Name: metabolic labeling of newly transcribed rna for high resolution gene expression profiling of rna synthesis, processing and decay in cell culture
Uploaded: 2013-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture at JoVE.com

우리는 원고의주의 읽기 에이미 레이건에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 LD와 CCF에 DFG 부여 FR2938/1-1에 NGFN 플러스 부여 # 01GS0801, MRC 교제를 부여 G1002523 및 NHSBT 부여 WP11-05에 의해 지원되었다

1. 4 thiouridine과 신진 대사 라벨링 실험 설정 / 일정 세부 계획을 만들어 세포 배양에 4SU를 추가 할 때 샘플을 채취 할 때 예를 들어. 각 조건 사이에 적어도 5 분 계획. 한 번에 하나의 조건의 세포를 처리합니다. 최대 처리 할 수​​ 있습니다. 3 - 주어진 시간에 5 접시. 온도와 CO 2 농도의 변화를 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 전지를 처리합니다. 이 세포 단백질 4SU - 라벨 RNA의 가교 될 수 있으므로 4SU가 추가 된 후 밝은 빛에 세포를 노출시키지 마십시오. 라벨의 시작 <ol><li> 해동 4 thiouridine (4SU) 단지 멸균 팔콘 튜브에 각 조건에 대한 4SU의 사용과 피펫 필요한 양 전. </li><li> 요리 떨어져 세포 배양 매체의 필요한 금액 (10cm 접시 당 5 ML)를 타고 4SU 함유 팔콘 튜브에 첨가하고 잘 섞는다. 제거하고 요리의 나머지 매체를 폐기하십시오. </li> &lt;리&gt; 요리에 4SU 함유 배지를 다시 적용합니다. </li></ol> 라벨의 끝 <ol start="4"><li> 세포에서 세포 배양액을 제거합니다. 각 플레이트에 TRIZOL의 5 ML을 추가합니다. 여러 시간 지점 또는 조건을 포함 복잡한 실험을 위해,이 단계가 가장 두 사람이 중간 TRIZOL을 추가하고 해물을 수확 기타를 제거 하나에 의해 이루어집니다. </li><li> 완전한 세포 용해 실온에서 5 분 알을 품다. </li><li> 추가 TRIZOL으로 조심스럽게 접시를 헹굴 10 ㎖ 피펫을 사용합니다. 이 완전한 세포 용해 및 샘플 복구 제품. 피부 나 눈에 접촉 가져올 때 TRIZOL 매우 위험한 상태로 취급주의! 손 페놀 화상 (예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 300 또는 산업 메틸화 영혼 (70:30) 400)에 대한 해독제가있다. 폴리 프로필렌 튜브에 샘플을 전송합니다. 표준 팔콘 ​​튜브)이 높은 G의 힘에 저항하지 않도록주의하시기 바랍니다. 샘플은 내가 총 RNA 때까지 적어도 한 달 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다들 준비. </li></ol> 2. 수정 TRIZOL 프로토콜을 사용하여 RNA 준비 <ol><li> 1 ML 클로로포름 (ML TRIZOL 당 0.2 ML) 추가하고 15 초 동안 격렬하게 흔들어. 3 분 - 2 실온에서 알을 품다. </li><li> 4시 15 분 13,000 × g에서 원심 분리기 ° C. </li><li> 새로운 15 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 수성 상위 단계 (RNA 포함) 전송합니다. </li><li> 추가 ½ RNA 침전 버퍼와 이소프로판올 모두의 반응 볼륨 (3 ML 상층에 예를 들어, 1.5 ML RNA 침전 버퍼와 1.5 ML 이소프로판올 추가). </li><li> 잘 섞는다. 10 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 4에서 10 분간 13,000 × g에서 원심 분리기 ° C. 상층 액을 버린다. </li><li> 간단히 스핀 다운 (5,000 × g에서 30 초) 200 μL 피펫 잔류 이소프로판올을 제거합니다. </li><li> 75 % 에탄올의 동일한 볼륨을 추가하고 펠렛 분리 될 때까지 튜브를 흔들어. residua이 같은 여러 개의 작은 조각으로 파손되지 않도록하는 것은 만들 수 있습니다 제거L의 에탄올 어렵다. </li><li> 4에서 10 분간 13,000 × g에서 원심 분리기 ° C. 상층 액을 버린다. </li><li> 간단히 RNA를 회전하고 200 μL 피펫으로 남아있는 에탄올을 제거합니다. 20 μL 피펫으로 남아있는 에탄올 단계를 제거를 반복합니다. 이 두 단계 후, 펠렛의 더 건조가 수행되지 않아야합니다. </li><li> 100 μg 예상 RNA 수율 당 H 2 O의 100 μl를 추가하고 5를 위아래로 pipetting에 의해 잘 섞는다 - 6 번 RNA를 용해에 도움. </li><li> 용해와 65 가열하여 RNA를 변성 ° C 10 분 (뿌리)에 대한 즉시 얼음에 배치합니다.을 </li><li> 제조업체의 지침에 따라, Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 260 nm에서 농도를 RNA 측정합니다. 이 RNA는 적어도 한 달 동안 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. 새로 전사 RNA의 싸이 특정 Biotinylation <ol><li> 60로 시작 - 전체 세포 RN​​A 80 μg합니다. </li><li> 반응에 레이블을 구성합니다. 다음의 피펫순서 (당 μg의 RNA) <ol class="lalpha"><li> 1 μL 10X Biotinylation 버퍼 </li><li> 7 μL RNA (핵산 무료 H 2 O에 희석 1 μg의 RNA를 포함) </li><li> 2 μL 비오틴 HPDP (1 MG / ML DMF) </li></ol></li></ol> 항상 비오틴 HPDP 마지막으로 추가하고 pipetting하여 즉시 섞는다. 비오틴은 침전물 경우에, DMF 콘텐츠는 40 %의 최종 농도를 증가시킬 수있다. <ol start="3"><li> 회전 1.5 시간 동안 실온에서 알을 품다. </li><li> 클로로포름의 동일한 볼륨을 추가합니다. 적극적으로 섞는다. 단계 분리하기 시작하고 거품이 사라 시작할 때까지 삼분 - 2 품어. </li><li> 4 ℃에서 5 분간 20,000 × g에서 원심 분리 조심스럽게 새로운 튜브로 위 수성 단계를 전송합니다. </li><li> 한 단계 3.4 및 3.5를 반복합니다. 당신은 RNA의 손실을 줄이기 위해 2 ㎖ 위상 잠금 젤 무거운 관이 단계를 수행 할 수 있습니다. </li><li> RNA 강수량 : 추가 1 / 10 5 M NaCl을의 부피와 같은 부피의물 단계로 이소프로판올. </li><li> 4 ℃에서 20 분간 20,000 × g에서 원심 분리 상층 액을 버린다. </li><li> 상층 액을 버리고, 4시 10 분 ° C에 대해 20,000 75 % 에탄올, 원심 분리기의 동일한 볼륨 × g을 추가합니다. </li><li> 간단히 스핀 200 μL 피펫 잔류 에탄올을 제거합니다. </li><li> 간단히 스핀 20 μL 피펫 잔류 에탄올을 제거합니다. </li><li> RNA 건조 할 수 없습니다. 50에 다시 일시 중지합니다 - 100 μL H 2 O (1 μg 입력 RNA 당 ~ 1 μL). 6 번 - 5 아래로 피펫에 의해 잘 섞는다. </li><li> RNA 저하를 제외 electrophoretical 분석 RNA의 품질을 확인합니다. </li></ol> 4. 4SU​​ - 정관 점 오점 분석 (선택 사항) 4SU​​ 법인은 쉽게 바이오틴 RNA의 점 blot 분석에 의해 결정하실 수 있습니다. 이 문제 해결과 바이오틴 DNA 올리고 컨트롤을 기준으로 4SU 편입 비율의 추정을 허용하는 선택적 단계입니다. 이 분석 우리 연구에 대한단계 3.2 4SU - 라벨 RNA의 biotinylation 대​​신에 바이오틴 HPDP의 iodoacetyl-비오틴 사용 ecommend. 4SU​​-RNA의 돌이킬 수없는 biotinylation이 결과. 따라서 열 기반의 방법 (예 RNeasy) 바이오틴 RNA의 매우 적은 양 (예를 들어, 5 μg)의 복구에 사용할 수 있습니다. RNA는이 분석에 적합합니다 비오틴 - HPDP를 사용하여로 만들었다하지만, 그 결과 신호는 (그림 3) 약한 신호 대 잡음 비율 덜 유리한 것입니다. <ol><li> 섹션 1과 2에 설명 된대로 전체 세포 RN​​A의 4SU-라벨 및 격리를위한 프로토콜을 따르십시오. </li><li> iodoacetyl - 비오틴과 비오틴 - HPDP 교체 3 장에서 설명한 완전히 과도한 iodoacetyl-비오틴 잔류 물을 제거하기 위해 두 클로로포름 추출을 수행 할 때 Biotinylate RNA 4SU - 라벨. </li><li> 설명이나 사건 RNA의 소량 (에 (예를 들어, RNeasy) 컬럼 기반 접근 방법을 사용하는 것과 이소 프로필 알코올 / 에탄올 침전 바이오틴 RNA를 복구 &lt;10 μg) 사용됩니다. </li><li> 10 분 동안 흔들 nuclease가없는 물 제타 막 품어. </li><li> 핵산이없는 물에서 막 가지고 두 개의 깨끗한 종이 타월 단단히 눌러 중간에 막 배치하여 과도한 액체를 제거합니다. 공기 건조 5 분 막하는 것이 더 좋은 점 발생합니다. </li><li> 각 샘플은 차가운 얼음 점 오점 바인딩 버퍼 (10 MM NaOH를 1 mM의 EDTA)를 사용하여 200 μL / NG RNA의 20 μl를 준비합니다. pipetting하여 제타 막이 희석의 5 μL (RNA 즉 1 μg)뿐만 아니라 세 이후에 10 배 희석 (각각 즉, 100, 10, 1 NG RNA를) 적용 할 수 있습니다. 피펫 팁의 빈 선반을 피펫은 고르게 분포 간격을 제공하기 위해 사용될 수있다. 또한, 제조업체의 지침에 따라 점 오점 장치를 사용합니다. </li><li> 긍정적 연속으로 20 일부터 μL / NG 20 PG / μL (즉, 100-0.1 NG 올리고)에 이르기까지 농도에서 비오틴 - 라벨 DNA 올리고의 5 μl를 적용pipetting하여 막 ROL. 대조군으로 바이오틴, 4SU - 순진 샘플을 사용합니다. </li><li> 공기 건조 5 분 막. </li><li> 락 40 ML 차단 버퍼에 30 분 동안 막 품어. </li><li> 15 분 (5 ML PBS가 + 5 ML 20 % SDS + 10 ㎕의 스트렙 타비 딘 - 고추 냉이 과산화 효소)에 대한 1:1,000 스트렙 타비 딘 - 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 10 mL로 막을 배양 </li><li> 5 분 40 ML PBS + 10 % SDS (20 ML PBS가 + 20ml를 20 % SDS)에 두 번 막 씻으십시오. </li><li> 40 ML PBS로 두 번 막 씻어 5 분 + 1 % SDS (38 ML PBS가 + 2 ML 20 % SDS). </li><li> 40 ML PBS로 두 번 막 씻어 5 분 + 0.1 % SDS (40 ML PBS가 + 200 ㎕의 20 % SDS). </li><li> 두 깨끗한 종이 타월 사이에 막 배치하고 단단히 그들을 눌러 과도한 액체를 제거합니다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 ECL을 사용하는 멤브레인 바인딩 HRP을 시각화. </li><li> 플라스틱 호일 / 가방에 막 배치, 공기 방울을 제거하고 어둠 속에서 2 분 동안 품어. </li><li> 막에 노출1 막 - 5 분​​. </li></ol> 5. 스트렙 타비 딘 - 코팅 자석 구슬을 사용하여 레이블과 레이블없는 RNA의 분리 <ol><li> 열 ° C의 물을 욕조에 65 (샘플 당 3 mL)에 버퍼를 세척. </li><li> nuclease가없는 H 2 O에 신선한 100 MM의 디티 올 트레이 톨 (DTT)를 준비 초 미세 규모에 배치 깨끗한 50 ML 팔콘 튜브에 DTT 분말의 30 MG - 15 경사 분리하여이를 수행. nuclease가없는 H 2 O의 필요한 양을 달아 추가 </li><li> 열 ° C 10 변성하는 분, 얼음에 즉시 장소를 65 RNA 샘플로 만들었다. </li><li> 장소는 마그네틱 스탠드에 열을 μMacs. 우리는 한 번에 12 개 이상의 샘플 (- 8 샘플이 최적이다 6) 처리를하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 1 ML 실온 버퍼를 세척으로 미리 평형 소개 Miltenyi 열. 이 약 15 분 소요됩니다. </li><li> 한편, 50 스트렙 타비 딘 구슬 100 μL를 추가합니다 - 바이오틴 RNA의 100 μl를. 회전 15 분 실온에서 알을 품다. </li> &lt;<html> 리&gt; 열 중 하나가 지금까지 배출 시작되지 않은 경우이를 부드럽게 장갑을 낀 손가락으로 열 상단을 눌러 의해 촉진 될 수있다. 일단 흐름은 열이 쉽게 배출하기 시작했다. </li><li> 열에 RNA / 비즈를 적용합니다. 흐름을 통해 당신은 레이블이없는 RNA 분획 (7 항 참조)를 복구하려는 경우가 아니면 폐기하십시오. </li><li> 0.9 65 ML ° C 세척 버퍼 (65 ° C에서 버퍼를 피펫 팅 할 때 1 ML 피펫 팁 축소).로 3 회 세척 </li><li> 0.9 ML 실온 버퍼 세탁 3 회 씻는다. </li><li> 피펫 700 μL 버퍼 새로운 2 ㎖ 튜브에 RLT (RNeasy MinElute 정리 키트 퀴 아젠)와 열 아래에 배치합니다. </li><li> 열을 100 MM의 DTT의 100 μl를 추가하여 RLT 버퍼에 새로 전사 RNA를 용출. </li><li> 100 MM의 DTT의 또 다른 100 μl를 추가하여 나중에 동일한 튜브에 두 번째 용출 라운드 3 분을 수행합니다. </li></ol> 6. 새로 전사 RNA 복구 ontent는 &quot;&gt; 제조 업체의 지침에 따라 RNeasy MinElute 정리 (Qiagen의) 프로토콜을 계속 진행합니다. 25 μL nuclease가없는 H 2 O 측정 RNA 농도에서 용출이 Nanodrop 분광 광도계를 사용하여. 제출하기 전에 RNA를 해동하고 다시 동결하지 않으려면 그것은 높은 처리량 분석에, 우리는 즉시 새로 전사 RNA 후 cDNA를 준비하는 것이 좋습니다이 정화됩니다. 제조업체의 지침에 따라 cDNA를 합성 20 μL의 cDNA 합성 믹스 새로 전사 RNA의 2.5 μl를 사용합니다. 1을 사용 QRT-PCR 컨트롤을 수행 : cDNA를 혼합 10 희석 -80에서 보관 RNA ° C.. 7. 레이블이없는, 언 바운드 RNA (선택 사항) 복구 경우에 언 바운드 RNA 복구 할 필요가; 흐름을 통해 (열을 RNA-스트렙 타비 딘 비즈 솔루션을 추가 한 후) 이후의 강수량에 대한 첫 번째 세척을 수집하고 결합한다. 보통 생로 언 바운드 RNA의 50 %가 침전 충분하다s는 출발 물질의&gt; 80 %를 포함합니다. <ol><li> 이소프로판올의 동일한 볼륨을 추가 (아무런 소금 세척 버퍼가 이미 1 M의 NaCl을 포함으로 추가 할 필요가 없습니다). </li><li> 4 ℃에서 20 분간 20,000 × g에서 원심 분리 상층 액을 버린다. </li><li> 상층 액을 버리고, 4시 10 분 ° C에 대해 20,000 75 % 에탄올, 원심 분리기의 동일한 볼륨 × g을 추가합니다. </li><li> 간단히 스핀 200 μL 피펫 잔류 에탄올을 제거합니다. </li><li> 간단히 스핀 20 μL 피펫 잔류 에탄올을 제거합니다. </li><li> RNA 건조 할 수 없습니다. 100 μL H 2 O에 resuspend을 6 번 - 5 아래로 피펫에 의해 잘 섞는다. 동요와 함께 10 분 동안 65 ° C에서 알을 품다과 얼음에 직접 전송할 수 있습니다. </li><li> RNA 저하를 제외 electrophoretical 분석 RNA의 품질을 확인합니다. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

새로 전사 RNA 대사 라벨이 실질적으로 관심의 생물학적 문제를 해결하기 위해 더 적합한 템플릿을 제공하여 마이크로 어레이 및 RNA-SEQ와 같은 높은 처리량 기술의 힘을 강화한다. 본 프로토콜은 광범위한 최적화를 받았다. 그것은 새로 전사 RNA의&gt; 1,000 배 농축을 허용하고 재현성이 높은 결과를 제공합니다. 새로 전사 RNA는 4SU에 세포의 노출 시간 동안 실시간으로 전사 활?...

유전자 발현 프로파일 링은 세포 프로세스와 관련된 복잡한 상호 작용 네트워크를 연구하는 데 중요한 도구입니다. mRNA의 풍요 로움에 대한 연구는 일반적으로 기본 분자 메커니즘에 대한 기본적인 통찰력을 얻기 위해 선택의 방법이었다. 전체 - 사체 마이크로 어레이 1, RNA (RNA-SEQ) 2-4 최근에는 차세대 시퀀싱의 개발이 방법을 연료. 이 기술은 세포의 유전자 발현의 복잡성에 대한 우리의 이해를 혁명을 가지고 있지만, 그들은 그들의 템플릿 샘플의 고유 특성 즉, 전체 세포 RNA로 인해 큰 한계에 직면하고 있습니다. 총 RNA 수준에서 첫째, 단기 변화는 전사 속도의 변화와 일치하지만, RNA 해당 증명서의 반감기에 근본적으로 의존하지 않는다. 전사 인자에 대한 짧은 증명서, 예를 들어, 인코딩의 다섯 배 유도, 총 RNA에서 쉽게 감지 할 수있을 것입니다 반면시간 내에, 대사 효소 수명이 긴 증명서, 예를 들어, 인코딩 같은 유도가 거의 보이지 않는 상태로 유지됩니다. 또,이 셧다운 (&gt; 1,000 배 아래로 조절) RNA 오시간의 반감기는 평균 유전자의 전사 속도 완료는 단순히 단지 두 가지에 의해 감소​​하기 위해 총 RNA 수준에 대한 다섯 시간 소요됩니다 . 따라서 총 RNA의 분석은 규제 기능 5와 전사 인자와 유전자 인코딩 중 많은 짧은 성적의 최대 규제의 검출을 선호. 또한, 규제의 진정한 운동 폭포가 가려 및 기본 신호 이벤트는 보조 구별 할 수 없습니다. 모두 차례로 하류 생물 정보학 분석에 상당한 편차가 발생할 수 있습니다. 둘째, 총 RNA 수준의 변화는 RNA 합성 또는 붕괴의 변화에​​ 기인 할 수 없습니다. 후자의 측정 transcripti을 차단하는 세포 침입 방법, 예를 들면 필요actinomycin D 6 시간이 지남에 지속적인 RNA 붕괴의 확장 된 모니터링을 사용합니다. 5 포유류 세포에서 평균 mRNA의 반감기 - 10 시간 5,7, 대부분의 유전자의 mRNA 수준은 두 가지 전사 체포 몇 시간에 따라보다 감소 할 것이다. 이 오히려 작은 차이는 기본 수학 방정식의 지수 특성으로 인해 세포의 유전자의 대부분 mRNA의 반감기 심하게 부정확 한 측정의 결과. 마지막으로, 동시에 전체 세포 RNA의 RNA-SEQ는 우리의 유전자의 절반 정도가 대안 접합 이벤트 8, 기본 역학뿐만 아니라 제대로 이해 남아 RNA 가공의 조직 및 상황 별 규제 지침 동적 메커니즘이 적용됩니다 것으로 나타났습니다. 또한, RNA의 기여, 특히 비 코딩 RNAs를 위해 결정되어야 유지, 차등 유전자 발현을 처리. 모두 이러한 제한에 대한 주요 장애물을 나타냅니다기본 분자 메커니즘의 생물 정보학 운동 모델링. 우리는 최근에 이러한 문제에게 5,7,9을 극복하기 위해,라고 고해상도 유전자 발현 프로파일 링 방법을 개발했다. 그것은 4 thiouridine (4SU 태깅), 자연적으로 발생 딘 유도체를 사용하여 새로 전사 RNA의 대사 라벨에 따라 세포 성장과 유전자 발현의 최소한의 간섭 (그림 1 참조) 5를 새로 전사 전사에 직접 액세스를 제공합니다 10-12. 급속한 흡수, 4SU - 인산을 인산화, 그리고 새로 전사 RNA에 결합의 4SU 결과 진핵 세포의 노출. 전체 세포 RN​​A의 분리 후, 4SU - 라벨 RNA 분획은 티올, 특히 비오틴하고 새로 전사 RNA 사이의 이황화 결합을 생성로 만들었다이다. &#39;전체 세포 RN​​A&#39;는 다음 정량 ( &#39;새로 전사&#39;)과 레이블 ( &#39;사전 existin 표시로 구분 될 수있다스트렙 타비 딘 - 코팅 자석 구슬을 사용하여 고순도 G &#39;) RNA. 마지막으로, 라벨 RNA는 단순히 이황화 결합을 쪼개서 환원제 (예를 들면 디티 올 트레이 톨)을 추가하고 구슬에서 새로 전사 RNA를 풀어 구슬에서 복구됩니다. 새로 전사 RNA는 4SU 노출의 기간 동안 모든 유전자의 전사 활성을 보여줍니다. 분의 척도에 4SU 태깅 따라서 진핵 생물의 유전자 발현의 스냅 사진과 다운 스트림 생물 정보학 분석 (예 : 프로모터 분석)를위한 이상적인 템플릿을 제공합니다. 정상 상태를 가정 할 수 경우의 비율 새로 전사 / 전체 새로 베껴 / 레이블이와 레이블이없는 / 총 RNA 정확한 RNA 반감기 7,13에 대한 비 침습 액세스를 제공합니다. 또, 4SU - 태깅으로 작은 5로 분 (5 분 4SU-RNA) 후 정제가 새로 전사 RNA를주의하는 것이 중요하다 15, 60 분 4SU-RNA 미만이다.RNA-SEQ와 함께 하나의 실험 설정에서 4SU를 붙이고는 매우 짧고 점차적으로 더 이상 모두를 수행 할 때, RNA 프로세싱의 반응 속도는 염기 해상도 9시에 공개된다. 마지막으로, 전산 모델링과 함께 새로 베껴 총 RNA 시간 코스 분석은 RNA 합성과 부패 14의 통합 분석을 할 수 있습니다. 결론적으로,이 방법은 진핵 세포의 RNA 합성, 처리 및 분해의 역 동성을 직접 분석 할 수 있습니다. 그것은 포유 동물, 곤충 (초파리), 양서류 (Xenopus의), 효모 5,15,16 포함한 모든 주요 모델 생물에 적용됩니다. 그것은 마이크로 어레이 분석 5,17, RNA-SEQ 9,13,14과 직접 호환 및 생체 12,15에 적용됩니다. 여기에, 우리는 세부 방법론, 라벨 분리, 배양 포유 동물 세포에서 새로 전사 RNA를 정화. 또한, 적합한 한쌍에게있는알 문제와 함정을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>4-thiouridine</td><td>Carbosynth</td><td>T4509</td><td>Prepare 50 mM stock in sterile H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, store at -20 &amp;deg;C in aliquots of 50-500 &amp;mu;l, discard unused reagent, do not refreeze.</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)</td><td>&lt;strong&gt;WARNING - CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH!&lt;/strong&gt; Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>372978</td><td>&lt;strong&gt;WARNING - HAZARDOUS TO HEALTH&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td>&lt;em&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Sodium citrate, nuclease-free</td><td>Sigma</td><td>C8532</td><td>Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water.</td></tr><tr><td>5M nuclease-free NaCl</td><td>Sigma</td><td>71386</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>Nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td>Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes.</td></tr><tr><td>RNA precipitation buffer</td><td></td><td></td><td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td>Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>10x Biotinylation Buffer (BB)</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml.</td></tr><tr><td>Dimethylformamide (DMF)</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link biotin-HPDP</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 &amp;deg;C in aliquots of 1 ml.</td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0032 005.152</td><td>Optional for the chloroform extraction step.</td></tr><tr><td>Zeta membrane</td><td>BIORAD</td><td>162-0153</td><td></td></tr><tr><td>10x Dot blot binding buffer</td><td></td><td></td><td>100 mM NaOH, 10 mM EDTA</td></tr><tr><td>Biotin-oligo</td><td></td><td></td><td>5&#039;-biotin, 25 nucleotides, any sequence</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate</td><td>Fisher</td><td>BPE9738</td><td>For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 &amp;deg;C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate.</td></tr><tr><td>EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin</td><td>Pierce</td><td>21333</td><td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 &amp;deg;C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation.</td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Dot blot blocking buffer</td><td></td><td></td><td>Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM.</td></tr><tr><td>Streptavidin-horseradish peroxidase </td><td>Vector Laboratories</td><td>SA5004</td><td>Store at -20 &amp;deg;C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 &amp;mu;l Streptavidin-HRP before use. </td></tr><tr><td>ECL reagent</td><td>GE Healthcare</td><td>RNP2109</td><td>Use following the manufacturer&#039;s instructions.</td></tr><tr><td>Super RX, X-RA Film, 18x24 cm</td><td>Fujifilm</td><td>47410 19236</td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>Store the beads at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Washing buffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43817</td><td>Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, always prepare fresh before use.</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Store columns at 4 &amp;deg;C, remaining components of the kit at room temperature.</td></tr><tr><td>1.5 ml screw-top polypropylene tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>2.0 ml screw-top polypropylene tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>50 ml tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td colspan="4">All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt; </td></tr><tr><td>UV/VIS spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>Or equivalent. Use low volume (1-2 &amp;mu;l) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss.</td></tr><tr><td>Polypropylene 15 ml centrifuge tubes</td><td>VWR International</td><td>525-0153</td><td>In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 &amp;#215; g</td></tr><tr><td>High-speed centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-25</td><td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&amp;#215;g</td></tr><tr><td>High-speed rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JLA-16250</td><td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&amp;#215;g</td></tr><tr><td>Adaptors for 15 ml tubes</td><td>Laborger&amp;#228;te Beranek</td><td>356964</td><td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&amp;#215;g</td></tr><tr><td>Refrigerated table-top centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer compact</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>One stand holds 8 &amp;mu;Macs columns.</td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Grant</td><td>SUB Aqua 5</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>Ultra-fine scale</td><td>A&amp;amp;D</td><td>GR-202</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>E-Gel iBase Power System</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>For RNA gels; or equivalent.</td></tr><tr><td>E-Gel EX 1% agarose precast gels</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>For RNA gels; or equivalent.</td></tr></tbody></table>

metabolic labeling of newly transcribed rna for high resolution gene expression profiling of rna synthesis, processing and decay in cell culture

전체 - 사체 마이크로 어레이 차세대 시퀀싱의 개발은 세포의 유전자 발현의 복잡성에 대한 우리의 이해를 혁명하고 있습니다. 참여 분자 메커니즘에 대한 이해와 함께, 기본 역학의 정확한 측정은 점점 중요 해지고있다. 여기에 이러한 강력한 방법론 템플릿 샘플들이 연구 즉, 전체 세포 RNA의 고유 특성으로 인해 주요 한계에 직면하고 있습니다. 대부분의 경우 전체 세포 RN​​A의 변화는 충분한 해상도를 기본 분자 사건과 반응 속도를 나타내는 하나 너무 느리게 혹은 너무 빨리 발생합니다. 또한, RNA 합성, 처리 및 부패의 변화의 기여도는 쉽게 구별되지 않습니다. 우리는 최근 이러한 한계를 극복하기 위해 고해상도 유전자 발현 프로파일을 개발했습니다. 우리의 접근 방식은 4 thiouri에 새로 전사 RNA의 대사 라벨에 근거식사는 (따라서도 4SU를 붙이기로 함) 티올 특정 biotinylation와 스트렙 타비 딘 - 코팅 자석 구슬을 사용하여 새로 전사 RNA의 엄격한 정화가 따랐다. 그것은 척추 동물, 초파리, 효모 등 미생물의 넓은 범위에 적용 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로, 전사 인자의 활동을 실시간으로 속도를 연구 RNA 반감기의 정확한 측정을 제공하며, RNA 처리 속도론에 새로운 통찰력을 얻을 수 4SU - 태그를 적용했다. 마지막으로, 전산 모델링은 기본 분자 메커니즘의 통합, 포괄적 인 분석을 생성하기 위해 사용될 수있다.

1. 원료 및 예상 수익률 4SU​​ 노출 1 시간 (시간)에 따라 새로 전사 RNA는 약 1 대표 - 전체 세포 RN​​A의 4 %를. 그들은 더 이상 세포 성장 / 복제 계정에 RNA를 합성하지 않기 때문에이 성장 체포 세포에서 낮은 것입니다. 총 RNA의 80 μg - 1 시간 동안 붙일 경우, 우리는 60와 분석을 시작하는 것이 좋습니다. biotinylation 단계 이후 확인하기 어려운 작은 RNA 펠렛 총 RNA 결과보다 30 μg으...

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Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

전체 세포 RN​​A 단기 RNA 합성과 붕괴의 변화뿐만 아니라 RNA 처리 속도론을 연구 가난한 템플릿을 제공합니다. 여기에, 우리는 4 thiouridine에 새로 전사 RNA의 대사 라벨을 설명하는 이러한 한계를 극복 할 수 있도록 새로 전사 RNA의 싸이 특정 biotinylation 및 정제에 의해 따랐다.

세포 배양에서 RNA 합성, 처리 및 부패의 높은 해상도 유전자 발현 프로파일에 대한 새로 전사 RNA 대사 라벨링

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

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Research

JoVE Journal

Biology

27.1K 조회수.  Max von Pettenkofer Institute. 전체 세포 RN​​A 단기 RNA 합성과 붕괴의 변화뿐만 아니라 RNA 처리 속도론을 연구 가난한 템플릿을 제공합니다. 여기에, 우리는 4 thiouridine에 새로 전사 RNA의 대사 라벨을 설명하는 이러한 한계를 극복 할 수 있도록 새로 전사 RNA의 싸이 특정 biotinylation 및 정제에 의해 따랐다.

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Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

연구

유전학

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for protein synthesis by translating codons in mRNA into amino acid sequences. tRNAs were long considered as house-keeping molecules that lacked regulatory functions. However, a growing body of evidence indicates that cellular tRNA levels fluctuate in correspondence to varying conditions such as cell type, environment, and stress. The fluctuation of tRNA expression directly influences gene translation, favoring or repressing the expression of particular proteins. Ultimately comprehending the dynamic of protein synthesis requires the development of methods able to deliver high-quality tRNA profiles. The method that we present here is named SPOt, which stands for Streamlined Platform for Observing tRNA. SPOt consists of three steps starting with metabolic labeling of cell cultures with radioactive orthophosphate, followed by guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction of radioactive total RNAs and finally hybridization on in-house printed macroarrays. tRNA levels are estimated by quantifying the radioactivity intensities at each probe spot. In the protocol presented here we profile tRNAs in Mycobacterium smegmatis mc2155, a nonpathogenic bacterium often used as a model organism to study tuberculosis.

We describe an original transfer RNA analysis platform named SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt simultaneously measures cellular levels of all tRNAs in biological samples, in only three steps, and in less than 24 hours.

신진 대사 라벨 및 Macroarrays를 사용 하 여 전송 RNAs의 프로 파일링

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

생물학

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of the RNA produced during a brief period of labelling. This is done by attaching a biotin moiety to the incorporated thio group and affinity purifying, using streptavidin coated beads. Achieving a good yield of pure, newly synthesized RNA that is free of pre-existing RNA makes shorter labelling times possible and permits increased temporal resolution in kinetic studies. This is a protocol for very specific, high yield purification of newly synthesized RNA. The protocol presented here describes how RNA is extracted from the yeast Saccharomyces cerevisiae. However, the protocol for purification of thiolated RNA from total RNA should be effective using RNA from any organism once it has been extracted from the cells. The purified RNA is suitable for analysis by many widely used techniques, such as reverse transcriptase-qPCR, RNA-seq and SLAM-seq. The specificity, sensitivity and flexibility of this technique allow unparalleled insights into RNA metabolism.

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

The use of thiolated uracil to sensitively and specifically purify newly transcribed RNA from the yeast Saccharomyces cerevisiae.

4-티우라실(Ers4tU)을 가진 생체내 RNA의 매우 신속하고 특정한 대사 라벨링

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

생화학

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

싱글 생활 세포에서 mRNA의 전사의 속도론을 측정

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

단일 분자 형광 제자리에서 교 잡 실험에 대 한 개별 대장균 세포에 성적표를 라벨에 대 한 방법

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

마우스 간에서 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Metabolic Labeling

Metabolic labeling is used to probe the biochemical transformations and modifications that occur in a cell. This is accomplished by using chemical analogs that mimic the structure of natural biomolecules. Cells utilize analogs in their endogenous biochemical processes, producing compounds that are labeled. The label allows for the incorporation of detection and affinity tags, which can then be used to elucidate metabolic pathways using other biochemical analytical techniques, such as SDS-PAGE and NMR.
This video introduces the concepts of metabolic labeling and show two general procedures.&#160; The first uses isotopic-labeling, to characterize the phosphorylation of a protein. The second covers a photoreactive labeling to characterize protein-protein interaction within a Also three applications of metabolic labeling are presented: labeling plant material, labeling RNA to measure kinetics and labeling glycans in developing embryos.

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Metabolic labeling is used to investigate the machinery of a cell. This is accomplished using chemical analogs to probe the biochemical transformations and modifications that occur. This video will show the principles of metabolic labeling, typical isotopic and photoreactive labeling procedures, and some applications.
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Metabolic labeling can be conducted using a number of strategies. Here we will describe isotopic, photoreactive, and bio-orthogonal labeling.
Isotopic labeling is performed using structural analogs that are chemically identical to their natural counterparts, but have uncommon isotopes incorporated into their structure. In this L-lysine analog the carbon and nitrogen atoms are replaced with carbon-13 and nitrogen-15. Cells cultured in the presence of isotopic analogs will incorporate them into their biochemical structures. Metabolites are collected from the cells and purified for analysis. Samples with stable isotopes are analyzed using techniques such as mass spectrometry or NMR spectroscopy. Samples with radioactive labels are analyzed using liquid scintillation counting and x-ray films, which will be demonstrated in the isotopic labeling protocol.
Photoreactive labels are functional groups incorporated into proteins, which are stable until exposed to ultraviolet light. The functional group forms a reactive radical, which binds to the nearest protein. A common example, L-photo-leucine, contains a diazirine ring, which is a photoreactive crosslinker. In contrast to isotopic labeling, there is some chemical dissimilarity between photo-reactive chemical analogs and their natural counterparts. Cells may preferentially incorporate natural compounds over analogs. Therefore, it is important to perform photo-reactive labeling in medium free of the compound being mimicked. Once exposed to ultraviolet radiation, the photo-reactive groups in a labeled protein become unstable and highly reactive, causing it to cross-link with interacting proteins, creating a protein complex. Cross-linked complexes, act as snapshots that can then be analyzed using SDS-PAGE and mass spectrometry methods. This provides insights into what reactions are occurring in the metabolic pathway by identifying reaction species and how they interact by determining binding sites.
Bioorthogonal labeling strategies utilize analogs with small functional groups that have little to no reactivity with natural biomolecules. For example, azides are small functional groups, whose reactivity is said to be orthogonal to biochemical reactions. In the Staudinger ligation, a phosphine group attacks the azido group. This yields a transition state that intramolecularly reacts with a nearby ester, resulting in an amine-bonded ligand. Bioorthogonal functional groups incorporated into biomolecules can be ligated with detection tags such as fluorescent functional groups, and affinity tags such as antigens.
Now that some concepts and strategies for metabolic labeling have been discussed, let&#39;s look at the process in the laboratory.
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The first step in a metabolic labeling experiment is to collect the protein of interest. To do this, cells are grown on a plate, and an expression method is used to promote synthesis of the desired protein. In this example, leucine-rich repeat kinases, or LRRK, are expressed. Disodium phosphate, containing radioactive phosphorus-32, is used as the analog. Proper measures must be taken to protect against ionizing radiation. This includes setting up a work area, wearing proper protective equipment, and checking for radioactive contamination. Once safety measures have been taken, the medium containing the isotopic analogs is prepared. The medium from the culture is removed and, replaced with one containing the isotopic chemical analogs and then incubated. Following incubation, the cells are lysed. The lysate is collected and purified.
After purification, proteins are resolved using SDS-PAGE and then transferred to a PVDF membrane. Autoradiography is performed by exposing the membrane to x-ray film and measured using a phosphor imager. Western blotting is used to measure relative protein levels in the PVDF membrane. In this example the phosphorylation levels of leucine-rich repeat kinases synthesized in 293T cells were measured. The autoradiogram shows how much phosphorous was incorporated into the protein. Western blotting elucidates the levels of the LRRK proteins. Image analysis software is used to obtain quantitative data of phosphorylation levels of the proteins.
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In this next procedure, photoreactive labeling is demonstrated. First, the cells are prepared and cultured. The photoreactive analog is added to the cells at the mid-log phase and incubated. In this procedure p-benzoylphenylalanine is used. Samples are collected over intervals and put on ice. The samples are then exposed to obtain snapshots of the biochemical pathways over time. The proteins of interest are then purified and resolved using SDS-PAGE.
A photoreactive labeling strategy was used to identify compounds that interact with the protein of interest. Immunodetection with Western blotting shows protein bands that indicate higher molecular weight proteins are present in the irradiated samples. These are from cross-linking due to protein-protein interaction occurring during the UV irradiation.
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Now that we&#39;ve reviewed metabolic labeling procedures, let&#39;s look at some of the ways the process is used.
Metabolic labeling concepts can be extended to multicellular organisms. Plants are grown in a sealed environment, rich in stable isotopes to produced labeled plant material. Carbon dioxide containing carbon-13 is added to the enclosure, while nitrogen-15 rich fertilizer is used. The resulting harvested plant material can help answer questions about carbon and nitrogen cycling from the ecosystem.
Labeling enables the separation of newly synthesized RNA from older RNA. By changing the initial concentration of analog, the kinetics of new RNA synthesis can be determined. The results show that the concentration of 4-thiouridine affects how much new RNA is transcribed. Additionally, incorporation rates of the label into RNA can be directly quantified with a spectrophotometer.
Using biorthogonal click chemistry, glycans in a zebra fish embryo can be labeled. The eggs are injected with a labeling compound that results in alkyne labels on the glycans. The glycans in the larvae are then ligated to a dye compound at the desired development stage. The glycans in the embryos are then imaged. Glycans produced at different time points can be identified by labeling using different colors at different stages of embryo development.
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You&#39;ve just watched JoVE&#39;s video on metabolic labeling. This video described the concepts behind metabolic labeling and their strategies, went over two general procedures, and covered some of the uses of the techniques.
Thanks for watching!
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Isotopic, Photoreactive and Bioorthogonal Metabolic Labeling

신진 대사 라벨링

Metabolic labeling is used to probe the biochemical transformations and modifications that occur in a cell. This is accomplished by using chemical analogs ...