이 작품은 미국 국립 과학 재단 기금 # MCB-0741914 및 MCB-0843627에 의해 지원되었다; 추가 infrastructural 지원은 건강 2의 국립 연구소 연구 자원을위한 국립 센터에서 G12 RR03060-26에 의한 뉴욕시 대학에서 제공했습니다. 우리는 기꺼이 그 JKC는 M82 (야생 유형) 및 CM15 (돌연변이) 토마토 손톱를 제공해 주셔서 코넬 대학 식물 생물학과에서 그룹을 장미 인정합니다. 우리는 AFM 실험과 그의 관대한 도움을위한 교수 알렉산더 Couzis의 CCNY 화학 공학 그룹에서 박사 Spyros Monastiriotis 감사드립니다. 우리는 그래픽 디자인 지원을 위해 양 로렌 Gohara 감사드립니다.

1. 토마토의 효소 고립은 5 손톱 <ol><li> 그릇에 여러 상업적 또는 경지 토마토를 놓습니다. 큰 섹션 과일의 피부 보지, 내부 과피 조직을 버리고. 탈이온수와 토마토 스킨을 씻고 비이커에 물 속에 그들을 보존. </li><li> 200 ML 추가, 나트륨 아세테이트 trihydrate의 1.22 G (M r에. 136.08 g / 몰)와 비커에서 2.34 ML 빙초산 (17.485 M)를 넣어 50 밀리미터 산도 4.0 아세트산 나트륨 버퍼를 (° C 31에서) 준비 31 살에 4.0으로 산도를 조정 후 탈이온수, 그리고 ° C. , 13 밀리그램 할머니 3;, cellulase의 0.2 G (1.3 단위 / MG 고체, 시그마 알드리치 EC 232.734.4); pectinase (10 U ML -1, TCI 미국 EC 3.2.1.15) 4 ML을 포함하는 혼합물을 준비한다 그리고 최종 효소 칵테일 200 ML을 얻기 위해 효소 혼합물에 아세트산 나트륨 버퍼의 196 ML에 추가합니다. 5 완전히 효소 칵테일 벗겨 토마토 껍질을 담가과 부화31 살에 ° 일정한 진동 (G24 환경 보육 흔드는, 뉴 브 런 즈윅 과학 주식 회사)와 24 시간 동안 C #. </li><li> 주방 스트레이너 또는 Büchner 유입 경로 및 탈이온수 그들을 씻어을 사용하여 토마토 스킨을 수집합니다. 이후, 1 시간 동안 실온에서 진공 오븐에서 그들을 넣습니다. 이후 dewaxing 수속 라벨과 공을 병에 말린 토마토 스킨을 보존. </li></ol> 2. Soxhlet 추출 6 시까지 철저한 Dewaxing <ol><li> 철저한 dewaxing에 사용되는 장비는 열원 (가열 맨틀과 Variac 컨트롤러), 용매 저수지에 대한 둥근 바닥 플라스크, Soxhlet 추출기, 소결 유리 골무 또는 일회용 추출 골무, 안티 지원해주 칩 콘덴서 (그림 참조로 구성되어 있습니다. 1). 좁은 사이펀 암 (부품 그림 6 및 7. 1)주의 취급을 필요로하는, 매우 섬세하고 파손하는 경향이있다합니다. </li><li> (에서 얻어진 토마토 피부의 0.5-1 g을 넣고절구 1 단계.), 그리고 샘플 AFM 측정 (5 항)에 사용할 수없는 한 유봉과 거친 분말로 샘플을 갈다. 샘플로 약 절반을 소결 - 유리 또는 일회용 골무를 작성하고 추출 열의 기지에 신중을 배치 핀셋을 사용합니다. </li><li> 콘덴서를 부착하고 알루미늄 호일로 싸서. 몇 반 지원해주 칩의 면전에서 메탄올 용매 (ACS 학년)를 가열 플라스크의 벽에 그것이 부드럽게 종기와 refluxes까지. 글라스 울과 알루미늄 호일을 모두 가진 용매 저수지를 커버. 골무가 가득 차면 Soxhlet 장치 내에 저수지는 초당 약 드롭을 축적하도록 Variac 전압을 조정하고 몰래, 1 시간 동안 프로세스가 발생합니다 확인합니다. </li><li> 12 H의 추출 과정을 계속 다음 가열 맨틀을 절감하고 장치가 식다 수 있습니다. 용매 처분하기위한 하나의 단위로 추출기와 저수지를 제거합니다. 핀셋을 사용RS는 불과 추출 열의 목 아래 골무를 높이 그것의 용매 초과 드레인, 그리고 깨끗한 표면에 골무을 배치합니다. 아래 플라스크에 몰래 있도록 추출 컬럼을 기울이십시오. 술병을 분리하고 분류 폐기물 용매 콘센트에 폐기물을 붓는다. </li><li> 점차적으로 감소 극성, 각각의 경우 12 H에 대한 예, 클로로포름과 헥산의 연속 용매에 대한 단계 2.3 및 2.4를 반복합니다. </li><li> 토마토 cutin 예제 골무 내부 역시 그 위에 질소 가스의 흐름을 폭파하거나 실온에서 진공 오븐에 넣어 의한 건조하도록 허용합니다. 마지막으로, 건조한 시료의 질량을 측정하고 parafilm으로 봉인 나사 최고 항아리에 실온에서 보관. </li></ol> 3. Epicuticular 및 Intracuticular 왁스 3,4의 선택적 분리 <ol><li> 첫째, 증류수로 전체 토마토 (1에서 설명과는 토마토 별도의 배치.) 씻는다. 아빠와 함께 그들을 말리어 수건과 Kimwipes, 장소 그들을 알루미늄 호일의 조각을 아래로 줄기. </li><li> 1백20퍼센트 (W / W, 대량 비율) 패션 아래 상단에있는 아라비아 고무 수용액으로 전체 토마토를 바르고 얇은 필름을 떠나는 과일의 피부에 건조를 아랍어 껌를위한 한 시간 정도 허용합니다. 하지 찔린 토마토 피부에 신중하다고, 족집게를 사용하여이 필름을 제거합니다. 한 번 더 절차를 반복합니다. </li><li> 3 분 1시 1분 (V / V) 클로로포름 - 물과 혼합을 포함하는 튜브에 필름을 추가합니다. 격렬한 교반 및 위상 분리 후, 클로로포름 분수를 피펫과 epicuticular 왁스를 떠나, 별도의 덮개가 튜브 안에 그들을 증발. 토마토는 물리적으로 그대로 유지됩니다. 상온에서 2 분 동안 클로로포름으로 그들을 찍어와 용매를 증발 후 intracuticular 왁스를 수집합니다. 이제 토마토 껍질과 (와 같은 설명에 각각 셀룰로오스 및 펙틴을 제거 (아세트산 나트륨 완충액의 cellulase와 pectinase 포함) 효소를 취급 <str긴 사연&gt; 1). </li><li> 원하는 경우 다양한 극성 세 용제를 (각각 메탄올, 클로로포름과 헥산,)를 사용하여, (단계 2 참조) Soxhlet 추출하여 이러한 효소 격리된 손톱에 든다 dewaxing을 수행합니다. </li></ol> 4. 교차 편광에 의한 토마토 과일 Cutin의 분자 특성화 매직 앵글 회전 고체 핵 자기 공명 (CPMAS ssNMR) 6 <ol><li> 공급 업체 제공 포장 도구를 사용하여 1.6 mm fastMAS 지르코니아 로터의 완전 dewaxed 토마토 손톱 (cutins) 장소 4-6 밀리그램. (지상 dewaxed 토마토 손톱 또는 일부 dewaxed 손톱의 아주 작은 조각 하나에 적합합니다.) 로터에 너무 밀접하게 샘플이 균일하게 포장되었는지 확인하지만. 상단 모자를 씌우고 후, 스핀 속도의 측정을 용이하게하기 위해 검정색 잉크 마커 펜으로 캡의 절반을 그리다. </li><li> 절반 높이에서 최소 스펙트럼 선폭을위한 NMR 분광계의 shimming 조정ND는 양성자 (1 H)을 교정하고 탄소 (13 C) 90 같은 adamantane 같은 표준 화합물을 사용 ° 펄스 폭을. </li><li> 모델 화합물로 글리신이나 글루타민을 사용 (하트만-돼야 해 한이 일치하는 전력 레벨, 1 H - 13 C 접촉 시간, 헤테로핵 1 H 감결합 강도) 모든 매개 변수를 최적화하여 최대 신호 강도를 얻을 교차 편광 마술 - 각도 회전의 (CPMAS) 실험. 600 MHz의의 1 H 주파수에서 얻은 스펙트럼을 권장 조건은 10 kHz에서 15 kHz에서 회전 주파수, 인수 사이에 3 초 지연, 그리고 185 kHz에서의 주파수에 상응하는 자기장 강도에서 7 감결합 척추 헤테로핵 양성자를 포함합니다. </li><li> probe에 cutin - 팩킹된 로터를 삽입합니다. 그런 다음 자석으로 프로브를 놓습니다. 점차적으로 좋은 샘플 포장 및 로터의 안정성을 확인하기 위해 최대 10 kHz에서까지 회전 속도를 높이십시오. 회전자의 최종 회전 안정성 내에서 확인± 20 Hz에서. </li><li> 튜닝 조정과 프로브의 콘덴서와 일치하는 것은 iteratively 1 H와 13 C NMR 주파수 모두에서 최소 전력 반사를 얻을 수 있습니다. 25 실험 온도를 설정합니다 ° C (또는 상온). </li><li> 10 kHz에서 회전 주파수에서 결정 하트만-돼야 해 한이 검색 조건에 해당하는 미리 최적화된 CPMAS 실험을 시작합니다. </li><li> 지수 (Lorentzian) 라인 50-100 Hz의 확대와 함께 4096 과도, 조건 스펙트럼을 습득하고, 푸리에는 신호 강도 대 화학 차폐 (PPM)의 NMR 스펙트럼을 생성하기 위해 변환하지. </li><li> 표준으로 8 - 13 C 화학은 외부에서 38.4 PPM (-CH 그룹 2)에서 adamantane 세트를 사용하여 교대 참조. </li><li> 15 kHz에서로 로터 회전 주파수를 증가하고이 후자의 회전 주파수에서 결정 하트만-돼야 해 한이 검색 조건에 해당하는 CPMAS 측정 (단계 4.6-4.8) 반복합니다. </li><li> Repe자연 (밀랍)과 부분적으로 dewaxed 과일 표피 샘플로 CPMAS 실험 (단계 4.1-4.9)에서. </li></ol> 5. 원자 힘 현미경과 토마토 표피 표면 프로빙 (디지털 인스 트루먼 트의 Nanoscope IIIa을; 절차 현미경 사이에 약간 다릅니다) 6 <ol><li> 스캐닝 프로브 현미경 (SPM)를 켭니다 (그림 2)와 현미경 모드 토글 스위치가 접촉 원자 힘 현미경 (AFM) 모드로 설정되어 있는지 확인합니다. </li><li> 수동으로 두개의 사용자가 조절 가능한 전면 단자를 설정하여 SPM 헤드를 올립니다. 머리 뒤쪽에서 클램핑 스크류를 회전하여 SPM 헤드에서 AFM의 tipholder를 분리합니다. </li><li> tipholder에서 기존의 AFM의 캔틸레버를 제거하려면 족집게를 사용하여 다음 조심스럽게의 패키지에서 새로운 실리콘 질화물 캔틸레버 (AFM 탐침)을 잡고 옛 캔틸레버의 장소에 설치하십시오. 새로 설치된 AFM의 캔틸레버가 깨진되지 않았는지 확인하기 위해 가벼운 현미경을 사용합니다. </li><li> 일 첨부전자 토마​​토 표피 샘플 양면 테이프와 스테인레스 스틸 디스크 (샘플 퍽을)까지 (일부 dewaxed 토마토 표피의 섹션 ~ 10mm × 10 밀리). 표피 표면이 평평하고 퍽을에 대한 샘플의 배치 이후 원활한 유지하는지 확인하기 위해 가벼운 현미경을 사용합니다. </li><li> SPM 스캐너 상단의 자기 지역쪽으로 토마토 표피 샘플로 퍽을를 놓습니다. </li><li> 손잡이를 회전하여 높은 스캐너의 전면이 수동 조절 나사를 설정하고, 다른 두 전면 나사 등 거의 동일한 수준으로 동력 다시 조정 나사를 설정합니다. 세 개의 나사가 SPM 헤드에 tipholder를 삽입했을 때 AFM 팁을 깨는 피하기 위해 충분히 높게 설정되어 있는지 확인합니다. </li><li> SPM 헤드에 tipholder를 꽂아과 머리 뒤쪽에 클램핑 스크류를 강화하여 고정하십시오. </li><li> 레이저 켠 후, 머리 꼭대기에 중앙 (Y)과 오른쪽 (X) 레이저 조정 단자를 사용하여 AFM의 캔틸레버에서 레이저 자리를 맞춥니다.정확히 AFM의 캔틸레버의 끝에 레이저 스폿을 배치하기 위해 종이에 비치는 레이저 광선을 모니터링합니다. </li><li> 이동식 미러 iteratively 따라서 반사 레이저 빔을는 광검출기의 네 quadrants에 의해 균일하게 수신되고 있도록, 최대 신호 (SUM 신호)를 달성하기 위해 광검출기 조정 단자를 사용하는 위치를 조정합니다. </li><li> 시각적으로 거꾸로 현미경으로 시료 표면에 대한 AFM 팁의 접근을 모니터링, retracting 수동 조정 전면 나사에 의해 AFM 팁 및 SPM 스캐너의 동력 다시 조정 나사를 낮춥니다. 세 개의 나사가 이미징 기울어진 샘플에서 유물을 피하기 위해 동일한 수준에 있는지 확인합니다. 샘플 대한 팁을 제공하지만, 너무 가까이 그렇지 팁 처리 또는 시료 표면을 뚫고 나옵니다. </li><li> 이때 레이저 빛이 AFM의 캔틸레버가 광검출기에 이동식 거울에서 반사됩니다 오프 반영. sili와 접촉 AFM 모드죄수 질화 AFM 팁을은 0 V 설정 값과 비교 신호 (수평 / 수직 변화)에 미러의 위치를​​ 조정하여 0 V에 대해 -2 V로 출력 신호 (수직 편향) 전압을 설정합니다. </li><li> Nanoscope 소프트웨어를 사용하여 현미경 아이콘을 클릭하여 해당 프로필 (접촉 모드 AFM)을 선택합니다. </li><li> &quot;스캔 컨트롤 설정&quot;패널을 사용하여 스캔 속도와 스캔 크기 예를 들어, 10 미크론 스캔 크기와 2 Hz에서 스캔 속도를 설정합니다. </li><li> AFM 팁이 관여 - 팁 아이콘을 클릭하여 샘플 표면을 참여하도록 허용합니다. 이것은 샘플 표면을 종사 때까지 SPM 기지 동력 뒤쪽 나사를 조절함으로써, 프로그램은 이제 끝을 낮출 것이다. 제보가 성공적으로 종사되면 검색 프로세스가 자동으로 시작됩니다. </li><li> iteratively 최고를 달성하는 등 설정점, 적분 게인, 비례 게인, 스캔 크기, 스캔 속도, 선 및 샘플 / 라인과 같은 매개 변수를 조정 소프트웨어의 이미지와 범위 모드를 사용하여 스캔 과정을 모니터링해상도 이미지. 대형 Z 축 범위 (데이터 규모)로 스캔 시작, 다음 조심스럽게 이미지 표면 기능의 최고의 대비를 관찰하는 데이터 스케일 값을 줄일 수 있습니다. 표면 기능의 높이가 가능한 Z 축 범위를 초과하는 것으로 나타났습니다 스캔한 이미지의 흰색 영역의 발생을 최소화합니다. </li><li> 데이터 파일을 저장하는 이미지를 캡처, 다음 스캔 라인 사이의 오프셋 수직 (Z) 스캐너 드리프트, 이미지 리본, 그리고 수직으로 인해 이미지 아티팩트를 제거하려면 납작 함수를 사용하여 데이터를 처리, 9 결국 평균 거칠기를 계산. 데이터를 저장 후, 그것을 작동하는 데 사용된 컴퓨터 제어 스크류 모터의 동작을 반대하여 AFM 팁을 접어야합니다. 이미지 처리는 오프라인 이미지 분석 모드 및 / 출연하거나 다른 컴퓨터를 사용하는 경우가 있습니다. </li><li> 스캔 영역의 x와 y 위치를 변경하는 팁 홀더의 전면 하단에 회색의 금속 단자를 사용하여, 그리고 5 샘플 로카에서 측정을 반복tions은 이미지 품질이 세게 나오시면 AFM의 캔틸레버를 교체, 재현성을 확인합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 CPMAS 13 C NMR 스펙트럼의 화학 변화 분석 (그림 3)는 철저하게 dewaxed 토마토 표피 (cutin)에있는 주요 기능 그룹을 식별. cutin biopolyester의 주요 탄소 moieties은 긴 사슬 aliphatics (0-45 PPM), 산소 aliphatics (45-110 PPM), 곱하기 - 보세 및 방향족 (110-160 PPM) 및 carbonyls (160-220 것으로 발견되었습니다 PPM). 산소 알킬 moieties은 (CHO + CH 2 O)함으로써 cutin 모체의 분자 구조를 형성 cutin의 생체 고분자의 monomeric 단위 사이에 공유 결합 관계를 확립에 중요한 역할을한다. 45과 100 PPM 사이의 스펙트럼 영역에서 관찰 상대적인 피크 영역의 차이는 돌연변 cutin 교차 링크 성형 CHO structura의 비교적 큰 비중을 가지고하는 것이 좋습니다<html> 난 moieties가에 비해 야생 형 cutin; 직접적인 분극 (DPMAS) NMR 다섯 가지 방법을 사용하여주의 정량 측정이 추론을 지원 (데이터가 표시되지 않음). CPMAS 13 C NMR 스펙트럼은 또한 cutin 생체 고분자의 주요 화학 구조를 유지하면서 cutin-왁스 복합체에서 에피와 intracuticular 왁스의 순차적인 제거를 나타내는, 31 PPM (그림 4)에서 점차적으로 감소 왁스 피크를 보여주었다. 병렬 AFM 이미지 분석 (그림 5) cuticular 어셈블리의 조직 변경을 나타내는, 과일 표피로부터 에피와 intracuticular 왁스의 stepwise 추출에 의한 표면 부정을 공개했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig1.jpg" /> . 그림 1 Soxhlet 추출기 (이미지 출처 : 위키백과). &quot;/&gt; 그림 2.) 스캐닝 프로브 현미경. B) SPM 헤드 (디지털 인스 트루먼 트에서 제공 AFM 훈련 설명서에서 적응). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig3.jpg" /> 그림 3. 야생 - 타입 (M82) 및 돌연변이로부터 철저하게 dewaxed 빨간색으로 익은 토마토 과일 손톱 (cutins)의 150 MHz의 CPMAS 13 C NMR의 스펙트럼은 (CM15) 화학적으로 resonances을 보여주는 교차 연결된 hydroxyfatty 산의 기능 그룹에 해당 옮겨 보겠습니다 기반은 폴리 에스테르와 일부 증식 접착 moieties. 모든 스펙트럼는 10 kHz에서 회전 주파수와 함께 인수했다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig4.jpg" /> 그림 4. 상업 빨간색 익은 토마토 과일 손톱의 150 MHz의 13 CCPMAS NMR의 스펙트럼은 순서대로 아라비아 고무 기계 추출하여 epicuticular 및 intracuticular 왁스의 제거 및 TW시 작곡 변화를 전시O 분 클로로포름 물놀이, 각각. 모든 스펙트럼는 15 kHz에서 회전 주파수와 함께 인수했다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig5.jpg" /> 그림 5. AFM 이미지 및 부분적으로 dewaxed 상업 토마토에 대한 거칠기 견적 epicuticular (왼쪽)와 intracuticular (오른쪽) 왁스의 stepwise 제거 후 그림 4에 설명되어 손톱.

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A. 106, 127-131 (1994).</li><li>lessandrini, A., Facci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM:+a+versatile+tool+in+biophysics.">AFM: a versatile tool in biophysics.</a> Measurement Sci. &#38; Tech. 16, 10-1088 (2005).</li><li>Ben&#237;tez, J. J., Matas, A. J., Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+plant+biopolyester+cutin+by+AFM+and+spectroscopic+techniques.">Molecular characterization of the plant biopolyester cutin by AFM and spectroscopic techniques.</a> J. Struct. Biol. 147, 179-184 (2004).</li><li>Koch, K., Neinhuis, C., Ensikat, H. J., Barthlott, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+assembly+of+epicuticular+waxes+on+living+plant+surfaces+imaged+by+atomic+force+microscopy+(AFM).">Self assembly of epicuticular waxes on living plant surfaces imaged by atomic force microscopy (AFM).</a> J. Exper. Bot. 55, 711-718 (2004).</li><li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM:+A+Nanotool+in+Membrane+Biology.">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry. 47, 7986-7998 (2008).</li><li>Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Applications+of+Atomic+Force+Microscopy+to+Vision+Science.">The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science.</a> Investigative Ophthalmology &#38; Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

프로토콜은 본 파괴적인 화학 분석없이도 복잡한 가공하기 어려운 식물 소재의 상세한 분자와 microscale 특성화 수 있도록 설명했다. 우리는 이기종 cuticular 조화에서 epicuticular 및 intracuticular 왁스의 선택적 제거 절차를 실시하고 모니터링 cuticular 어셈블리의 구조적 조직, 10을 제어 다양한 lipids (왁스)로 cutin의 biopolyester의 블렌딩을 조사합니다. 고체 13 C NMR은 경지 야생 - 타입과 단일 유전자로부터 cutins의 상호 연결 기능을 비교하려면 왁스 분자 구성 요소의 추출을 측정하는 데 사용하고, 원자 힘 현미경은 표면 거칠기에 수반하는 변화를 검토 하였다. 6,11되었다 돌연변이 토마토 과일은 고체 13 C NMR도 CHO과 CH 2 O 화학 moieties의 상대적 숫자를 추정하는 데 사용되었다. 디자인 기능의 개수이 프로토콜의 S는 주목할 수 있습니다. 왁스 자료가 분기하는 극성을 가진 용매의 일련의 과일 표피를 치료, lipids의 넓은 범위를 망라적으로 완전한 dewaxing를 달성하는 것이 필수적이다. 또한, dewaxing 시간은 8 시간 동안의 표피 샘플의 특성에 따라 24 시간이 다를 수 있습니다. 그대로 과일 표피로부터 지속 epicuticular 왁스를 추출하기 위해서는 표면에 균일하게 접착 코팅을 적용하는 필수적입니다. 고체 CPMAS 13 C NMR 12 그들 나라의 물리적 특성을 유지하면서 고도의 이기종 및 불용성 식물 biopolymers의 다양한 구조적 구성 요소를 식별을위한 신속한 질적 방법으로, 13 전통적인 솔루션 상태 NMR 또한 추출된 왁스 섞어 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 기능성 그룹의 양적 추정은 그대로 식물 폴리머, 5 고충 실도 직접 편광 마술 - 각도 회전 (D 대해 원하는 경우PMAS) 13 C NMR 5,14가 상호 보완적인 방법으로 사용해야합니다. 기능성 그룹의 정확한 quantitation는 재활용 시간, 여기 펄스 길이 및 헤테로핵 감결합의 강도주의 최적화가 필요합니다. 15 헤테로핵 감결합가 TPPM 16 또는를 사용하여 50 kHz에서에서 185 kHz에서까지 1 H 필드 강도 설정을 지정할 수도 있습니다 척수 7 방법론. 이러한 매개 변수 외에도 CPMAS 측정의 감도가 스핀 잠금 시간 및 하트만-돼야 해 한이 매칭 조건에 따라 다릅니다. 전통 CPMAS 대신에 15, ramped-진폭 CP (진입로-CP) 기술은 십자가를 최대화하기 위해 구현할 수 스핀 잠금 기간 (또는 그 반대) 동안 지속 13 C 필드 강도의 진폭을 유지하면서 선형적으로 한 H 진폭을 변화 (~ 20-50%) 또는 tangentially별로 편광 효율.에서 CPMAS 측정을 수행 17,18 두 가지 RO 최소토르 - 스피닝 주파수 메인 스펙트럼 봉우리에서 회전 sidebands을 구분하는 필수적입니다. 접촉 모드에서 실시한 동시 AFM 측정 밀랍 성분의 연속 제거하는 동안 인스턴스에 대한 높은 스캔 속도와 고해상도, 19와 표피 표면 상태를 직접 영상을 가능하게합니다. 각각의 경우에 (비 접촉) 모드가 가로 (전단) 세력에 의한 손상을 피할 수 있고 샘플 표면의 부서, 섬세하고 &quot;소프트&quot;식물 재료의 표면 특성에 대한 대안으로 사용될 수 있습니다. 5,20 도청에서 AFM 운영 , 표면에 같은 위치의 여러 이미지의 연속적인 인수 AFM 측정에서 &quot;탐침 - 표면 상호 작용&quot;으로 인한 표면 손상을 식별하기 위해 제공하고 있습니다. 6,21 최적의 재현성을 보려면 소프트 cuticular 표면에 적합한 스프링 상수와 AFM 프로브가 있어야 온도와 습도의 사용, 그리고 비극적가 유지되어야합니다. 6,15,20 </s최대 고체 NMR 반면&gt;는 앙상블 평균 (벌크) 토마토 과일 손톱에있는 속성의 분자 프로파일을 제공하며, 원자 힘 이미징이 정교하게 복잡한 macromolecular 어셈블리의 표면 지형을 추적하기위한 보완적인 비침 투 프로브 22,23을 제공합니다. 1,2은

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog no.</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8625-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectinase</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>P0026</td>
			<td>EC 3.2.1.15; 10 U ml-1, store in refrigerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1184-100KU</td>
			<td>EC232.734.4; 1.3 units/mg, store in refrigerator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9967</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Extremely hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator/shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific Co.</td>
			<td>Model No.G24</td>
			<td>MFG No.M1036-000G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Oven</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>31566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variac Controller</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sintered glass thimble (85 mm/25mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89056</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable extraction thimble ( 80 mm/ 25 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28320</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EMD-MX0485-7</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wool</td>
			<td>VWR</td>
			<td>RK20789</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01-213-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-452</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-CX1050-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H302-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89002-984</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kim wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21905-026</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum arabic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9752</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.6 mm fastMAS zirconia rotor</td>
			<td>Varian (Agilent)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer</td>
			<td>Varian 600 NMRS</td>
			<td>standard bore magnet</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td>Model compound for CPMAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49419</td>
			<td>Model compound for CPMAS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adamantane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100277</td>
			<td>To calibrate 90&deg; pulse in NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode Scanning Probe Microscope (Nanoscope IIIA)</td>
			<td>Digital Instruments (Bruker AXS)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoscope software</td>
			<td>Digital Instruments (Bruker AXS)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Version 5.30r3sr3 (2005)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM probe (Nonconductive silicon nitride tip)</td>
			<td>Veeco (Bruker AXS)</td>
			<td>Model NP-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Digital Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic puck</td>
			<td>Digital Instruments</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fruit Peeler</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&uuml;chner funnel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and biophysical study of fruit cuticles

표피, 지상파 식물의 공중 부분에 소수성 보호 계층, 다양한 biotic 및 비생물적 스트레스에 대한 다양한 방어 장벽으로서 기능과 또한 외부 환경으로부터 물의 흐름을 조절 1. biopolyester (cutin)와 긴 사슬 지방산 ( 왁스)은 표피의 주요 구조적 프레임 워크를 형성;. cuticular 레이어의 기능성 무결성 cutin 생체 고분자와 &#39;intracuticular&#39;왁스 2 언급된 구성된 혼합, 우리는 포괄적인 프로토콜을 설명하는 바깥 &#39;epicuticular&#39;계층뿐만 아니라 의존 상업 토마토 (Solanum lycopersicum) 과일 손톱에서 철저하게 왁스를 추출하거나 표피의 합성부터 순차적으로 선택적으로 epicuticular 및 intracuticular 왁스를 제거합니다. Jetter 및 Schäffer (2001)의 방법은 과일 표피로부터 epicuticular 및 intracuticular 왁스의 stepwise 추출을 위해 적응되었다. 3,4가를 모니터링하려면순차 왁스 제거, 고체 교차 편광 마술 앵글 - 방적 과정 (CPMAS) 13 C NMR 분광법이에 대한 정보에 의해 보완 벌크 재료의 분자 수준의 구조 프로파일을 제공 원자 힘 현미경 (AFM)과 병렬로 사용되었다 microscale 지형과 cuticular 표면의 거칠기. 경지 야생 - 타입과 단일 유전자 돌연변이 토마토 열매로부터 dewaxed 손톱의 상호 연결 기능을 평가하기 위해 MAS 13 C NMR은 산소 지방족 (CHO 및 CH 2 O) 화학 moieties의 상대적 비율을 비교하는 데 사용되었다. cutin의 biopolyester의 화학 구조를 보존하면서 극성 변화의 용매의 패널과 stepwise Soxhlet 추출에 의한 철저한 dewaxing은 그들의 지방족 및 방향족의 성분 중 소수성 특성에 따라 왁스 moieties를 분리하는 효율적인 수단을 제공합니다. epicuticular 왁스와 sele의 기계적 추출보완 물리적인 방법론에 의해 모니터링 intracuticular 왁스의 ctive 제거, 표피 어셈블리를 조사하기 위해 전례없는 수단을 제공 :이 접근법은 supramolecular 조직과 왁스의 다양한 유형의 구조적 통합, cutin - 왁스 모체의 아키텍처, 그리고 화학 물질을 드러내 각 성분의 조성. 또한, 고체 13 C NMR은 야생 형 및 돌연변이 빨간색으로 익은 토마토 과일에 대한 CHO 및 CH 2 O 화학 moieties의 상대적 숫자의 차이를 보여준다. NMR 기법은 지문, 불용성 비정질 및 화학적으로 이기종 있습니다 cuticular 물질의 분자 구조에 뛰어난 도구를 제공합니다. 비침 투 표면 선택적 이미징 기법으로서, AFM은 NM-μm의 길이 규모 cuticular 어셈블리의 구조 조직을 알아내기 위해 효과적이고 직접적인 수단을 furnishes.

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Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

공중 식물 장기는 표피, supramolecular biopolyester - 왁스 어셈블리의 보호를받습니다. 우리는 고체 NMR 및 원자 힘 현미경에 의한 분자와 마이크로 저울에 토마토 과일 손톱에서의 선택적 제거 에피와 intracuticular 왁스, 각각을 모니터링하고, 공학 cuticular biopolyesters의 가교 능력을 평가하기 위해 프로토콜을 소개합니다.

분리 및 과일 손톱의 Biophysical 연구

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

isolation-and-biophysical-study-of-fruit-cuticles

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K 조회수.  City College of New York, City University of New York Graduate Center and Institute for Macromolecular Assemblies. 공중 식물 장기는 표피, supramolecular biopolyester - 왁스 어셈블리의 보호를받습니다. 우리는 고체 NMR 및 원자 힘 현미경에 의한 분자와 마이크로 저울에 토마토 과일 손톱에서의 선택적 제거 에피와 intracuticular 왁스, 각각을 모니터링하고, 공학 cuticular biopolyesters의 가교 능력을 평가하기 위해 프로토콜을 소개합니다.

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

연구

생물학

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources. This complex social behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. In many organisms, aggression is critical to survival but controlling and suppressing aggression in distinct contexts also has become increasingly important. In recent years, invertebrates have become increasingly useful as model systems for investigating the genetic and systems biological basis of complex social behavior. This is in part due to the diverse repertoire of behaviors exhibited by these organisms. In the accompanying video, we outline a method for analyzing aggression in Drosophila whose design encompasses important eco-ethological constraints. Details include steps for: making a fighting chamber; isolating and painting flies; adding flies to the fight chamber; and video taping fights. This approach is currently being used to identify candidate genes important in aggression and in elaborating the neuronal circuitry that underlies the output of aggression and other social behaviors.

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

(과일 파리) Drosophila의 침략을 유학

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

의 분리 및 정제 Drosophila</em마그네틱 비드별로 정렬> 주변 뉴런

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit aroma. Maturity at harvest is one of the key factors influencing the flavor quality of fruits and vegetables1. The validation of robust methods that rapidly assess fruit maturity and aroma quality would allow improved management of advanced breeding programs, production practices and postharvest handling. 
Over the last three decades, much research has been conducted to develop so-called electronic noses, which are devices able to rapidly detect odors and flavors2-4. Currently there are several commercially available electronic noses able to perform volatile analysis, based on different technologies. The electronic nose used in our work (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA), consists of ultra-fast gas chromatography coupled with a surface acoustic wave sensor (UFGC-SAW). This technology has already been tested for its ability to monitor quality of various commodities, including detection of deterioration in apple5; ripeness and rot evaluation in mango6; aroma profiling of thymus species7; C6 volatile compounds in grape berries8; characterization of vegetable oil9 and detection of adulterants in virgin coconut oil10. 
This system can perform the three major steps of aroma analysis: headspace sampling, separation of volatile compounds, and detection. In about one minute, the output, a chromatogram, is produced and, after a purging cycle, the instrument is ready for further analysis. The results obtained with the zNose can be compared to those of other gas-chromatographic systems by calculation of Kovats Indices (KI). Once the instrument has been tuned with an alkane standard solution, the retention times are automatically converted into KIs. However, slight changes in temperature and flow rate are expected to occur over time, causing retention times to drift. Also, depending on the polarity of the column stationary phase, the reproducibility of KI calculations can vary by several index units11. A series of programs and graphical interfaces were therefore developed to compare calculated KIs among samples in a semi-automated fashion. These programs reduce the time required for chromatogram analysis of large data sets and minimize the potential for misinterpretation of the data when chromatograms are not perfectly aligned.
We present a method for rapid volatile compound analysis in fruit. Sample preparation, data acquisition and handling procedures are also discussed.

A rapid method for volatile compound analysis in fruit is described. The volatile compounds present in the headspace of a homogenate of the sample are rapidly separated and detected with ultra-fast gas chromatography (GC) coupled with a surface acoustic wave (SAW) sensor. A procedure for data handling and analysis is also discussed.

전자 코를 사용하여 과일 휘발성 분석

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

세균 본부 기계의 슈퍼 해상도 이미징

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

의 효율적인 생산 및 정제 재조합 쥐과 Kindlin-3 생물 물리학 연구 곤충 세포에서

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

대사율의 측정에<em&gt; 초파리</em&gt; Respirometry를 사용하여

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

편모 모터 기능의 생물 물리학 적 특성

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...