstrated earlier, 29 add JFX549 channel to acquire one frame every 10 seconds 30 and capture 2000 frames continuously.

단백질-응축물 상호작용을 연구하기 위한 Halo-Tagged Proteins의 단일 분자 이미징

Analysis of Single-Molecule Imaging Data to Study Interactions of Halo-Tagged Proteins

1 To begin, perform live cell<v>2 single molecule imaging of HaloTag protein condensates. 3 Using ImageJ, convert each channel 4 from the raw imaging data file 5 into an independent TIFF file. 6 If necessary, run pre-tracking comb.text 7 and follow the prompts 8 to replace any frames with the most recent ones. 9 To load the single molecule of movie file in SlimFast, 10 click on load, followed by image stack. 11 Set the parameters for localization 12 and acquisition under respective option sheets.13 Visualize the localizations of all the molecules. 14 And using lock all, 15 generate a file containing the localizations 16 of all the molecules in every frame. 17 Next, go to load particle data 18 and select SlimFast to load the file 19 with localization and acquisition settings.20 Using option and sheet tracking, 21 adjust the parameters for trajectory generation. 22 Click on gen traj to generate a file 23 containing the trajectories of all the molecules. 24 Load the sheet tracked file into eval SPT 25 and set the parameters 26 to filter out the trajectories shorter than 2.5 seconds.27 Using export data, generate a file 28 with all the filtered trajectories. 29 Running the ImageJ macro, nucleus, 30 and cluster mask version two. text, 31 threshold all the frames of the movie acquired 32 in the JFX549 channel to generate a time lapse movie 33 populated with the time evolving binary mask 34 highlighting condensate locations.35 Using convert ASCII slow tracking CSS 3. M, 36 reformat the trajectories 37 and run categorization version 4. M 38 to sort them based on the lifetime 39 a molecule spends in a condensate.40 Next, using plot residence hist CSS. M, 41 extract the observed dissociation rate 42 of specifically bound molecules 43 and the photobleaching rate from the in condensate 44 protein of interest and the H2B trajectories. 45 Finally, calculate the corrected mean residence time 46 of the protein of interest, 47 specifically bound to its condensates.48 A frame from two-color single molecule movie 49 of TAF15 IDR-Halo-FTH1 shows signals 50 from the nucleus in both PA-JF646 and JFX549 channels. 51 Upon assembling and sorting, 52 a clear distinction was observed for the trajectories 53 of PA-JF646 detected molecules bound to the condensates. 54 The calculated mean residence times 55 after correction for photobleaching 56 were more for TAF15-Halo-FTH1 than Halo-TAF15.