Name: analysis of immune cells in single sciatic nerves and dorsal root ganglion from a single mouse using flow cytometry
Uploaded: 2017-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
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이 연구는 도이치 가운데 (DFG;에 의해 지원 되었다 SFB1118)입니다. 저자는 해 부의 대부분을 수행 하 고 유익 하 게이 지식을 전송에 대 한 악 셀 Erhardt와 박사 Volker 엑스 타인과 교류 cytometer의 기술적인 측면에 도움을 위한 감사 하 고 싶습니다.

야생-타입 C57BL/6 마우스 (남성, 10 ~ 12 주) 표준 12 h 명암 주기에서 유지 했다 그리고 표준 차 다이어트와 물에 대 한 무료 액세스를 제공 했다. 모든 동물 실험 지역 동물 관리 및 사용 위원회 관련 지침에 따라에서 실시 하 고 Karlsruhe, 독일 (G216/10)에 지역 권위에서 로컬 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1입니다. 마우스의 관류
<ol><li>희생 마우스 (C57BL/6; 남성; 10-12weeks) CO2 를 사용 하 여 지역 규정에 따라. 참고: EDTA 코팅 1.5 mL 튜브를 사용 하 여 제어 백혈구를 수행할 수 있습니다 복고 궤도 출혈. 이 방법은 출혈만 희생 직후 효율적입니다. 더, 복 막 구멍 게 (PCL) 융합 관류를 방해할 수 있습니다 혈액의 찬 들을 피하기 위해 37 ° C에서 미리가 열된 PBS를 사용 하 여 제어 세포를 얻기 위해 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>후 한 70 %v / v 에탄올과 모피는 복 부에 살포 하 고 반복적으로 코 튼 거 즈와 휴지로 닦아 하 여 마우스를 소독. 세로 절 개 하 여 복 부 피부 오픈 컷 무딘가 위를 사용 하 여.</li>
	<li>처음 만드는 곡선, 무딘가 위를 사용 하 여 및 다음 흉 곽의 전체 길이 따라 절 개를 확장 횡 경 막으로 절 개 하 여 흉 막 캐비티를 노출 합니다. 흉 골 떨어져 신중 하 게 해제를 수 때까지 contralateral 쪽에 비슷한 상처를 확인 합니다.</li>
	<li>심장과 주요 혈관의 명확한 전망, 삽입 나비 23¾ 계기 바늘, 50 mL 주사기에 연결 되어 심장의 왼쪽된 상공에 얼음 처럼 차가운 PBS, 가득 합니다.</li>
	<li>하강 대동맥 손상 없이 가능한 콘센트의 대형을 아이리스가 위를 사용 하 여 심장의 오른쪽 아 트리 움을 절 개 하 고 다음 주사기를 약을 부드럽게 우울 30 mL PBS의. exudate 분명 실행 되어야 합니다. 간 및 신장의 좋은 관류의 지시자로 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>2입니다. 좌 골 신경 및 DRG의 해 부
참고: 좌 골 신경의 해 부에 대 한 gluteus 막시무스 제거 되 고 마우스는 피부 위의 위치 복 부 측 아래로 더 낮은 사지에 밖으로 기지개 하는 동안.
<ol><li>양측 위 지 허벅지에서 근육 조직을 구분 하 여 전체 좌 골 신경 해 부 고 신경 척추를 따라 따라. 잘라 신경 척추에서 및 즉시 다른 끝에서 무릎 위에 어디 종료 됩니다. 참고: 분쇄 또는 당기는 집게와 같은 신경의 과도 한 처리를 하지 마십시오.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 삭제 nerve(s), 신경, 얼음 처럼 차가운 PBS와 얼음가 게의 1 mL를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 약 2 cm 전송. 참고: 신경 얼음에 하룻밤 저장할 수 있습니다. 참고: DRG 절 개, 포 셉, 메스를 사용 하 여에 대 한 분리는 기본 부드러운 조직에서 피부 노출 자 궁 경부, 흉부, 요 추 척추 지역 나머지 다시 피부를 벗 겨 부드럽게 합니다. 무딘가 위의 쌍을 사용 하 여 두개골의 기지에서 절단 하 여 머리를 제거 합니다.</li>
	<li>척추의 앞쪽 측면에 연결 된 내장을 분리 하기 전에 갈비뼈를 병렬와 척추 양쪽에 가까이 잘라. 화관을 잘라 고는 화관의 수준에서 컷 통과 의해 척추 열을 제거 합니다. 아이리스가 위를 사용 하 여 모든 근육, 지방, 그리고 척추에서 다른 부드러운 조직 떨어져 잘라.</li>
	<li>등 쪽 면이 위로 향하도록 척추 열을 배치 하 고, 3 시 위치와 잘라 뼈에서 척추 운하로가 위의 1 개의 끝을 슬라이딩 하 여 꼬리 끝에서 시작. 9 시 위치에서 절차를 반복 합니다. 참고:는 DRG의 손상을 방지 하려면 센터에 정확 하 게 잘라 중요 하다.</li>
	<li>Rostral 끝에 도달 하 고 척수가 완전히 노출 될 때까지 사이드-투-사이드에서 절단을 반복 합니다. 해 부 현미경을 사용 하 여, 척추 신경, 척추 내 Drg를 찾는 데 사용 될 수 있는 노출 척수를 제거 합니다.</li>
	<li>부드럽게 잡아 당 겼 지 루트 다음 클리핑 신경 및 결합 조직 아이리스가 위는 Drg를 제거 하는 척추 운하에는 DRG를에 의해 허리 Drg를 제거 합니다. 참고: 가능 하다 L4-L6 DRG 컬렉션을 제한 하는 좌 골 신경에 기여 하고있다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 약 1 mL의 얼음 처럼 차가운 PBS를 포함 하는 1.5 mL 튜브에는 Drg를 전송 하 고 얼음에 저장 합니다. 참고: 신경 얼음에 하룻밤 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>3입니다. 좌 골 신경 및 DRG의 소화
<ol><li>100 µ g/mL deoxyribonuclease, 그리고 얼음에 저장소의 보충 소화 미디어 (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/mL BSA, 1.6 mg/mL 콜라 유형 4)를 준비 합니다. 참고: 마우스 (좌 골 신경 + Drg) 당 필요한 소화 매체의 금액은 1 mL. 일단 준비, 소화 미디어의 aliquots-20 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	<li>좌 골 신경 및 Drg 한 마우스에서 소화 미디어의 500 µ L을 포함 하는 별도 1.5 mL 튜브에 전송. 좌 골 신경에 대 한 소재 봄이 위를 사용 하 여 15 ~ 20 조각으로 절단 하 고 부드러운 동요 (≤ 450 rpm)와 함께 20 분 동안 37 ° C에서 떨고 인큐베이터에서 조직 정지를 품 어.</li>
	<li>반복적으로 triturate 1000 µ L 피 펫 팁 어떤 불완전 소화 조직을 기계적으로 해리를 통해 세포 현 탁 액. 참고: 현 탁 액 적정 하기 어려운 경우 다음 잘라 피 펫 팁 만들 무뚝뚝한 끝을가 위로. 조직의 정지 부드러운 동요 (≤ 450 rpm)와 20 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>1000 µ L 피 펫 팁을 통해 분쇄를 반복 하 고 부드러운 동요 (≤ 450 rpm)와 함께 37 ° C에 추가 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>FACS 버퍼 PBS (보충 10 %FCS 및 1 mM EDTA)를 준비 하 고 얼음에 저장. 린스 하 고 60 x 15 mm 페 트리 접시에 얼음에에서 FACS 버퍼 140 µ m의 메쉬 크기 스테인리스 스틸 화면을 담근 다. 참고: nucleated 세포의 수율에 중대 한 손실을 리드 나일론 스크린 필터를 피해 야 한다.</li>
	<li>반복적으로 통과 조직 정지 140 µ m 스크린 필터로 그것은 얼음에 무딘 집게와 페 트리 접시에 개최 됩니다. 페 트리 접시에서 세포 현 탁 액을 수집 하 고 얼음에 저장 된 새로운 1.5 mL 튜브에 그것을 전송.</li>
	<li>1000 µ L 피 펫 팁 반복된 분쇄 하 여 통해 필터에 남아 있는 어떤 불완전 소화 조직을 밀어. FACS 버퍼의 500 µ L로 두 번 스크린 필터를 헹 구 고 단계 3.6에서에서 세포 현 탁 액 결합을 페 트리 접시에 결과 세포 현 탁 액을 수집 합니다. 참고: 사용 하는 교류 cytometer 파편에 민감한 경우에, 단계의 3.7 세포 현 탁 액 수 통과 70 µ m 스크린 필터; 그러나,이 nucleated 세포의 수확량에 손실이 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g에서 셀 정지 원심 삭제는 상쾌한 고 FACS 버퍼의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 한 번이 세 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>150-350 µ L의 FACS 버퍼, 얼룩의 수에 따라 필요한 (150 µ L FACS 버퍼 얼룩 패널 당)는에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
</ol>4. Cytometry에 대 한 좌 골 신경 및 붙일 레이블된 항 체와 DRG의 얼룩
<ol><li>얼음에 V 96 잘 접시에 모양으로 좌 골 신경 또는 DRG 세포 현 탁 액의 100 µ L를 전송. 참고: 단일 스테인드 셀은 그들은 광 전 증폭 관 관 (PMT) 전압 이득 및 보상, cytometry 구별에서 특정 도움말 설정 하기 위한 필요한 컨트롤을 제공 합니다 사용 하는 모든 항 체에 필요한 일반적인 바인딩입니다. 좌 골 신경 및 Drg에서 사용할 수 있는 제한 된 자료로 인해 혈액 백혈구 및 PCL (1.1-1.2 단계)에서 대 식 세포는 얼룩이 지는 단일 스테인드 컨트롤으로 사용할 수 있습니다 하는 좌 골의 얼룩과 병렬로 수행 해야에 대 한 신경 및 Drg 있습니다.</li>
	<li>수영장 나머지 정지 (약 50 µ L 샘플 당) 좌 골 신경 또는 흠 없는 컨트롤 역할을 DRG 샘플에서 세포.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 격판덮개 원심 위에 빈 접시를 반전 하는 손목의 날카로운 영화를 적용 하 여는 상쾌한을 삭제 하 고 부드럽게 건조 종이 타월에 누릅니다.</li>
	<li>표면 얼룩에 대 한 관심 (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5, MHC 클래스 II-Biotin)의 항 체를 포함 하는 FACS 버퍼의 20 µ L에서 각 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 품 어, 30 분 동안 얼음에 빛 으로부터 보호. 참고: (1) 최적 항 체 희석 결정된 전에 제조 업체의 제품 정보; 희석 시리즈를 수행 하 여 사용 해야 합니다. (2) 일반적인 stainings; 제조업체의 지침에 따라이 단계에서 Fc-블록 외피에 의해 감소 될 수 있다 그리고 (3) Isotype 제어 stainings는 일반적으로 필요 하지 않습니다는 fluorophore와 또는 관심의 antigen(s) 고유 인구 생산에 직접 활용 된 1 차 항 체를 사용 하는 경우.</li>
	<li>각 우물에 FACS 버퍼의 130 µ L을 추가 하 고 접시 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 이전 (4.3 단계)에 설명한 FACS 버퍼의 150 µ L로 두 번 셀 펠 릿을 세척으로 상쾌한을 삭제 합니다. 참고: 결합형된 기본 항 체 또는 비타민 b 복합체에 활용 된 1 차적인 항 체를 사용 하는 경우는 적절 한 보조 시 약, fluorophore에 활용 된이 시점에서 추가 될 수 있다 그리고 단계 4.4-4.5 반복 됩니다. 이 프로토콜의 경우 streptavidin-PE/Cy7 또는 Streptavidin PerCP MHC 종류 II 또는 CD68 APC와 함께 F4/80-PE/Cy7, CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5와 함께에서 각각 검출 하기 위하여 사용 되었다.</li>
	<li>마지막 세척 단계 후 고정을 위한 PBS (pH 7.4)에 4 %paraformaldehyde 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 10 분 동안 얼음에 플레이트를 품 어와 다음 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 앞에서 설명한 (4.3 단계)으로 상쾌한을 삭제 하 고 FACS 버퍼의 150 µ L 한번 셀 펠 릿을 세척. 주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호 장갑과 안경, 등등을 착용 하십시오. 참고: FACS 버퍼와 최대 2 일 동안 4 ° C에서 빛 으로부터 보호 저장소의 150 µ L에서 셀 펠 릿을 Resuspend. 세포내 얼룩이 지 하는 것이 필요한 경우 다음 단계로 진행 4.11 centrifuging 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 플레이트 후</li>
	<li>세포내 얼룩, FACS buffer+0.5% 세제, 150 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 15 분 분리기 400 x g에서 접시 4 ° c.에서 5 분에 대 한 빛에서 보호 하는 실 온에서 품 어 앞에서 설명한 (4.3 단계)으로 상쾌한 삭제 하 고 150 µ L FACS 버퍼 + 0.5% 세제로 한 번 셀 펠 릿을 세척. FACS buffer+0.5% 세제 (CD68-APC, CD206 PE)의 항 체를 포함 하는 20 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 품 어, 30 분 동안 실내 온도에 빛 으로부터 보호.</li>
	<li>각 우물에 FACS buffer+0.5% 세제의 130 µ L을 추가 하 고 접시 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 이전 (4.3 단계)에 설명한 FACS 버퍼 + 0.5% 세제의 150 µ L로 두 번 셀 펠 릿을 세척으로 상쾌한을 삭제 합니다. 참고: 결합형된 기본 항 체 또는 비타민 b 복합체에 활용 된 1 차적인 항 체를 사용 하 여 다음에 fluorophore를 활용 한 적절 한 보조 시 추가할 수 있습니다이 시점에서 그리고 단계 4.9-4.10 반복.</li>
	<li>최대 2 일 동안 4 ° C에서 빛 으로부터 보호 FACS 버퍼 + 0.5% 세제와 저장소, 150 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>Resuspend 셀 알 약 150 µ L FACS 버퍼 + 0.5% 세제 5 µ g/mL DAPI 보충 하 고 빛 으로부터 보호 하는 실 온에서 5 분 동안 품 어. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 격판덮개 원심 앞에서 설명한 상쾌한 (4.3 단계)를 삭제 합니다.</li>
	<li>PBS 및 레이블이 표시 된 FACs 튜브에 150 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 분석에 대 한 준비까지, 빛에서 보호 하는 실내 온도에 상점. 참고: PBS에 물의 resuspension, 후 셀 분석 되어야 합니다 시간, 이후는 DAPI 신호에서 손실에 지도 하는 DNA에서 해리 천천히 것입니다.</li>
</ol>5. 설치 Cytometry 및 샘플의 실행의
<ol><li>교류 cytometer는 적절 한 레이저를 갖추고 또는 필터 fluorophores 셀 얼룩에 사용을 측정 하기 위해 설정 확인 하십시오. 이 시스템에 기본 cytometer 구성에서 확인할 수 있습니다. 이 프로토콜의 경우 셀 흐름 cytometer 3 레이저 장비를 사용 하 여 분석 했다 (405 nm, 488 nm와 633 nm) 5 fluorophores ≤의 검출에 대 한 허용.</li>
	<li>관심의 fluorophores의 검출에 대 한 적절 한 채널을 선택 합니다. 모든 형광 신호 로그 증폭 검색 잘 됩니다.</li>
	<li>샘플에 대 한 적절 한 유량을 선택 합니다. 이 매개 변수 사용 하는 시스템에 따라 다를 수 있습니다 그리고 실험적으로 결정 되어야 한다. 이 프로토콜의 경우 클럽 메 드-하-안녕 (35-60 µ L/min)의 흐름 속도 바늘의 막힘을 방지 하기 위해 사용 되었다.</li>
	<li>샘플 당 수집 될 이벤트/셀의 총 수를 선택 합니다. 최소 이벤트 수 1000000 이어야 한다입니다.</li>
	<li>점도의 SSC-대 전역 워크시트에서 만들 뿐 각 fluorophore FCS-. 대 관심의에 대 한 FSC-A 이벤트 및 선택한 fluorophores에 의미 한 형광 강도 (MFI)의 수를 표시 하는 통계 보기를 만듭니다.</li>
	<li>작은 셀 맞는 점도의 더 낮은 왼쪽된 10%에는 FSC와 SSC-A 채널의 전압을 설정 합니다. 결정 배경 형광 및 좌 골 신경 또는 Drg. 결정 부모 (P1) 게이트는 분산형 기반에서 흠 없는 컨트롤에서 최소 샘플 형광 DAPI 전용에서 플롯 컨트롤 얼룩. 참고:이 아니다 컬렉션 게이트 인해 부분적으로, 인구의 DAPI + PNS에서 이기종 자연.</li>
	<li>관심의 fluorophores의 각 플롯 FSC 분산형을 사용 하 여, 그들의 각각 점도 낮은 분기 속하는 흠 없는 컨트롤의 셀 전압을 조정 합니다. 빌 게이츠 다음 각각 마커/fluorophores의 각각에 대 한 긍정적인 그 셀을 정의 하기 위해이 지역 위에 만들어집니다. 게이트의 위치는 단일 스테인드 컨트롤 (단계 4.1)의 실행에 의해 확인 된다. 참고: 중복 방출 스펙트럼에 대 한 보상이 시점에서 수행 하거나 적절 한 분석 소프트웨어를 사용 하 여 소급 적용 될 수 있습니다.</li>
	<li>교류 cytometer 설정 되었습니다, 설명 된 대로, 일단 샘플을 실행할 수 있습니다.</li>
	<li>실행 후 나머지 샘플 자료를 삭제 될 수 있습니다 하 고 FCS 파일 추가 분석을 위해 내보낼 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는이 연구에 관한 관심의 없습니다 충돌 있다.

좌 골 신경 축 삭 주위 myelin의 콘텐츠로 인해 콜레스테롤 같은 지질의 큰 비율을 포함합니다. 온도와 지질의 속성 변경, 다른 온도에 다른 결과 얻을 수 있습니다. 셀 보존 되도록 소화 후이 프로토콜의 모든 단계는 얼음에 수행 했다. 일관성 결과의 재현성을 위해서 권장 하는 동안 그것은 3.6, 3.7 실 온에서 단계를 수행 하 여 수율을 높일 수 수 있습니다. 3.8 단계에서 신경 충분히 소화 하지 해야 ?...

면역 세포는 순환에서 PNS를 입력 CD45 그리고 CD11b의 식에 의해 정의 된 대로 재생 및 변성1에서 두 역할을 신경의 무결성을 유지 도움이. 대 식 세포 (그들의 표현의 CD68 마우스에 의해 정의 된) 더 MHC를 표현 하는 염증 성 표현 형을 향해 왜곡 수 있습니다 클래스 II 및 CD86 (M1), 그들의 표면에 또는 항 염증 제 표현 형으로 표현 더 많은 세포내 CD206 (M2)2 . 대 식 세포 표현 형의 기울이기 Akt 신호3, 반사 체 (M1)에 대 한 방어에 대 식 세포 및 조직 재생 (M2)에서 역할의 다양 한 작업을 통해 규제 하는 역동적인 과정 이다. 손상 된 신경의 재생 먼저 신경4,5, 및 항 염증 세포 myelin 파편 식 균 작용 해야 (CD68+CD206+) M2 세포 축 삭 파생물에 홍보 보였다는 PNS6. PNS, 채용 또는 대 식 세포 감소 또는 먹어서 장애인된 능력 장애인된 재생 및 신경 무결성의 유지 관리 될 수 있습니다. 염증 성 m 1 대 식 세포, MHC 종류 II, 표현 M2 세포 보다 덜 먹어서 수 있으며 신경 염증은 여러 가지 신경 퇴행 성 질병7의 병 인에 연루.
신경 거주 면역 체계 손상 때문에 발생 하는 변화는 양적, CD45의 손실에 명시 수 있습니다+ 백혈구 (CD45의 침투를 증가 또는+ 경우 염증에 백혈구), 또는과 같은 질적 m 1 형 m 2에서 대 식 세포 표현 형의를 변경 합니다. PNS의 면역 세포는 전통적으로 냉동된 섹션 또는 파라핀 끼워 넣어진 소재8를 사용 하 여 IF를 사용 하 여 분석 되었습니다. 만약 관심의 세포의 지역화를 결정 하는 데 필요한. 그러나, 부 량 사용 하는 경우 종종 불안정 하 고 취약 선택 바이어스에 정량화를 만드는 조직의 좁은 부분에 셀의 상대적으로 작은 수를 계산에 의존 합니다. 면역 세포의 특정 하위 집합의 식별을 위해 세포 외 또는 세포내 표식의 동시 검출이 필요, 대 식 세포 표현 형의 결정은 적어도 두 개 이상 표시, 특히 CD206와 MHC를 필요 합니다 하는 동안 클래스 Ii입니다. 가장 일반적으로 사용 가능한 현미경 fluorescein isothiocyanate (FITC) 등 phycoerythrin (PE), 적어도 2 색상 채널에 제한 됩니다 경우 면역 세포의 특정 하위 집합의 특성 수 제한 하 고, 불완전 한 요구 얼룩이 고 병렬로 분석 필요 여러 슬라이드는 동일한 지역에서 파생. 이 시간이 많이 걸리는 측면은 따라서 하지 않습니다 필요한 큰 샘플 세트의 분석에 빌려. 또한, 관심의 표시의 대부분은 세포 외, 중 파라핀 또는 cryoconserved에 포함 되어, 조직에서 검출 수 막 무결성의 파괴와 epitopes, 마스킹의 손실 때문에 문제 아세톤과 메탄올9같은 용 매를 사용 하 여 관심의 항 원.
대조적으로, cytometry, 광학 측정 흐름 고 형광 특성에에서 단일 셀의 빛의 광선을 통과 제공 합니다 셀 인구의 분석을 위해 더 실용적이 고 포괄적인 의미. 셀의 상대적인 크기와 앞으로 분산형 (FSC), 복잡 한 단위/내부로 반사 인덱스를 포함 하는 매개 변수 설정된의 자동화 된 정량화를 제공 하는 조직의 디지털 이미지를 생산 하는 것 보다는 cytometry, 또는 측면 살포 (SSC), 그리고 상대 형광 강도 제공 하는 셀 활용 된 항 체와 같은 적절 한 fluorophore와 분류 되었습니다. 전형적인 교류 cytometer 이루어져 있다 2, 공 냉 식된 레이저; 488에서 푸른 빛을 생산 하는 아르곤 레이저 및 헬륨-네온 레이저 생산 633에 빛 nm. 이 조합은 최소 5 목표 표면에 또는 세포내 구획 내에서 동시에, 탐지 및 측정, 대 한 수 있습니다. 고급 흐름 cytometers 허용 한 번에 최대 8 개의 다른 형광의 탐지를 위해 선택 된 형광의 피크 방출 파장 크게 중복 되지 않도록 제공 하는 여러 레이저 구성할 수 있습니다.
Cytometry 분석, 대 한 관심의 조직 해야 합니다 먼저 수 효소 소화, 일반적으로 단일 세포 현 탁 액을 생성 하기 위해 콜라와 함께. 분석 murine 좌 골 신경의 이전 조직의 각 마우스에서 얻은 작은 금액으로 인해 어려운 되었습니다. 또한, 축 삭 주위 myelin의 고 지방 내용 셀 복구를 저해 하며 많은 양의 파편을 생성 합니다. 좌 골 신경 준비 및 소화에 대 한 여기에 설명 된 메서드 외. 여 자용 머리 핀 Schwann 세포 격리 프로토콜에서 적응 시켰다 7, 그리고 쥐 간의 편차를 줄이기 위해 충분 한 흐름 cytometry 분석에 대 한 개별 쥐의 신경 세포를 분리 하는 것을 목표로. DAPI를 사용 하 여 원시 조직 다이제스트에서 단일 세포의 식별에 대 한 축 삭 파편, 일반적으로 셀 손실에 이르게 제거할 필요가 circumvents. 셀의 출시에 세제-풍부한 버퍼 에이즈로 여러 번 세척 수확량 증가 지방 파편 안에서 갇혀. 이 프로토콜에 따라 단일 마우스에서 두 길이 좌 골 신경의 소화 ≥30, 000 단일 nucleated 이벤트를 생성 하 고 3 배 이상 그 숫자는 DRG에서 검색. CD45 비율+ 백혈구는 총 셀 내용 좌 골 신경 다이제스트 및 약의 약 5% DRG 다이제스트에서 5-10%. 대부분은 CD45의+ 좌 골 신경에 있는 세포 대 식 세포 마커, CD68 및 CD206을 표현.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 Mouse</td><td>Charles River</td><td>C57BL/6NCrl</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate)</td><td>Thermo</td><td>31885023</td><td>The source of this material is not important</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type 4</td><td>Worthington Biochemical Corp., US</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1g</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>Antibody against MHC class II, biotinylated</td><td>Biolegend</td><td>107603</td><td>Clone M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Antibody against CD45-A647</td><td>Biolegend</td><td>107603</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Antibody against CD68-APC</td><td>Biolegend</td><td>137007</td><td>Clone FA/11</td></tr><tr><td>Antibody against CD206-PE</td><td>Biolegend</td><td>141706</td><td>Clone C068C2</td></tr><tr><td>Antibody against F4/80-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123113</td><td>Clone BM8</td></tr><tr><td>Streptavidin-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>405206</td><td>Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5</td></tr><tr><td>Streptavidin-PerCP</td><td>Biolegend</td><td>405213</td><td>Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>Dilute in PBS to a 50x and store at 4 &amp;deg;C in the dark</td></tr><tr><td>Cell dissociation sieve - tissue grinder kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CD1</td><td></td></tr><tr><td>V-Shaped, 96-well plates</td><td>Greiner/Sigma</td><td>M8185</td><td></td></tr><tr><td>5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>60x15mm petri dish</td><td>Greiner/Sigma</td><td>Z643084</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of immune cells in single sciatic nerves and dorsal root ganglion from a single mouse using flow cytometry

말 초 신 경계 (PNS) 신경 상주 면역 세포는 건강 한 신경에 신경 원 완전성을 유지 하기 위해 필수적입니다. PNS의 면역 세포는 상해 및 질병, 신경 기능 재생 능력에 영향을 미치는 영향을. 신경 면역 세포 면역 형광 검사 (면)에 의해 일반적으로 분석 된다. 경우 경우 신경에 면역 세포의 위치를 결정 하기 위한 에센셜만 반 정량적 이며 방법은 동시에 분석할 수 있는 마커 수와 표면 식의도로 제한 하는 동안. 이 연구에서 cytometry 좌 골 신경이 나 개별 쥐의 지 루트 절 (Drg)에 백혈구 침투의 정량 분석을 위해 사용 되었다. 단일 세포 분석 DAPI를 사용 하 여 수행 하 고 여러 가지 단백질 동시에 표면 또는 세포내 식에 대 한 분석 했다. 이 프로토콜에 따라 치료 한 마우스에서 두 좌 골 신경 ≥ 30000 단일 nucleated 이벤트 생성. 좌 골 신경, CD45의 식에 의해 결정에 백혈구의 비율이 전체 셀 내용 좌 골 신경에서의 5%와 대략 5-10%는 DRG에 약 했다. 하지만이 프로토콜 PNS 내 면역 세포 인구에 주로 초점을 맞추고, cytometry 마커 수를 동시에 측정 하의 유연성 즉 신경, Schwann 세포, pericytes 등 내의 다른 세포 인구 섬유 아 세포와 내 피 세포, 또한 분석 될 수 있다이 방법을 사용 하 여. 따라서이 메서드는 PNS, neurotoxicology 등 신경 병 또는 당뇨병 같은 만성 질환에서 유전자 모델에 조직의 효과 공부에 대 한 새로운 의미를 제공 합니다.

전체 길이 좌 골 신경 및 모든 주요 DRG에서 셀 정지 했다 6 건강 한 C57BL/6 마우스에서 프로토콜에 따라 준비 하 고 얼룩에 대 한 3 개의 동등한 aliquots로 분할. DAPI, DNA, 얼룩과 얼룩 카운터 단일 셀 인구 (그림 1A-B, 상단 패널)의 검출에 대 한 수 있습니다. DAPI cytometry, 분석 이전에 밖으로 세척 단일 nucleated 이벤트 또는 singlets의 FS...

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Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

정량 분석 murine 좌 골 신경 내에서 셀 내용의 조직의 부족으로 인해 어렵습니다. 이 프로토콜 조직 소화와 개별 쥐의 신경에서 면역 세포 인구의 흐름 cytometry 분석에 대 한 충분 한 세포를 제공 하는 준비 하는 방법을 설명 합니다.

단일 좌 골 신경 및 Cytometry 사용 하 여 단일 마우스에서 지 루트 신경 절에 면역 세포의 분석

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

analysis-immune-cells-single-sciatic-nerves-dorsal-root-ganglion-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K 조회수.  University Hospital of Heidelberg. 정량 분석 murine 좌 골 신경 내에서 셀 내용의 조직의 부족으로 인해 어렵습니다. 이 프로토콜 조직 소화와 개별 쥐의 신경에서 면역 세포 인구의 흐름 cytometry 분석에 대 한 충분 한 세포를 제공 하는 준비 하는 방법을 설명 합니다.

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Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required to define their phenotype and effector functions. Histochemical approaches are instrumental to determine the location of the infiltrating cells and to analyze the associated CNS pathology. However, in-situ histochemistry and immunofluorescent staining techniques are limited by the number of antibodies that can be used at a single time to characterize immune cell subtypes in a particular tissue. Therefore, histological approaches in conjunction with immune-phenotyping by flow cytometry are critical to fully characterize the composition of local CNS infiltration. This protocol is based on the separation of CNS cellular suspensions over discontinous percoll gradients. The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for identification of various immune cell populations in a single sample by flow cytometry.

The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for flow cytometric analyses.

Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

유동세포계측법에 의해 피해를 입은 척수 조직에서 면역 세포의 양적 평가 : 세포 정제 방법에 대한 소설을 사용

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 malignant gliomas soon after intracranial engraftment if the cancer cells are rendered deficient in their expression of the &#946;-galactoside-binding lectin galectin-1 (gal-1). More recent work now shows that a population of Gr-1+/CD11b+ myeloid cells is critical to this effect. To better understand the mechanisms by which NK and myeloid cells cooperate to confer gal-1-deficient tumor rejection we have developed a comprehensive protocol for the isolation and analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The method is demonstrated here by comparing PBMC infiltration into the tumor microenvironment of gal-1-expressing GL26 gliomas with those rendered gal-1-deficient via shRNA knockdown. The protocol begins with a description of&#160;how to culture and prepare GL26 cells for inoculation into the syngeneic C57BL/6J mouse brain. It then explains the steps involved in the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs from the early brain tumor microenvironment. The method is adaptable to a number of in vivo experimental designs in which temporal data on immune infiltration into the brain is required. The method is sensitive and highly reproducible, as glioma-infiltrating PBMCs can be isolated from intracranial tumors as soon as 24 hr post-tumor engraftment with similar cell counts observed from time point matched tumors throughout independent experiments. A single experimentalist can perform the method from brain harvesting to flow cytometric analysis of glioma-infiltrating PBMCs in roughly 4-6 hr depending on the number of samples to be analyzed. Alternative glioma models and/or cell-specific detection antibodies may also be used at the experimentalists&#8217; discretion to assess the infiltration of several other immune cell types of interest without the need for alterations to the overall procedure.

Presented here is a straightforward method for the isolation and flow cytometric analysis of glioma-infiltrating peripheral blood mononuclear cells that yields time-dependent quantitative data on the number and activation status of immune cells entering the early brain tumor microenvironment.

분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

신경 세포 유형의 표면에 대한 유동 세포 계측법 프로토콜 및 세포 내 항원 분석

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

신경과학

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

생체공학

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible genetic background. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a typical disease model of MS widely used for investigating the pathogenesis in which T lymphocytes specific for myelin antigens initiate an inflammatory reaction in CNS. It is very important to assess how lymphocytes in the CNS regulate the development of disease. However, the approach for measuring the quantity and quality of infiltrated lymphocytes in the CNS is very limited due to the difficulties in isolating and detecting infiltrated lymphocytes from the brain. This manuscript presents a protocol for that is useful for the isolation, identification, and characterization of infiltrated lymphocytes from the CNS and will be helpful for our understanding of how lymphocytes are involved in the development of the CNS autoimmune disease.

This manuscript presents a protocol to induce active experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice. A method for the isolation and characterization of the infiltrated lymphocytes in the central nervous system (CNS) is also presented to show how lymphocytes are involved in the development of CNS autoimmune disease.

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent evidence indicates a potential inflammatory component of the disease, with both T-cells and monocytes/macrophages potentially associated with the pathogenesis of OA. Further studies postulated an important role for subsets of both inflammatory cell lineages, such as Th1, Th2, Th17, and T-regulatory lymphocytes, and M1, M2, and synovium-tissue-resident macrophages. However, the interaction between the local synovial and systemic inflammatory cellular response and the structural changes in the joint is unknown. To fully understand how T-cells and monocytes/macrophages contribute towards OA, it is important to be able to quantitively identify these cells and their subsets simultaneously in synovial tissue, secondary lymphatic organs and systemically (the spleen and bone marrow). Nowadays, the different inflammatory cell subsets can be identified by a combination of cell-surface markers making multi-color flow cytometry a powerful technique in investigating these cellular processes. In this protocol, we describe detailed steps regarding the harvest of synovial tissue and secondary lymphatic organs as well as generation of single cell suspensions. Furthermore, we present both an extracellular staining assay to identify monocytes/macrophages and their subsets as well as an extra- and intra-cellular staining assay to identify T-cells and their subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue. Each step of this protocol was optimized and tested, resulting in a highly reproducible assay that can be utilized for other surgical and non-surgical OA mouse models.

Here, we describe a detailed and reproducible flow cytometry protocol to identify monocyte/macrophage and T-cell subsets using both extra- and intracellular staining assays within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue, utilizing an established surgical model of murine osteoarthritis.