우리 박사 지 앤 Horng 레이 연구소의 해양 생물학과, 국립 대만 해양 대학 3 플라스 미드 구조물을 제공 하기 위한 감사 합니다. 이 연구에 의해 그랜트 106-2311-B-197-001-과학의 부 및 기술 (대부분)에서 지원 되었다.

1입니다. 준비
<ol><li>곤충 세포 배양<ol>
<li>세포 배양의 50 mL를 준비 합니다. 이렇게 하려면 추가 항생제의 500 µ L (암포 B = 0.25 µ g/mL, 페니실린 단위/100ml, 스 = = 100 µ g/mL) 및 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS 또는 항생제) 없이 혈 청 무료 세포 배양에서의 5 mL. 참고: 사용 하기 전에 물 욕조에 30 분 동안 65 ° C에서 소 태아 혈 청을 열.</li>
		<li>Spodoptera frugiperda 를 유지 (나비목: Noctuidae), sf9 곤충 세포. 분리 ca. 25 cm2 셀 문화 플라스 크에서 세포의 80%는 플라스 크를 흔들어 하 고 가벼운 현미경 검사 법에서 확인. 다음, 새로운 25 cm2 셀 문화 플라스 크에 세포 현 탁 액의 50%를 전송 하 고 실 온에서 15 분 동안 연결할 셀을 허용. 5 mL 신선한 세포 배양 매체와 매체를 대체 하 고 28 ° c.에 인큐베이터에서 성장 통로 세포 세포 성장에 따라 2 ~ 3 일 마다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 transfection 플라스 미드의 준비<ol>
<li>삽입 대상 DNA 파편 (예: Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 유전자와 그것의 삭제 구조) pDHsp/V5-그의 PCR 기반 복제 방법11. 확인 식민지에 의해 변형 된 식민지의 성장을 PCR PCR 마스터 믹스 (X 2) pDhsp-f 2/Op-IE2R 뇌관을 사용 하 여 설정 합니다. 상업적인 시퀀싱 서비스 여 플라스 미드 시퀀스를 확인 합니다. 참고: 표 1 뇌관 PCR 및 해당 구문 사용을 보여 줍니다.</li>
		<li>문화 단일 시퀀스 세균성 식민지, 200 mL 파운드 매체 포함 하에서 상기 플라스 미드 구조물 (1.2 단계)를 포함 하는 항생제 (50 µ g/mL), 각각 선택 합니다.</li>
		<li>제조 업체의 지침12에 따라 미디 플라스 미드 키트를 사용 하 여 교양된 대장균 에서 플라스 미드를 추출 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 배양 매체와 8.5 mL 혈 청 무료 세포 배양 매체의 1.5 mL를 혼합 하 여 도금 매체를 준비 합니다.</li>
	<li>악티노마이신 D (ActD) 세포 배양 세포 배양 매체의 10 mL로 ActD 주식 (1 mg/mL)의 1.5 µ L을 추가 하 여 준비 (최종 농도 = 150 ng/mL). 4 ° c.에 게</li>
</ol>2. 단백질 과도 식
<ol><li>시드 셀<ol>
<li>Sf9 셀 문화 플라스 크를 흔들어 수확, 전복 그리고 세포 현 탁 액 50 mL 튜브에가 P10 피펫으로 여 hemocytometer를 10 µ L를 전송. 가벼운 현미경 셀 수를 계산 합니다.</li>
		<li>실 온에서 15 분 동안 24-잘 접시에 각 음에 3 × 105 sf9 세포를 플레이트. 중 도금의 0.5 mL에 매체를 바꿉니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플라스 미드의 transfection<ol>
<li>희석 세포 transfection 시 약: 100 µ L 세럼 무료 세포 배양 매체에 혼합 1 vortexing에 의해 세포 transfection 시 약의 희석 8 µ L s.</li>
		<li>혈 청 무료 세포 배양 매체와 혼합의 100 µ L에 플라스 미드 DNA (pDHsp70-Ac-P35/V5-그의 pDHsp70-Ly-IAP3/V5-그의 또는 pDHsp70-Ly-IAP3-비르/V5-그의 또는 pDHsp70-Ly-IAP3-반지/V5-그의)의 2 µ g 1에 대 한 vortexing에 의해 추가 (그림 2).</li>
		<li>희석된 플라스 미드 DNA 및 희석된 세포 transfection 시 약 (210 µ L), 결합 하 고 실 온에서 30 분 동안 1 미 품에 대 한 vortexing에 의해 혼합.</li>
		<li>P1000 피 펫에 의해 셀에 dropwise DNA transfection 시 혼합물의 210 µ L를 추가 합니다. 28 ° C 5 h에서 품 어.</li>
		<li>P1000 피 펫을 사용 하 여 세포 배양 매체의 0.5 mL에 도금 매체를 바꿉니다. 24-잘 접시 테이프로 밀봉 하 고 셀을 16 h 28 ° C에서 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>열 충격 transfected 세포: (물 표면에 떠 있는) 42 ° C 물 욕조에 접시를 넣어. 30 분 동안 열 고 28 ℃ 배양 기에 24-잘 접시를 반환 합니다.</li>
	<li>단백질 발현의 탐지<ol>
<li>1 h 5 h 열 충격 후, 셀 1 x PBS 버퍼의 0.5 mL을 짧게 세 번 씻어. 참고: 9 mL 소독 ddH2O 10 x PBS 버퍼의 1 mL을 추가 하 여 PBS 버퍼 PBS 버퍼 x 1 배 희석</li>
		<li>아래로 pipetting으로 SDS 로드 염료 x 1의 40 µ L로 세포를 lyse. 참고: PBS 버퍼 x 1의 30 µ L SDS 샘플 버퍼 x 4의 10 µ L를 혼합 하 여 SDS 로드 염료 x 4를 희석.</li>
		<li>10 분 열 블록에 98 ° C에서 단백질 견본을가 열 하 고 1 분 동안 스핀 다운 서쪽 오 점 분석 결과 대 한 얼음에 넣어.</li>
		<li>서쪽 오 점 분석 결과 Eslami 및 Lujan13에서 서쪽 오 점 분석 결과의 절차를 따릅니다. SDS 페이지 젤14실행: Coomassie 파란 얼룩 (각 로드 단백질 견본의 수량 잘 같은 금액은 확인 하기 위한 로딩 제어)를 받게 한 젤과 다른 서쪽에 들어서는 오 점 분석 결과, Eslami와 Lujan13 .</li>
		<li>토끼 안티-v 5 항 체 (5 mg/mL) (1: 5000 희석 농도 1 µ g/mL 작업 TBST 버퍼에서)와 염소-토끼 IgG-양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 공액 (0.8 mg/mL) (1:10000 희석 작업 TBST 버퍼에서 V5 태그 융해 단백질 검출 농도 0.08 µ g/mL)입니다. 참고: Polyacrylamide 17.5%의 비율을 조정 하면 될 단백질 분자량 < 17 kDa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 안티-apoptotic 활동 분석 결과
<ol><li>유전자 유도 세포 apoptosis: 2.3 2.1에서 상기 절차를 반복. 공동 1 µ g의 플라스 미드 DNA와 pDHsp/D-rpr/플래그-그의 플라스 미드 DNA (포함 apoptosis 유도 유전자)의 1 µ g transfect [pDHsp70/V5-그의 벡터 (부정적인 제어), pDHsp70-Ac-P35/V5-그의 (긍정적인 제어), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-그의 pDHsp70-Ly-IAP3-비르/V5-그의 또는 pDHsp70-Ly-IAP3-반지/V5-그의 각각.]. 5 h 후 열 충격 치료, 세포 생존 능력 분석 실험 (그림 2)을 수행 합니다.</li>
	<li>화학 유도 세포 apoptosis: 2.3 2.1에서 상기 절차를 반복. 2.1.2 단계에서 6 잘 플레이트의 각 음에 1 x 106 셀 sf9 플레이트. 플라스 미드 DNA의 4 µ g transfect [pDHsp70/V5-그의 벡터 (부정적인 제어), pDHsp70-Ac-P35/V5-그의 (긍정적인 제어), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-그의 pDHsp70-Ly-IAP3-비르/V5-그의 또는 pDHsp70-Ly-IAP3-반지/V5-그의 각각.]. 5 h 후 열 충격에 16 h ActD 세포 배양 매체의 2 mL와 sf9 세포를 치료 하 고 세포 생존 능력 분석 실험 (그림 2)를 수행 합니다. 참고: 6 잘 플레이트의 한 잘 커버를 최소 볼륨 1 mL 이다.</li>
	<li>위의 안티 apoptotic 활동 분석 결과 실험, 3.1과 3.2 triplicates에 포함을 수행 합니다.</li>
</ol>4. 세포 생존 능력 분석 실험
<ol><li>3 시간 1 분 1 x PBS 버퍼의 1 mL를 추가 하 여 치료 세포를 씻어. Pipetting 1 mL 1 x PBS 버퍼 0.04 %trypan 파랑을 포함 하 여 셀을 resuspend 하 고 실내 온도에 3 분 동안 얼룩. 세포 현 탁 액 1.5 mL microtube 전송할. 참고: 1 x PBS 버퍼 및 1 mL 0.4 %trypan 블루 솔루션의 9 mL를 혼합 하 여 0.4 %trypan 블루 솔루션을 희석.</li>
	<li>P10 피 펫과 hemocytometer를 10 µ L trypan 블루 스테인드 세포 현 탁 액을 전송 하 고 가벼운 현미경 가능한 그대로 셀.</li>
	<li>통계 분석<ol>
<li>기록 된 데이터를 계산 하 고 모든 계산에 대 한 의미 ± 사 우 스 다코타 존재.</li>
		<li>Microsoft Excel과 학생의 두 꼬리 t-검정에 의해를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다. P로 통계적으로 중요 한 데이터를 정의-값 < 0.05.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculoviruses+as+gene+expression+vectors.">Baculoviruses as gene expression vectors.</a> Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).</li><li>Theilmann, D. A., Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Family+Baculoviridae.">Family Baculoviridae.</a> Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. , 1129-1185 (2005).</li><li>Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H., Shields, V. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+nucleopolyhedrovirus'+taxonomic+position.">Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position.</a> Biological Control of Pest and Vector Insects. , 169-200 (2017).</li><li>Friesen, P. D., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+baculovirus+early+gene+expression.">Regulation of baculovirus early gene expression.</a> The Baculoviruses. , 141-170 (1997).</li><li>Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector.">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).</li><li>Luckow, V. A., Summers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+the+development+of+baculovirus+expression+vectors.">Trends in the development of baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).</li><li>Jarvis, D. L., Finn, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifying+the+insect+cell+N-glycosylation+pathway+with+immediate+early+baculovirus+expression+vectors.">Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).</li><li>Clem, R. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+programmed+cell+death+by+the+baculovirus+genes+p35+and+iap.">Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap.</a> Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).</li><li>Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. 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Separating Protein with SDS-PAGE Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2017)</li><li>Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+reaper-induced+apoptosis+by+interaction+with+inhibitor+of+apoptosis+proteins+(IAPs).">Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

열 충격 기반 pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템의 개념 처음 클레 멘 타인 외. 19948에 의해 설명 되었다. Baculoviral 유전자 발기인 (IE1)와 초파리 hsp70 의 비교는 hsp70 모기 셀10높은 효율을 했다 보여주었다. 또한, 열 충격 유도 때문 단백질 식의 타이밍은 열 충격 처리 후 정확 하 게 제어할 수 수 있습니다. 이 시스템은 다음 새우와 nucleopolyhedroviru...

두 단백질 표정 시스템 단백질 생산을 위해 일반적으로 사용 되었습니다: 원핵생물 단백질 표정 시스템 (대장균 유전자 표현 시스템) 및 진핵생물 단백질 표정 시스템. 하나의 인기 있는 진핵생물 단백질 식 시스템은 잠재 식 벡터 시스템 (BEVS)1. Baculoviruses 먼저 농업의 전세계 생물 관리 요원으로 사용 되었다 산림 해충 및. 지난 몇 년간, baculoviruses 단백질 표정 벡터도를 위한 바이오 도구로 개발 되었다. 더블-좌초 원형 DNA 및 엔벌로프된 nucleocapsids2baculoviruses의 게놈에 의하여 이루어져 있다. 날짜 하려면, seventy-eight 잠재 이상 격리 시퀀스3되었습니다. 호스트 곤충 세포에서 baculoviral 유전자 식의 시간적 cascade를 바탕으로, 유전자 전사 4 시간 계곡, 즉시 초기 지연-초기, 늦은, 그리고 매우 늦은 유전자4등으로 분류 될 수 있습니다.
매우 늦은 유전자 발기인 (즉, 다면체 또는 p10 발기인) 대상 유전자 재조합 잠재 동종 재결합에 의해 생성 하는 동안 운전 하는 데 사용 되었다 BEVSs 지정 되었다. 재조합 잠재 하 여 곤충 세포에서 외국 단백질의 표정은 포유류 단백질 (당단백질 생산에 적합 한) 포스트 번역 상 수정에서의 비슷합니다. 따라서,는 잠재 널리5,,67되었습니다. 그러나, 한 가지 한계 곤충 세포7다른 N glycosylation 통로의 존재입니다.
따라서, 새로운 잠재 식 시스템, 변이 유전자 표현 시스템 개발 되었다. 이 시스템은 곤충 세포에서 baculoviral 즉시 초기 발기인 (발기인즉-1 )의 드라이브에서 외국 유전자를 표현합니다. 이 시스템을 사용 하 여 대상 단백질 표현할 수 있습니다 즉시 즉-1 발기인의 통제에 곤충 세포에서 N glycosylation 통로 더 나은 N 연결 oligosaccharides7에 결과 수정 하는 동안. 또한, baculoviral 즉시 이른 유전자 호스트 세포 RNA 중 합 효소 II에 의해 복사할 수 있습니다 그리고 어떤 바이러스 성 요인 활성화4에 대 한 필요 하지 않습니다. 따라서, 외국 단백질 곤충 세포는 짧은 시간 내에 표현할 수 있습니다. 날짜 하려면, 과도 유전자 표현 시스템 잠재 체 외에서 세포 문화 시스템에서 단백질 기능 분석을 수행 하기 위한 가장 중요 한 기술 중 하나입니다. 잠재 또는 외국 단백질의 기능을 분석 하는 시스템을 적용할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 변이 유전자 표정 시스템 중 하나는 Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 및 OpIE1 발기인)의 즉시 이른 유전자 (IE) 발기인을 기반으로 합니다.
그러나, 곤충 세포에서 외국 유전자의 식 저수준은 여전히 문제가 OpIE 과도 유전자 발기인 기반 식 시스템은 사용된8,,910. 따라서, 다른 변이 유전자 표현 시스템 초파리 열 충격 단백질 70 (hsp70) 유전자8,9발기인에 따라 건설 되었다. H s p 70의 발기인 baculoviral IE 발기인 곤충 세포10열 충격에 의해 유도 된 때 보다 더 효율적으로 작동 합니다. 이 시스템에서 대상 유전자는 초파리 열 충격 70 (Dhsp70) 발기인의 드라이브에서 표현 되었다. 외국 유전자 PCR 기반 복제 방법으로 일시적인 유전자 식 플라스 미드에 쉽게 복제 수 있습니다. 또한, 열 충격 유도 의해 유전자 발현에 대 한 타이밍의 제어를 수행할 수 있습니다.
이 보고서에서 우리는 접근 따르고 (apoptosis 3의 억제 물, iap3 Lymantria xylina MNPV에서에서) baculoviral 유전자의 3 개의 다른 잘림 열 충격에 기초를 둔 일시적인 단백질 식 시스템을 사용 하 여 표현 하 고 추가 안티-apoptotic 활동 분석에이 표현한 단백질을 적용 합니다. 이 시스템 수 중 외국 단백질 신속 하 게 또는 또한 다른 단백질 활동 분석 실험에 적용할 가능성을 하면서 sf9 세포에서 단백질 안티 apoptotic 활동의 평가에 적용할 추가.

<table><tbody><tr><td>Antibiotic-Antimycotic, 100X</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>for insect cell culture</td></tr><tr><td>Certified Foetal Bovine Serum</td><td>Bioind</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher</td><td>10902096</td><td>serum-free cell culture medium</td></tr><tr><td>Sf9 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 cell culture flask</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>156340</td><td></td></tr><tr><td>Inverted light microscopy</td><td>WHITED</td><td>WHITED WI-400</td><td></td></tr><tr><td>RBC HIT Competent Cell</td><td>Bioman</td><td>RH618-J80</td><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; (DH5&amp;alpha;)</td></tr><tr><td>L.B. Broth (Miller)</td><td>Bioman</td><td>LBL407</td><td></td></tr><tr><td>Agar, Bacteriological Grade</td><td>Bioman</td><td>AGR001</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-zn-1</td><td>selection antibiotic</td></tr><tr><td>PCR Master Mix (2X)</td><td>ThermoFisher</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free)</td><td>Geneaid</td><td>PIE25</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin D</td><td>SIGMA</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50 mL centrifuge tubes</td><td>SIGMA</td><td>CLS430829-500EA</td><td>50 mL tubes</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Gizmo Supply Co</td><td>B-CNT-SLDE-V2</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Multidish</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>142475</td><td>24-well plate</td></tr><tr><td>Cellfectin II Reagent</td><td>Thermo Fisher</td><td>10362100</td><td>cell transfectin reagent</td></tr><tr><td>PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;times;SDS Loading Dye</td><td>Bioman</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes)</td><td>Merck Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>PVDF membranes</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell system</td><td>BIO-RED</td><td>1703930</td><td>Blotting device</td></tr><tr><td>Ponceau S solution</td><td>SIGMA</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-V5</td><td>SIGMA</td><td>V8137</td><td>rabbit anti-V5 antibody</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP)</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>817072</td><td></td></tr><tr><td>6-Well Multidish</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>145380</td><td></td></tr><tr><td>0.4 % trypan blue solution</td><td>AMRESCO</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>P10 pipetman</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Tape</td><td>Symbio</td><td>PPS7</td><td>24 well tape ( 19 mm&amp;times;36 M)</td></tr></tbody></table>

transient expression of foreign genes in insect cells (sf9) for protein functional assay

변이 유전자 표현 시스템 잠재 체 외에서 세포 문화 시스템에서 단백질 기능 분석을 수행 하기 위한 가장 중요 한 기술 중 하나입니다. 이 시스템은 과도 식 플라스 미드에 baculoviral 발기인의 통제 익스프레스 외국 유전자를 개발 되었다. 또한,이 시스템은 자체 잠재 또는 외국 단백질 기능 분석 결과에 적용할 수 있습니다. 가장 광범위 하 게 그리고 상업적으로 사용 가능한 변이 유전자 식 시스템 Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV)의 즉시 이른 유전자 (IE) 발기인에 따라 개발 된다. 그러나, 낮은 식 수준 외국 유전자 곤충 세포에서 관찰 되었다. 따라서, 일시적인 유전자 표현 시스템 단백질 식 향상을 위한 건설 되었다. 이 시스템에서 재조합 플라스 미드는 초파리 열 충격 70 (Dhsp70) 발기인의 통제 대상 시퀀스를 포함 하도록 건설 되었다. 이 프로토콜의이 열 충격 기반 pDHsp/V5-그의 (6 히스티딘와 V5 epitope) 응용 프로그램 선물 /Spodoptera frugiperda 셀 (sf9 셀) 시스템; 이 시스템은 또한 곤충 세포에서 후보 단백질의 안티-apoptotic 활동을 평가 하기 위한 유전자 발현 뿐만 아니라 가능 하다. 또한,이 시스템 중 한 재조합 플라스 미드와 페 수 또는 두 개의 잠재적으로 기능적으로 대립 곤충 세포에서 재조합 플라스 미드를 페 공동. 프로토콜이이 시스템의 효율성을 설명 하 고이 기술의 실용적인 사례를 제공 합니다.

전체 길이 LyxyMNPV에서 Ly-IAP3의 다른 두 잘림 (BIR 및 도메인) 했다 overexpressed sf9 셀에는 열 충격 기반 pDHsp/V5-그의 기반 /Spodoptera frugiperda 셀 (sf9 셀) 시스템. pDHsp/V5-그의 초파리 열 충격 단백질 발기인, 셀룰러 transcriptional 요인과 번역 시스템 (그림 1)8 를 사용 하 여 다운스트림 유전자 발현 온도 42 ° C 조건에서 드라이?...

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Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

이 프로토콜 열 충격 유발 단백질 식 시스템 (pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템), 외국 단백질을 표현 하거나 안티 apoptotic 활동의 잠재적인 외국 단백질 및 그들의 잘린 아미노 평가에 사용 될 수 있는 설명 곤충 세포에서 산입니다.

과도 식의 외국 유전자 단백질 기능 분석 결과 대 한 곤충 세포 (sf9)

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

12.2K 조회수.  National Ilan University. 이 프로토콜 열 충격 유발 단백질 식 시스템 (pDHsp/V5-그 의/sf9 셀 시스템), 외국 단백질을 표현 하거나 안티 apoptotic 활동의 잠재적인 외국 단백질 및 그들의 잘린 아미노 평가에 사용 될 수 있는 설명 곤충 세포에서 산입니다.

비디오: Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

연구

유전학

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were found up-regulated in the resistant house fly strain, whereas their roles in conferring insecticide resistance remained to be explored. Here, we designed a protocol for the functional characterization of carboxylesterases. Three example experiments are presented: (1) expression and isolation of carboxylesterase proteins through a baculovirus-mediated insect Spodoptera frugiperda (Sf9) cell expression system; (2) a cell-based MTT (3-[4, 5-dimethykthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) cytotoxicity assay to measure the tolerance of insect cells to different permethrin treatments; and (3) in vitro metabolic studies to explore the metabolic capabilities of carboxylesterases toward permethrin. The carboxylesterase gene Md&#945;E7 was cloned from a resistant house fly strain ALHF and used to construct a recombinant baculovirus for Sf9 cells infection. The cell viabilities against different permethrin treatments were measured with the MTT assay. The enhanced cell tolerance of the experimental group (Md&#945;E7-recombinant baculovirus infected cells) compared with those of the control groups (CAT-recombinant baculovirus infected cells and GFP-recombinant baculovirus infected cells) to permethrin treatments suggested the capabilities of Md&#945;E7 in metabolizing insecticides, thereby protecting cells from chemical damages. Besides that, carboxylesterase proteins were expressed in insect Sf9 cells and isolated to conduct an in vitro metabolic study. Our results indicated a significant in vitro metabolic efficiency of Md&#945;E7 toward permethrin, directly indicating the involvement of carboxylesterases in metabolizing insecticides and thus conferring insecticide resistance in house flies.

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Here, we present a protocol to produce house fly carboxylesterase proteins in vitro with a baculovirus mediated insect cell expression system and later functionally characterize their roles in metabolizing permethrin, thereby, conferring pyrethroid resistance by conducting cell-based MTT assay and in vitro metabolic studies.

살충제 내성 집 파리, 파리 자리 부채 에 Carboxylesterases의 기능 특성

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

생화학

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The baculovirus-mediated insect cell expression system is one of the systems used to express recombinant eukaryotic secretory proteins with some post-translational modifications. The secretory proteins need to be routed through the secretory pathways for protein glycosylation, disulfide bonds formation, and other post-translational modifications. To improve the existing insect cell expression of secretory plant proteins, a baculovirus expression vector is modified by the addition of either a GP67 or a hemolin signal peptide sequence between the promoter and multiple-cloning sites. This newly designed modified vector system successfully produced a high yield of soluble recombinant secreted plant receptor proteins of Arabidopsis thaliana. Two of the expressed plant proteins, the extracellular domains of Arabidopsis TDR and PRK3 plasma membrane receptors, were crystallized for X-ray crystallographic studies. The modified vector system is an improved tool that can potentially be used for the expression of recombinant secretory proteins in the animal kingdom as well.

Here, we present the protocols for utilizing the insect cell and baculovirus protein expression system to produce large quantities of plant secreted proteins for protein crystallization. A baculovirus expression vector has been modified with either GP67 or insect hemolin signal peptide for plant protein secretion expression in insect cells.

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble effectively in vitro. Such complexes may require co-translational assembly and the presence of molecular chaperones; either they form stable oligomers which cannot dissociate and re-associate in vitro or are unstable without a binding partner. To overcome these problems, it is possible to use a method based on the bacterial co-expression of differentially tagged proteins using a set of compatible vectors followed by the conventional pulldown techniques. The workflow is more time-efficient compared to traditional pulldown because it lacks the time-consuming steps of separate purification of interacting proteins and their following incubation. Another advantage is a higher reproducibility due to a significantly smaller number of steps and a shorter period of time in which proteins that exist within the in vitro environment are exposed to proteolysis and oxidation. The method was successfully applied for studying a number of protein-protein interactions when other in vitro techniques were found to be unsuitable. The method can be used for batch testing protein-protein interactions. Representative results are shown for studies of interactions between BTB domain and intrinsically disordered proteins, and of heterodimers of zinc-finger-associated domains.

Here, we describe a method for the bacterial co-expression of differentially tagged proteins using a set of compatible vectors, followed by the conventional pulldown techniques to study protein complexes that cannot assemble in vitro.

까다로운 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위한 시간 효율적인 도구로서 박테리아 세포의 공동 발현과 결합된 풀다운 분석

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

다단계 가닥 변위 리소 그래피를 사용 하 여 유전자의 기능 표면-동원 정지

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

생체공학

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

인간의 세포에서 분비 단백질의 생산을위한 편리하고 일반적인 표현 플랫폼

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

생물학

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

소설 및 액세스 접근 : 구조 HEK 293F 서스펜션 세포의 생물학에 대한 재조합 단백질 발현

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...