We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Polysom​​al 프로파일은 상이한 처리 조건 하에서 특정 전 사체의 번역의 상태를 정량화 할 수있는 강력한 기술이다. 그것은 원칙적으로 매우 간단한 기술이다 ​​그러나 그것은 좋은 polysom​​e 프로필을 생성에 중요한 일부 실행의 여러 단계가 필요합니다. 1)의 RNase가없는 화학 물질과 plasticware에를 사용, 2) (좋은 자당 그라디언트를 준비하는 우리의 경험에 10-50% 자당 그라디언트를 효율적으로 결합 리보솜 40 / 60S 서브 유닛과의 mRNA)을 해결하기위한 가장 좋은 일, 3 : 다음과 같은 주요 단계는 ) 번역의 최고 속도를 캡처하기 위해 지수 적으로 성장 세포와 더 이상 80 % 합류를 사용. 이러한 유전자 과발현 또는 최저 한 세포 치료제를 수행 할 때 플레이트에 세포의 양이 세포가 엔드 포인트에서 컨 플루 언트 될 정도의 함수일 수 있도록 이러한 후자 단계는, 고려되어야한다. 결과에서 presen와여기 테드, polysome 프로필 분석을 IRES-숨겨의 mRNA XIAP와 Bcl-xL 발현 (12)의 번역 조절에 PDCD4의 역할을 평가하기위한 중요한 도구였다. 우리가 PDCD4 노크 다운 (그림 1B)에 따라 일반 polysome 프로파일의 변화를 관찰하지 않은 사실은 우리가 PDCD4 실험의 조건에서 글로벌 휴대폰 번역을 손상하지 않았다고 결론을 내릴 수있었습니다. 우리는 다음 PDCD4 또는 제어 siRNA를 처리 한 세포에서 XIAP와 Bcl-xL 발현의 mRNA의 분포를 결정하기 위해 RT-qPCR에 분석을 사용 하였다. 이 mRNA의 분포의 정량적보다는 반 정량 분석​​과 치료 사이의 번역 효율에 미묘한 변화의 검출을 허용하기 때문에 qPCR에은, 표준 RT-PCR 또는 노던 블롯 반대로, polysom​​e 프로파일을 분석하기위한 선택 방법이다. 이 기술을 사용하여, 우리는 XIAP와 Bcl-xL 발현의 mRNA의 분포가 (gr에 걸쳐 총 타깃 mRNA를 백분율로 표시 것을 보여줄 수 있었다adient)는 크게, 따라서 이들의 mRNA의 번역의 증가를 나타내는, PDCD4 노크 다운 (그림 1D, E) 후 그와 관련된 리보솜의 큰 숫자)와 함께 무거운 polyribosomes (의 mRNA로 이동했다. 이는 더욱 XIAP 및 Bcl-xL 발현 단백질 수준에서 아니지만 그들의 정상 RNA 수준 (도 1F, G)의 상승에 의해 확인 하였다. 중요한 것은, XIAP의 비 IRES 변이체의 polysome 분포는 처리 및 미처리 세포 (도 1C) 사이에서 불변이었다. 대안으로, 번역 효율은 14 (일반적으로 2-4을 분획) 대 monosomes polysomes mRNA의 함량의 비 (일반적으로 5-10 분획)로 제시 될 수있다. 254 nm에서 흡광도 판독 값에서 피크가 관찰이 독자적으로 리보솜 RNA (세제에 기인 할 수 없기 걸쳐 제어 프로토콜의 사용은 결과를 프로파일 링하는 polysom​​e 검증 중요예컨대 트리톤 X-100 등의 강하게) 스펙트럼의이 영역에서 흡수하고 구배 상단 40 / 60S 피크를 가릴 수있다. 해물없이 및 / 또는 해물 버퍼 빈 그라데이션을 254 nm에서의 흡광도에 버퍼의 상대적 기여도를 결정하기 위해 실행해야합니다. Artefactual 고차 구조는 사실 없음에 (예 : &quot;의사 polysomes&quot;20)가 polysomes의 잘못된 해석으로 이어질 수 있습니다. 마그네슘 금속 이온 봉쇄 2가 양이온의 킬레이트 EDTA와 (80S 리보솜을 안정화하는 절차 전반에 걸쳐 사용은) 큰 (60S를 그 구성 요소 작은 (40S)에 리보솜의 분리를 일으킬 것 해물과 그라데이션 버퍼 (15 분 20 mM의)에 추가 ) 서브 유닛. 260 nm에서 기록 된 흡광도 피크 polysom​​es 실제로 경우 따라서, EDTA 처리를 단일 최대의 mRNA 리보좀 단위를 자유롭게 대응 구배의 상단 부근에 관측 될되도록 프로파일을 축소한다 (데이터는 미도시). 일치하는프로파일의 EDTA에 의한 붕괴, qPCR에 의해 분석 특정 대상의 모든 이제 그라데이션의 맨 위에 있어야합니다. mRNA의 리보솜과 연관된 수는 항상 특정의 mRNA가 번역되는 것을 얼마나 효율적의 지표 아니다. 실제로, polysomes에 활성 번역은 독자가 알아야 할 21, 22 정체가되는 특정 상황이 있습니다. 성적표 적극적 EDTA 달리 &#39;유거수&#39;적극적 mRNA에 걸쳐 전좌되는 리보솜 발생 퓨로 마이신으로 샘플을 처리)하여 수행 할 수 번역 기계 결합, 또는 b) 샘플을 처리할지 여부를 결정 다시 다운 스트림 전좌 리보솜의 &#39;실행 - 오프&#39;를 일으키는 원인이되는 개시 코돈에서 첫 번째 리보솜의 전위를 억제 homoharringtonine와. qPCR의 분석을위한 제어 사체의 사용은 중요하다. SELEC이러한 XIAP IRES의 비 IRES 변형 일부 가사 유전자 (GAPDH, 액틴, 튜 불린, 뉴 클레), 리보솜의 mRNA (18S, RPL13A) 나이 경우 다른 처리 조건에 의해 영향을받지 않는 성적 증명서의 기는 중요하다 검증 번역에 대한 치료의 효과는 특정 또는 일반화 된 경우. 이러한 제어 사체 여기 행해졌으로 분석의 mRNA의 분포를 정규화하는데 사용될 수있다 (XIAP와 Bcl-xL 발현의 mRNA는 GAPDH의 mRNA로 정규화하고 각 분획의 mRNA 함량의 합으로 표시되는 총 mRNA의 함량의 백분율로 표현 하였다 ) 또는 대안 적으로, 제어 대상의 mRNA가 절대 값으로 표현하고 개별적으로 도시 될 수있다. 입력 용 해물 (총 용적의 통상 10 %)의 qPCR의 분석은 특정의 mRNA 분포를 통제 할 다른 공정이다. 이상적으로는, 입력 용 해물에서 특정 mRNA의 전사의 함유량을 분석 한 10 개의 분획의 mRNA 함량의 합과 비교되어야한다. 최종적으로, 옵션 단계를 페놀 제어 : 클로로포름 추출 단계 (CAT는, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼 라제와 같은) 후속 qPCR에 의해 정량화 될 심지어 사용할 수 정상화 관내 전사 리포터 mRNA를 각각 polysome 분획 스파이크하는 데이터 (14). 어떤 기술과 마찬가지로, polysom​​e 프로파일 링은 몇 가지 제한 사항을 제시한다. 통상 10 분은 최소 좋은 polysom​​e 분포를 갖기 위해 수집 할 필요가 (변환 효율의 미묘한 변화가 20 이상이 필요할 수 있음)이 있다는 사실이 단계 4 샘플 만 최대가 될 수 있다는 점에서, 제한적인 만든다 한 번에 분석하는 것이 편안 한번에 RNA 추출 및 40 샘플 4 입력 컨트롤 qPCR의 분석을 처리 할 수​​ 있어야한다. 샘플 크기는 쉽게 qPCR을 수행하는 복제 얼마나 많은 성적을 분석 할 수 있습니다 얼마나 많은에 추가 할 수 있습니다, 이것은 비용이 많이들 수 있습니다. qPCR에 기반 polysom​​al 프로파일 링의 또 다른 제한nalysis 그것만 (성적이 미리 공지되어 분석 될 수있는)와 번역의 전체 게놈 분석에 적용 할 수없는 후보 기반의 접근법에서 수행 될 수 있다는 것이다. 그러나, 21 세기의 시작 부분에, 연구자들은 DNA를 사용하여 게놈 수준에서 자신의 polysomal의 RNA를 심문하기 시작 차세대 시퀀싱 (16, 17)와 함께 최근에는 15을 마이크로 어레이. 오히려 개별 분수의 qPCR에 분석을 수행하는 것보다 것을 제외하고는이 프로토콜에 설명 된대로이 강력한 접근 방식에서, polysom​​al 프로파일 링을 수행 할 글로벌 번역 분수 (일반적으로 분수 2-4)와 polysom​​es 분수 (일반적으로 분수) 함께 풀링 및 변형 분석 monosomes DNA 마이크로 어레이 또는 전체 게놈 RNA 서열 분석에 의해. 따라서이 방법, 그것을 평가하기 위해 가능한 모든 누구의 분포 변화 polysom​​es에서 monosomes에 (번역 감소) 또는 반대 (번역 증가) 특정 치료시의 mRNA, 표준. 특정 mRNA의 polysom​​es 분포의 확인 및 정량화는 다음 qPCR을 수행 할 수 있습니다. polysom​​al 프로파일 원리의 더 강력한 사용 리보솜 프로파일입니다. 이 기술의 더 높은 처리량 확장 polysome 분수 (23)의 수백을 동시에 모니터링 할 수가 최근에보고되었다. 돌연변이의 수집 또는 대규모의 RNAi 화면에서 병진 효율 프로빙 때 명확한 이점을 제공한다. 리보솜 프로파일은 단백질 합성에 관여 24,25 리보솜 (리보솜 발자국)에 의해 보호 RNA 단편을 매핑 차세대 시퀀싱을 활용하는 기술이다. 이 기술에서, 리보솜 전좌는 사이클로 헥시 미드 (양면) 또는 emetine (돌이킬 수없는) 리보솜 발자국의 인구를 산출하기 위해 세포 용해 및 RNA 분해 효소 소화 다음으로 억제 할 수있다. 리보솜은 충실 총 RNA는 고립되고, 오염 리보솜과 미토콘드리아 리보솜 RNA가 제거됩니다.약 26 ~ 28 뉴클레오티드 RNA 발자국이 절연되어, cDNA 라이브러리로 변환, 전사 26 염기 서열을 리버스. 표준 polysom​​e 프로파일과는 달리,이 방법뿐만 아니라 병진 규제 특정의 mRNA를 식별뿐만 아니라, 특정 성적 증명서를 따라 정확한 직업과 리보솜의 밀도 코돈 해상도에서 mRNA의 관련 정보를 얻을 수 있습니다. 이 발생하는 경우 성적 증명서 리보좀 모집에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있기 때문에 이것은, 특히 IRES-숨겨의 mRNA로 번역의 특정 모드와의 mRNA에 대한 관심이다.

단백질 합성 (번역)의 규정은 밀접하게 세포의 생존에 연결된 키 세포 과정이다. 번역은 세포의 에너지의 50 % 이상을 소비하는 감안할 때, 그것은 번역이 밀접하게 규제되어 있고 번역의 동요가 잘 용납하지 않는 것은 놀라운 일이 아니다. 반대로, 많은 비정상적인 세포 과정은 번역 기계 및 변환 출력 (즉, 프로테옴)을 수정해야 할 것을 요구하고 있습니다. 이것은 종종 다양한 스트레스 반응 및 질병 상태에있는 경우, 그리고 아마도 가장 좋은 암을들 수있다. 병진 제어의 주요 이점은 빠르게 다양한 내부 및 외부 트리거에 응답하여 단백질 출력을 재 프로그래밍하는 세포의 능력하여 미세 조정기구 인 것을 조언 세포 생존 및 사망 한 간의 균형. 번역 제어의 두 가지 측면이 특히 재미있다; 규제 MEC의 본질에 대한 이해처음에 선택적 번역을 유발하는 특정 트리거에 대한 세포 반응에 참여 hanism (들) 및 제어 특정 번역을 허용 요소, 특정의 mRNA의 식별과 단백질 제품. Polysom​​e 프로파일 링은 두 프로세스의 효과적인 학습을 할 수있는 기술이다. polysom​​e 프로파일 링 기술의 전반적인 목표는 공부하고 다른 세포 조건에서 특정의 mRNA의 번역 상태를 정량화하는 것입니다. 기술의 원리에 따라서, 수 크로스 구배에서 초 원심 분리에 의해 얻어진 polyribosomes를 &#39;동결&#39;다른 사체에 적극적 번역 리보솜과 분리 &#39;(몇 리보솜에 의해 결합) 높은 변환 전 사체 사이의 구별을 허용함으로써 mRNA의 번역을 캡처하는 것 가난 (하나 또는 두 개의 리보솜에 의해 구속) 사람들을 번역했다. 이 특정 프로토콜에서, 항생제 사이클로 헥시 미드는 결합이60S 리보솜 아 단위 및 블록 리보솜 E 사이트 2에서 탈 아세틸 화의 tRNA의 출시는, 리보솜 전좌를 억제하고 번역의 mRNA에 리보솜 실속하는 데 사용됩니다. 그러나, 블록 변환 신도 3, 사용될 수있다 emetine 다른 차단제. 웨스턴 블 롯팅 및 번역 처리의 최종 출력을 측정 35 S-메티오닌 표지 기술과는 달리, 따라서 다른 조건 하에서 번역 메커니즘의보다 상세한 연구를 허용 프로파일 적극적 번역의 mRNA와 리보솜 연계를 측정하는 장점을 갖는다 polysome. 따라서,이 기술을 쉽게 구체적 번역 4-6의 다양한 모드를 연구하기에 적합 할 수있는, 단백질 인자 번역 조절 7-9, 단백질 합성 1,10,11 또는 상류 IRES 또는 mRNA의 구조의 효과에 영향을 미치는 스트레스 조건에 관여 단백질 신디사이저에 개방 판독 프레임ESIS 12-14. 요즘, polysome 프로파일 응용 프로그램도 넓은 polysomes 관련의 mRNA를 분석 할 수있는 DNA 마이크로 어레이 (15) 또는 차세대 시퀀싱 16, 17의 사용에 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="772">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gradient Master 108 automated gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">BIOCOMP</td>
			<td style="width:119px;">107-201M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">LABCONCO</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4517000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Beckman Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Model # L-100-XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Density gradient fractionator</td>
			<td style="width:135px;">TELEDYNE ISCO</td>
			<td style="width:119px;">69-3873-246</td>
			<td>Composed of: tube piercing system,&#160; peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">WinDaq data acquisition software</td>
			<td style="width:135px;">DATAQ INSTRUMENTS</td>
			<td style="width:119px;">WINDAQ/LITE</td>
			<td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14x89 mm)</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose)</td>
			<td style="width:135px;">DiaMed</td>
			<td style="width:119px;">PRE1900-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom)</td>
			<td style="width:135px;">SafeSeal</td>
			<td style="width:119px;">12000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sucrose (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">573113</td>
			<td>MW = 342.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:135px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td>MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium chloride (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">7710</td>
			<td>MW = 58.44 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MgCl2.6H2O (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">5980</td>
			<td>MW = 203.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tris Base (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-01</td>
			<td>MW = 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9400</td>
			<td>Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">RNaseZap Rnase inactivation solution</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9722</td>
			<td>Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling

단백질 합성의 규정은 스트레스에 대한 세포 반응의 핵심 제어 지점을 나타냅니다. 특히 신중한 RNA 조절 요소는 전형적 특정 스트레스 반응에 필요한 단백질 인코딩 특정 mRNA를, 선택적으로 번역 할 수 있도록 도시 하였다. 이들의 mRNA뿐만 아니라 선택적 번역에 대한 책임을 규제 메커니즘의 특성의 확인은 시간에 대한 분자 생물학의 최전선에있다. Polysom​​e 프로파일 링은이 연구의 초석 방법이다. polysom​​e 프로파일의 목적은 서로 다른 사체에 적극적 번역 변이를 고정화함으로써 mRNA의 번역을 캡처하고, 따라서 높은 번역 사체 저​​조한 번역들 사이의 구별을 허용 자당 구배 초 원심 분리에 의해 얻어진 polyribosomes를 분리하는 것. 이것들은 추가의 전통적인 생화학 및 분자 생물학 방법을 특징으로 할 수있다. 중요한 것은, 결합 P높은 처리량 게놈 접근 방식과 olysom​​e 프로파일 링은 번역 규제의 대규모 분석을 할 수 있습니다.

우리는 최근 세포 사멸 억제제 XIAP와 Bcl-xL 발현 (12) 인코딩의 mRNA을 IRES이-은닉의 선택 번역 억제제로 종양 억제 PDCD4위한 새로운 역할을 설명했다. Polysom​​e 프로파일 링은 IRES 매개 번역 PDCD4의 구체적인 참여 방법을 설명하기 위해 핵심 기술이었다. HEK293 세포는 일시적 PDCD4 (도 1a)의 내인성 수준을 고갈 형질 다음 프로파일 분석 polysome 행 하였다. 우리는 siCTRL 및 siPDCD4 처리 된 세포 (도 1B)를 비교 polysome 프로파일의 변화의 부족 것으로 판단 PDCD4의 감소 수준, 글로벌 셀룰러 번역을 저해하지 않은 것이 관찰. 마찬가지로, XIAP (19)의 비 IRES 변형의 polysome 분포는 치료 및 치료 세포 (그림 1C) 사이의 변화는 없었다. 대조적으로, 두 IRES-은닉의 mRNA polysom​​e 분포, XIAP 및 Bcl-xL 발현이 유의하게 변경 하였다. P가없는DCD4 이들 두개의 mRNA의 분포가 무거운 ribopolysomes (도 1D, E)로 이동된다. 이것이 XIAP와 Bcl-xL 발현 mRNA에 (도 1F)이 결과의 정상 상태 수준의 변화를 수반하지 않기 때문에 더 웨스턴 블 롯팅 (도에 의해 확인 하였다 감소 PDCD4 수준으로 세포에서 XIAP와 Bcl-xL 발현의 번역을 향상을 보여줍니다 1G). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> 그림 1 :. Polysome 프로파일 링 XIAP와 Bcl-xL 발현 번역의 선택적 억제제로 PDCD4를 식별 (A) HEK293 세포 PDCD4의 siRNA 또는 컨트롤 (CTRL)로 처리하고, 안티 PDCD4에 용해 및 웨스턴 블롯 분석을의 siRNA를, 비 대상 안티 뉴 클레 항체는. PDCD4 노크 다운의 정도를 확인 (B) PDCD4가 (A)에서와 같이 무너 뜨렸다하고합니다세포 용 해물은 프로파일 polysom​​e 행 하였다. 대표 polysom​​e 프로필은 상단 패널에 표시됩니다; XIAP 비 IRES (C)의 분포는, GAPDH의 상대적인 Bcl-xL 발현 (D), 및 XIAP IRES (E)의 mRNA 각 분획 총 mRNA를 백분율 (%의 mRNA)로 표시된다. (F) 정상 -state mRNA 수준은 PDCD4의 siRNA 또는 제어 (CTRL) siRNA를 처리 한 세포의 RT-qPCR에 의해 측정 하였다. (G)로부터의 용 해물 (A)과 같은 항 - XIAP, 안티 Bcl-xL 발현과 함께 웨스턴 블롯 분석을 실시 안티 뉴 클레 항체. (NB. 데이터는 원래 12 년에 출판 된 그림 1에 제시) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Polysom​​e 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

assessment-selective-mrna-translation-mammalian-cells-polysome

Research

JoVE Journal

Biology

27.9K 조회수.  University of Ottawa. The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions. 

비디오: Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Microinjection하여 포유 동물 세포에서 mRNA 원자력 수출 속도론 분석

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

연구

생물학

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

형광 현미경으로 여러 세대 이상 라이브 포유류의 세포에 플라스미드 복제 모니터링

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Polysom​​e 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

게놈 전체 규모에 Polysom​​e 분별과 포유류 Translatomes 분석

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

공장 Polysom​​e 프로파일 링을위한 쉬운 방법

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

시투 혼성화에서 2색 단일 분자 형광을 사용하여 에샤리치아 대장균의 공간과 시간에서 mRNA 운동학을 프로빙

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

Polysom​​e 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가

Polysome 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가