우리는 원고의주의 읽기 에이미 레이건에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 LD와 CCF에 DFG 부여 FR2938/1-1에 NGFN 플러스 부여 # 01GS0801, MRC 교제를 부여 G1002523 및 NHSBT 부여 WP11-05에 의해 지원되었다

1. 4 thiouridine과 신진 대사 라벨링 실험 설정 / 일정 세부 계획을 만들어 세포 배양에 4SU를 추가 할 때 샘플을 채취 할 때 예를 들어. 각 조건 사이에 적어도 5 분 계획. 한 번에 하나의 조건의 세포를 처리합니다. 최대 처리 할 수​​ 있습니다. 3 - 주어진 시간에 5 접시. 온도와 CO 2 농도의 변화를 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 전지를 처리합니다. 이 세포 단백질 4SU - 라벨 RNA의 가교 될 수 있으므로 4SU가 추가 된 후 밝은 빛에 세포를 노출시키지 마십시오. 라벨의 시작 <ol><li> 해동 4 thiouridine (4SU) 단지 멸균 팔콘 튜브에 각 조건에 대한 4SU의 사용과 피펫 필요한 양 전. </li><li> 요리 떨어져 세포 배양 매체의 필요한 금액 (10cm 접시 당 5 ML)를 타고 4SU 함유 팔콘 튜브에 첨가하고 잘 섞는다. 제거하고 요리의 나머지 매체를 폐기하십시오. </li> &lt;리&gt; 요리에 4SU 함유 배지를 다시 적용합니다. </li></ol> 라벨의 끝 <ol start="4"><li> 세포에서 세포 배양액을 제거합니다. 각 플레이트에 TRIZOL의 5 ML을 추가합니다. 여러 시간 지점 또는 조건을 포함 복잡한 실험을 위해,이 단계가 가장 두 사람이 중간 TRIZOL을 추가하고 해물을 수확 기타를 제거 하나에 의해 이루어집니다. </li><li> 완전한 세포 용해 실온에서 5 분 알을 품다. </li><li> 추가 TRIZOL으로 조심스럽게 접시를 헹굴 10 ㎖ 피펫을 사용합니다. 이 완전한 세포 용해 및 샘플 복구 제품. 피부 나 눈에 접촉 가져올 때 TRIZOL 매우 위험한 상태로 취급주의! 손 페놀 화상 (예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 300 또는 산업 메틸화 영혼 (70:30) 400)에 대한 해독제가있다. 폴리 프로필렌 튜브에 샘플을 전송합니다. 표준 팔콘 ​​튜브)이 높은 G의 힘에 저항하지 않도록주의하시기 바랍니다. 샘플은 내가 총 RNA 때까지 적어도 한 달 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다들 준비. </li></ol> 2. 수정 TRIZOL 프로토콜을 사용하여 RNA 준비 <ol><li> 1 ML 클로로포름 (ML TRIZOL 당 0.2 ML) 추가하고 15 초 동안 격렬하게 흔들어. 3 분 - 2 실온에서 알을 품다. </li><li> 4시 15 분 13,000 × g에서 원심 분리기 ° C. </li><li> 새로운 15 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 수성 상위 단계 (RNA 포함) 전송합니다. </li><li> 추가 ½ RNA 침전 버퍼와 이소프로판올 모두의 반응 볼륨 (3 ML 상층에 예를 들어, 1.5 ML RNA 침전 버퍼와 1.5 ML 이소프로판올 추가). </li><li> 잘 섞는다. 10 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 4에서 10 분간 13,000 × g에서 원심 분리기 ° C. 상층 액을 버린다. </li><li> 간단히 스핀 다운 (5,000 × g에서 30 초) 200 μL 피펫 잔류 이소프로판올을 제거합니다. </li><li> 75 % 에탄올의 동일한 볼륨을 추가하고 펠렛 분리 될 때까지 튜브를 흔들어. residua이 같은 여러 개의 작은 조각으로 파손되지 않도록하는 것은 만들 수 있습니다 제거L의 에탄올 어렵다. </li><li> 4에서 10 분간 13,000 × g에서 원심 분리기 ° C. 상층 액을 버린다. </li><li> 간단히 RNA를 회전하고 200 μL 피펫으로 남아있는 에탄올을 제거합니다. 20 μL 피펫으로 남아있는 에탄올 단계를 제거를 반복합니다. 이 두 단계 후, 펠렛의 더 건조가 수행되지 않아야합니다. </li><li> 100 μg 예상 RNA 수율 당 H 2 O의 100 μl를 추가하고 5를 위아래로 pipetting에 의해 잘 섞는다 - 6 번 RNA를 용해에 도움. </li><li> 용해와 65 가열하여 RNA를 변성 ° C 10 분 (뿌리)에 대한 즉시 얼음에 배치합니다.을 </li><li> 제조업체의 지침에 따라, Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 260 nm에서 농도를 RNA 측정합니다. 이 RNA는 적어도 한 달 동안 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. 새로 전사 RNA의 싸이 특정 Biotinylation <ol><li> 60로 시작 - 전체 세포 RN​​A 80 μg합니다. </li><li> 반응에 레이블을 구성합니다. 다음의 피펫순서 (당 μg의 RNA) <ol class="lalpha"><li> 1 μL 10X Biotinylation 버퍼 </li><li> 7 μL RNA (핵산 무료 H 2 O에 희석 1 μg의 RNA를 포함) </li><li> 2 μL 비오틴 HPDP (1 MG / ML DMF) </li></ol></li></ol> 항상 비오틴 HPDP 마지막으로 추가하고 pipetting하여 즉시 섞는다. 비오틴은 침전물 경우에, DMF 콘텐츠는 40 %의 최종 농도를 증가시킬 수있다. <ol start="3"><li> 회전 1.5 시간 동안 실온에서 알을 품다. </li><li> 클로로포름의 동일한 볼륨을 추가합니다. 적극적으로 섞는다. 단계 분리하기 시작하고 거품이 사라 시작할 때까지 삼분 - 2 품어. </li><li> 4 ℃에서 5 분간 20,000 × g에서 원심 분리 조심스럽게 새로운 튜브로 위 수성 단계를 전송합니다. </li><li> 한 단계 3.4 및 3.5를 반복합니다. 당신은 RNA의 손실을 줄이기 위해 2 ㎖ 위상 잠금 젤 무거운 관이 단계를 수행 할 수 있습니다. </li><li> RNA 강수량 : 추가 1 / 10 5 M NaCl을의 부피와 같은 부피의물 단계로 이소프로판올. </li><li> 4 ℃에서 20 분간 20,000 × g에서 원심 분리 상층 액을 버린다. </li><li> 상층 액을 버리고, 4시 10 분 ° C에 대해 20,000 75 % 에탄올, 원심 분리기의 동일한 볼륨 × g을 추가합니다. </li><li> 간단히 스핀 200 μL 피펫 잔류 에탄올을 제거합니다. </li><li> 간단히 스핀 20 μL 피펫 잔류 에탄올을 제거합니다. </li><li> RNA 건조 할 수 없습니다. 50에 다시 일시 중지합니다 - 100 μL H 2 O (1 μg 입력 RNA 당 ~ 1 μL). 6 번 - 5 아래로 피펫에 의해 잘 섞는다. </li><li> RNA 저하를 제외 electrophoretical 분석 RNA의 품질을 확인합니다. </li></ol> 4. 4SU​​ - 정관 점 오점 분석 (선택 사항) 4SU​​ 법인은 쉽게 바이오틴 RNA의 점 blot 분석에 의해 결정하실 수 있습니다. 이 문제 해결과 바이오틴 DNA 올리고 컨트롤을 기준으로 4SU 편입 비율의 추정을 허용하는 선택적 단계입니다. 이 분석 우리 연구에 대한단계 3.2 4SU - 라벨 RNA의 biotinylation 대​​신에 바이오틴 HPDP의 iodoacetyl-비오틴 사용 ecommend. 4SU​​-RNA의 돌이킬 수없는 biotinylation이 결과. 따라서 열 기반의 방법 (예 RNeasy) 바이오틴 RNA의 매우 적은 양 (예를 들어, 5 μg)의 복구에 사용할 수 있습니다. RNA는이 분석에 적합합니다 비오틴 - HPDP를 사용하여로 만들었다하지만, 그 결과 신호는 (그림 3) 약한 신호 대 잡음 비율 덜 유리한 것입니다. <ol><li> 섹션 1과 2에 설명 된대로 전체 세포 RN​​A의 4SU-라벨 및 격리를위한 프로토콜을 따르십시오. </li><li> iodoacetyl - 비오틴과 비오틴 - HPDP 교체 3 장에서 설명한 완전히 과도한 iodoacetyl-비오틴 잔류 물을 제거하기 위해 두 클로로포름 추출을 수행 할 때 Biotinylate RNA 4SU - 라벨. </li><li> 설명이나 사건 RNA의 소량 (에 (예를 들어, RNeasy) 컬럼 기반 접근 방법을 사용하는 것과 이소 프로필 알코올 / 에탄올 침전 바이오틴 RNA를 복구 &lt;10 μg) 사용됩니다. </li><li> 10 분 동안 흔들 nuclease가없는 물 제타 막 품어. </li><li> 핵산이없는 물에서 막 가지고 두 개의 깨끗한 종이 타월 단단히 눌러 중간에 막 배치하여 과도한 액체를 제거합니다. 공기 건조 5 분 막하는 것이 더 좋은 점 발생합니다. </li><li> 각 샘플은 차가운 얼음 점 오점 바인딩 버퍼 (10 MM NaOH를 1 mM의 EDTA)를 사용하여 200 μL / NG RNA의 20 μl를 준비합니다. pipetting하여 제타 막이 희석의 5 μL (RNA 즉 1 μg)뿐만 아니라 세 이후에 10 배 희석 (각각 즉, 100, 10, 1 NG RNA를) 적용 할 수 있습니다. 피펫 팁의 빈 선반을 피펫은 고르게 분포 간격을 제공하기 위해 사용될 수있다. 또한, 제조업체의 지침에 따라 점 오점 장치를 사용합니다. </li><li> 긍정적 연속으로 20 일부터 μL / NG 20 PG / μL (즉, 100-0.1 NG 올리고)에 이르기까지 농도에서 비오틴 - 라벨 DNA 올리고의 5 μl를 적용pipetting하여 막 ROL. 대조군으로 바이오틴, 4SU - 순진 샘플을 사용합니다. </li><li> 공기 건조 5 분 막. </li><li> 락 40 ML 차단 버퍼에 30 분 동안 막 품어. </li><li> 15 분 (5 ML PBS가 + 5 ML 20 % SDS + 10 ㎕의 스트렙 타비 딘 - 고추 냉이 과산화 효소)에 대한 1:1,000 스트렙 타비 딘 - 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 10 mL로 막을 배양 </li><li> 5 분 40 ML PBS + 10 % SDS (20 ML PBS가 + 20ml를 20 % SDS)에 두 번 막 씻으십시오. </li><li> 40 ML PBS로 두 번 막 씻어 5 분 + 1 % SDS (38 ML PBS가 + 2 ML 20 % SDS). </li><li> 40 ML PBS로 두 번 막 씻어 5 분 + 0.1 % SDS (40 ML PBS가 + 200 ㎕의 20 % SDS). </li><li> 두 깨끗한 종이 타월 사이에 막 배치하고 단단히 그들을 눌러 과도한 액체를 제거합니다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 ECL을 사용하는 멤브레인 바인딩 HRP을 시각화. </li><li> 플라스틱 호일 / 가방에 막 배치, 공기 방울을 제거하고 어둠 속에서 2 분 동안 품어. </li><li> 막에 노출1 막 - 5 분​​. </li></ol> 5. 스트렙 타비 딘 - 코팅 자석 구슬을 사용하여 레이블과 레이블없는 RNA의 분리 <ol><li> 열 ° C의 물을 욕조에 65 (샘플 당 3 mL)에 버퍼를 세척. </li><li> nuclease가없는 H 2 O에 신선한 100 MM의 디티 올 트레이 톨 (DTT)를 준비 초 미세 규모에 배치 깨끗한 50 ML 팔콘 튜브에 DTT 분말의 30 MG - 15 경사 분리하여이를 수행. nuclease가없는 H 2 O의 필요한 양을 달아 추가 </li><li> 열 ° C 10 변성하는 분, 얼음에 즉시 장소를 65 RNA 샘플로 만들었다. </li><li> 장소는 마그네틱 스탠드에 열을 μMacs. 우리는 한 번에 12 개 이상의 샘플 (- 8 샘플이 최적이다 6) 처리를하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 1 ML 실온 버퍼를 세척으로 미리 평형 소개 Miltenyi 열. 이 약 15 분 소요됩니다. </li><li> 한편, 50 스트렙 타비 딘 구슬 100 μL를 추가합니다 - 바이오틴 RNA의 100 μl를. 회전 15 분 실온에서 알을 품다. </li> &lt;<html> 리&gt; 열 중 하나가 지금까지 배출 시작되지 않은 경우이를 부드럽게 장갑을 낀 손가락으로 열 상단을 눌러 의해 촉진 될 수있다. 일단 흐름은 열이 쉽게 배출하기 시작했다. </li><li> 열에 RNA / 비즈를 적용합니다. 흐름을 통해 당신은 레이블이없는 RNA 분획 (7 항 참조)를 복구하려는 경우가 아니면 폐기하십시오. </li><li> 0.9 65 ML ° C 세척 버퍼 (65 ° C에서 버퍼를 피펫 팅 할 때 1 ML 피펫 팁 축소).로 3 회 세척 </li><li> 0.9 ML 실온 버퍼 세탁 3 회 씻는다. </li><li> 피펫 700 μL 버퍼 새로운 2 ㎖ 튜브에 RLT (RNeasy MinElute 정리 키트 퀴 아젠)와 열 아래에 배치합니다. </li><li> 열을 100 MM의 DTT의 100 μl를 추가하여 RLT 버퍼에 새로 전사 RNA를 용출. </li><li> 100 MM의 DTT의 또 다른 100 μl를 추가하여 나중에 동일한 튜브에 두 번째 용출 라운드 3 분을 수행합니다. </li></ol> 6. 새로 전사 RNA 복구 ontent는 &quot;&gt; 제조 업체의 지침에 따라 RNeasy MinElute 정리 (Qiagen의) 프로토콜을 계속 진행합니다. 25 μL nuclease가없는 H 2 O 측정 RNA 농도에서 용출이 Nanodrop 분광 광도계를 사용하여. 제출하기 전에 RNA를 해동하고 다시 동결하지 않으려면 그것은 높은 처리량 분석에, 우리는 즉시 새로 전사 RNA 후 cDNA를 준비하는 것이 좋습니다이 정화됩니다. 제조업체의 지침에 따라 cDNA를 합성 20 μL의 cDNA 합성 믹스 새로 전사 RNA의 2.5 μl를 사용합니다. 1을 사용 QRT-PCR 컨트롤을 수행 : cDNA를 혼합 10 희석 -80에서 보관 RNA ° C.. 7. 레이블이없는, 언 바운드 RNA (선택 사항) 복구 경우에 언 바운드 RNA 복구 할 필요가; 흐름을 통해 (열을 RNA-스트렙 타비 딘 비즈 솔루션을 추가 한 후) 이후의 강수량에 대한 첫 번째 세척을 수집하고 결합한다. 보통 생로 언 바운드 RNA의 50 %가 침전 충분하다s는 출발 물질의&gt; 80 %를 포함합니다. <ol><li> 이소프로판올의 동일한 볼륨을 추가 (아무런 소금 세척 버퍼가 이미 1 M의 NaCl을 포함으로 추가 할 필요가 없습니다). </li><li> 4 ℃에서 20 분간 20,000 × g에서 원심 분리 상층 액을 버린다. </li><li> 상층 액을 버리고, 4시 10 분 ° C에 대해 20,000 75 % 에탄올, 원심 분리기의 동일한 볼륨 × g을 추가합니다. </li><li> 간단히 스핀 200 μL 피펫 잔류 에탄올을 제거합니다. </li><li> 간단히 스핀 20 μL 피펫 잔류 에탄올을 제거합니다. </li><li> RNA 건조 할 수 없습니다. 100 μL H 2 O에 resuspend을 6 번 - 5 아래로 피펫에 의해 잘 섞는다. 동요와 함께 10 분 동안 65 ° C에서 알을 품다과 얼음에 직접 전송할 수 있습니다. </li><li> RNA 저하를 제외 electrophoretical 분석 RNA의 품질을 확인합니다. </li></ol>

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	<li>Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+new+world+of+the+genome+with+DNA+microarrays.">Exploring the new world of the genome with DNA microarrays.</a> Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+landscape+of+the+yeast+genome+defined+by+RNA+sequencing.">The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing.</a> Science. 320, 1344-1349 (2008).</li><li>Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+repertoire+of+a+eukaryotic+transcriptome+surveyed+at+single-nucleotide+resolution.">Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution.</a> Nature. 453, 1239-U1239 (2008).</li><li>D&#246;lken, L., Ruzsics, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li><li>Yang, E., van Nimwegen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decay+rates+of+human+mRNAs:+correlation+with+functional+characteristics+and+sequence+attributes.">Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes.</a> Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).</li><li>Friedel, C. C., D&#246;lken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+principles+of+mammalian+transcriptional+regulation+revealed+by+RNA+half-life.">Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life.</a> Nucleic Acids Res. 37, e115 (2009).</li><li>Nilsen, T. W., Graveley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+eukaryotic+proteome+by+alternative+splicing.">Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing.</a> Nature. 463, 457-463 (2010).</li><li>Windhager, L., Bonfert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+short+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution.">Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Res. , (2012).</li><li>Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+6-thioguanosine+and+4-thiouridine+into+RNA.+Application+to+isolation+of+newly+synthesised+RNA+by+affinity+chromatography.">Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography.</a> Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).</li><li>Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+labeling+of+RNA+with+uracil+phosphoribosyltransferase+allows+cell-specific+microarray+analysis+of+mRNA+synthesis+and+decay.">Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay.</a> Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).</li><li>Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+newly+synthesized+RNA+in+cells+and+animals.">Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).</li><li>Schwanh&#228;usser, B., Busse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li><li>Rabani, M., Levin, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells.">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. , (2011).</li><li>Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TU-tagging:+cell+type-specific+RNA+isolation+from+intact+complex+tissues.">TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues.</a> Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).</li><li>Miller, C., Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast.">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Mol. Syst. Biol. 7, 458 (2011).</li><li>Weintz, G., Olsen, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phosphoproteome+of+toll-like+receptor-activated+macrophages.">The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages.</a> Mol. Syst. Biol. 6, 371 (2010).</li><li>Lipsett, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+4-thiouridylic+acid+from+the+soluble+ribonucleic+acid+of+Escherichia+coli.">The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).</li><li>Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+Transcriptional+Profiling+of+Cellular+and+Viral+Gene+Expression+during+Lytic+Cytomegalovirus+Infection.">Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection.</a> PLoS Pathog. 8, e1002908 (2012).</li><li>Chomczynski, P., Mackey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+technical+reports.+Modification+of+the+TRI+reagent+procedure+for+isolation+of+RNA+from+polysaccharide-+and+proteoglycan-rich+sources.">Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources.</a> Biotechniques. 19, 942-945 (1995).</li><li>Friedel, C. C., D&#246;lken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+tagging+and+purification+of+nascent+RNA:+implications+for+transcriptomics.">Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics.</a> Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).</li><li>Friedel, C. C., Kaufmann, S., D&#246;lken, L., Zimmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HALO+-+A+Java+framework+for+precise+transcript+half-life+determination.">HALO - A Java framework for precise transcript half-life determination.</a> Bioinformatics. , (2010).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

새로 전사 RNA 대사 라벨이 실질적으로 관심의 생물학적 문제를 해결하기 위해 더 적합한 템플릿을 제공하여 마이크로 어레이 및 RNA-SEQ와 같은 높은 처리량 기술의 힘을 강화한다. 본 프로토콜은 광범위한 최적화를 받았다. 그것은 새로 전사 RNA의&gt; 1,000 배 농축을 허용하고 재현성이 높은 결과를 제공합니다. 새로 전사 RNA는 4SU에 세포의 노출 시간 동안 실시간으로 전사 활?...

유전자 발현 프로파일 링은 세포 프로세스와 관련된 복잡한 상호 작용 네트워크를 연구하는 데 중요한 도구입니다. mRNA의 풍요 로움에 대한 연구는 일반적으로 기본 분자 메커니즘에 대한 기본적인 통찰력을 얻기 위해 선택의 방법이었다. 전체 - 사체 마이크로 어레이 1, RNA (RNA-SEQ) 2-4 최근에는 차세대 시퀀싱의 개발이 방법을 연료. 이 기술은 세포의 유전자 발현의 복잡성에 대한 우리의 이해를 혁명을 가지고 있지만, 그들은 그들의 템플릿 샘플의 고유 특성 즉, 전체 세포 RNA로 인해 큰 한계에 직면하고 있습니다. 총 RNA 수준에서 첫째, 단기 변화는 전사 속도의 변화와 일치하지만, RNA 해당 증명서의 반감기에 근본적으로 의존하지 않는다. 전사 인자에 대한 짧은 증명서, 예를 들어, 인코딩의 다섯 배 유도, 총 RNA에서 쉽게 감지 할 수있을 것입니다 반면시간 내에, 대사 효소 수명이 긴 증명서, 예를 들어, 인코딩 같은 유도가 거의 보이지 않는 상태로 유지됩니다. 또,이 셧다운 (&gt; 1,000 배 아래로 조절) RNA 오시간의 반감기는 평균 유전자의 전사 속도 완료는 단순히 단지 두 가지에 의해 감소​​하기 위해 총 RNA 수준에 대한 다섯 시간 소요됩니다 . 따라서 총 RNA의 분석은 규제 기능 5와 전사 인자와 유전자 인코딩 중 많은 짧은 성적의 최대 규제의 검출을 선호. 또한, 규제의 진정한 운동 폭포가 가려 및 기본 신호 이벤트는 보조 구별 할 수 없습니다. 모두 차례로 하류 생물 정보학 분석에 상당한 편차가 발생할 수 있습니다. 둘째, 총 RNA 수준의 변화는 RNA 합성 또는 붕괴의 변화에​​ 기인 할 수 없습니다. 후자의 측정 transcripti을 차단하는 세포 침입 방법, 예를 들면 필요actinomycin D 6 시간이 지남에 지속적인 RNA 붕괴의 확장 된 모니터링을 사용합니다. 5 포유류 세포에서 평균 mRNA의 반감기 - 10 시간 5,7, 대부분의 유전자의 mRNA 수준은 두 가지 전사 체포 몇 시간에 따라보다 감소 할 것이다. 이 오히려 작은 차이는 기본 수학 방정식의 지수 특성으로 인해 세포의 유전자의 대부분 mRNA의 반감기 심하게 부정확 한 측정의 결과. 마지막으로, 동시에 전체 세포 RNA의 RNA-SEQ는 우리의 유전자의 절반 정도가 대안 접합 이벤트 8, 기본 역학뿐만 아니라 제대로 이해 남아 RNA 가공의 조직 및 상황 별 규제 지침 동적 메커니즘이 적용됩니다 것으로 나타났습니다. 또한, RNA의 기여, 특히 비 코딩 RNAs를 위해 결정되어야 유지, 차등 유전자 발현을 처리. 모두 이러한 제한에 대한 주요 장애물을 나타냅니다기본 분자 메커니즘의 생물 정보학 운동 모델링. 우리는 최근에 이러한 문제에게 5,7,9을 극복하기 위해,라고 고해상도 유전자 발현 프로파일 링 방법을 개발했다. 그것은 4 thiouridine (4SU 태깅), 자연적으로 발생 딘 유도체를 사용하여 새로 전사 RNA의 대사 라벨에 따라 세포 성장과 유전자 발현의 최소한의 간섭 (그림 1 참조) 5를 새로 전사 전사에 직접 액세스를 제공합니다 10-12. 급속한 흡수, 4SU - 인산을 인산화, 그리고 새로 전사 RNA에 결합의 4SU 결과 진핵 세포의 노출. 전체 세포 RN​​A의 분리 후, 4SU - 라벨 RNA 분획은 티올, 특히 비오틴하고 새로 전사 RNA 사이의 이황화 결합을 생성로 만들었다이다. &#39;전체 세포 RN​​A&#39;는 다음 정량 ( &#39;새로 전사&#39;)과 레이블 ( &#39;사전 existin 표시로 구분 될 수있다스트렙 타비 딘 - 코팅 자석 구슬을 사용하여 고순도 G &#39;) RNA. 마지막으로, 라벨 RNA는 단순히 이황화 결합을 쪼개서 환원제 (예를 들면 디티 올 트레이 톨)을 추가하고 구슬에서 새로 전사 RNA를 풀어 구슬에서 복구됩니다. 새로 전사 RNA는 4SU 노출의 기간 동안 모든 유전자의 전사 활성을 보여줍니다. 분의 척도에 4SU 태깅 따라서 진핵 생물의 유전자 발현의 스냅 사진과 다운 스트림 생물 정보학 분석 (예 : 프로모터 분석)를위한 이상적인 템플릿을 제공합니다. 정상 상태를 가정 할 수 경우의 비율 새로 전사 / 전체 새로 베껴 / 레이블이와 레이블이없는 / 총 RNA 정확한 RNA 반감기 7,13에 대한 비 침습 액세스를 제공합니다. 또, 4SU - 태깅으로 작은 5로 분 (5 분 4SU-RNA) 후 정제가 새로 전사 RNA를주의하는 것이 중요하다 15, 60 분 4SU-RNA 미만이다.RNA-SEQ와 함께 하나의 실험 설정에서 4SU를 붙이고는 매우 짧고 점차적으로 더 이상 모두를 수행 할 때, RNA 프로세싱의 반응 속도는 염기 해상도 9시에 공개된다. 마지막으로, 전산 모델링과 함께 새로 베껴 총 RNA 시간 코스 분석은 RNA 합성과 부패 14의 통합 분석을 할 수 있습니다. 결론적으로,이 방법은 진핵 세포의 RNA 합성, 처리 및 분해의 역 동성을 직접 분석 할 수 있습니다. 그것은 포유 동물, 곤충 (초파리), 양서류 (Xenopus의), 효모 5,15,16 포함한 모든 주요 모델 생물에 적용됩니다. 그것은 마이크로 어레이 분석 5,17, RNA-SEQ 9,13,14과 직접 호환 및 생체 12,15에 적용됩니다. 여기에, 우리는 세부 방법론, 라벨 분리, 배양 포유 동물 세포에서 새로 전사 RNA를 정화. 또한, 적합한 한쌍에게있는알 문제와 함정을 설명합니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-thiouridine</td>
 <td>Carbosynth</td>
 <td>T4509</td>
 <td>Prepare 50 mM stock in sterile H2O, store at -20 &deg;C in aliquots of 50-500 &mu;l, discard unused reagent, do not refreeze.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trizol</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)</td>
 <td>WARNING - CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol); Store at 4 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>372978</td>
 <td>WARNING - HAZARDOUS TO HEALTH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isopropanol</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>650447</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate, nuclease-free</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C8532</td>
 <td>Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5M nuclease-free NaCl</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>71386</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free H2O</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>W4502</td>
 <td>Make 1 ml aliquots in nuclease-free tubes.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNA precipitation buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under strictly nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>459844</td>
 <td>Use with nuclease-free water to prepare 80% ethanol, store at -20 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M nuclease-free Tris Cl, pH 7.5</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>51237</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>500 mM nuclease-free EDTA, pH 8.0</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15575-020</td>
 <td>Stock solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Biotinylation Buffer (BB)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water, make aliquots of 1 ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethylformamide (DMF)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4551</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-Link biotin-HPDP</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>21341</td>
 <td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 &deg;C in aliquots of 1 ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phase Lock Gel Heavy tubes 2.0 ml</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>0032 005.152</td>
 <td>Optional for the chloroform extraction step.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zeta membrane</td>
 <td>BIORAD</td>
 <td>162-0153</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Dot blot binding buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM NaOH, 10 mM EDTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-oligo</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>5'-biotin, 25 nucleotides, any sequence</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium dodecyl sulphate</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BPE9738</td>
 <td>For 100 ml 20% stock solution, add 20 g SDS to 80 ml PBS pH 7-8 and adjust volume to 100 ml. Keep all high-percentage SDS solutions above 20 &deg;C. Warm the solutions slightly should SDS precipitate.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>21333</td>
 <td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg iodoacetyl-biotin in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4 &deg;C in aliquots of 1 ml. Generates irreversible, thiol-specific biotinylation.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate buffer saline</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>10010-015</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dot blot blocking buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Mix 20 ml 20% SDS with 20 ml 1 x PBS pH 7-8 and add EDTA to the final concentration of 1 mM.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin-horseradish peroxidase </td>
 <td>Vector Laboratories</td>
 <td>SA5004</td>
 <td>Store at -20 &deg;C. Mix 10 ml 20% SDS with 10 ml 1 x PBS. Add 20 &mu;l Streptavidin-HRP before use. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ECL reagent</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>RNP2109</td>
 <td>Use following the manufacturer's instructions.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Super RX, X-RA Film, 18x24 cm</td>
 <td>Fujifilm</td>
 <td>47410 19236</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&mu;Macs Streptavidin Kit</td>
 <td>Miltenyi</td>
 <td>130-074-101</td>
 <td>Store the beads at 4 &deg;C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P1379</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Washing buffer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol (DTT)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>43817</td>
 <td>Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O, always prepare fresh before use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Store columns at 4 &deg;C, remaining components of the kit at room temperature.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.5 ml screw-top polypropylene tubes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>72.692.005</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.0 ml screw-top polypropylene tubes</td>
 <td>Sarstedt</td>
 <td>72.694.005</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352096</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td>Compatible with Dimethylformamide</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>All solutions/reagents should be stored at room temperature unless otherwise specified.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV/VIS spectrophotometer</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>NanoDrop 1000</td>
 <td>Or equivalent. Use low volume (1-2 &mu;l) for measurements of low RNA concentrations to avoid excessive sample loss.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polypropylene 15 ml centrifuge tubes</td>
 <td>VWR International</td>
 <td>525-0153</td>
 <td>In contrast to standard 15 ml tubes, these tolerate up to 15,000 &times; g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Avanti J-25</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-speed rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JLA-16250</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adaptors for 15 ml tubes</td>
 <td>Laborger&auml;te Beranek</td>
 <td>356964</td>
 <td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&times;g</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated table-top centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5430 R</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thermomixer</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>Thermomixer compact</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic stand</td>
 <td>Miltenyi Biotec</td>
 <td>130-042-109</td>
 <td>One stand holds 8 &mu;Macs columns.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Waterbath</td>
 <td>Grant</td>
 <td>SUB Aqua 5</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultra-fine scale</td>
 <td>A&amp;D</td>
 <td>GR-202</td>
 <td>Or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-Gel iBase Power System</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>G6400UK</td>
 <td>For RNA gels; or equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-Gel EX 1% agarose precast gels</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>G4020-01</td>
 <td>For RNA gels; or equivalent.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

metabolic labeling of newly transcribed rna for high resolution gene expression profiling of rna synthesis, processing and decay in cell culture

전체 - 사체 마이크로 어레이 차세대 시퀀싱의 개발은 세포의 유전자 발현의 복잡성에 대한 우리의 이해를 혁명하고 있습니다. 참여 분자 메커니즘에 대한 이해와 함께, 기본 역학의 정확한 측정은 점점 중요 해지고있다. 여기에 이러한 강력한 방법론 템플릿 샘플들이 연구 즉, 전체 세포 RNA의 고유 특성으로 인해 주요 한계에 직면하고 있습니다. 대부분의 경우 전체 세포 RN​​A의 변화는 충분한 해상도를 기본 분자 사건과 반응 속도를 나타내는 하나 너무 느리게 혹은 너무 빨리 발생합니다. 또한, RNA 합성, 처리 및 부패의 변화의 기여도는 쉽게 구별되지 않습니다. 우리는 최근 이러한 한계를 극복하기 위해 고해상도 유전자 발현 프로파일을 개발했습니다. 우리의 접근 방식은 4 thiouri에 새로 전사 RNA의 대사 라벨에 근거식사는 (따라서도 4SU를 붙이기로 함) 티올 특정 biotinylation와 스트렙 타비 딘 - 코팅 자석 구슬을 사용하여 새로 전사 RNA의 엄격한 정화가 따랐다. 그것은 척추 동물, 초파리, 효모 등 미생물의 넓은 범위에 적용 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로, 전사 인자의 활동을 실시간으로 속도를 연구 RNA 반감기의 정확한 측정을 제공하며, RNA 처리 속도론에 새로운 통찰력을 얻을 수 4SU - 태그를 적용했다. 마지막으로, 전산 모델링은 기본 분자 메커니즘의 통합, 포괄적 인 분석을 생성하기 위해 사용될 수있다.

1. 원료 및 예상 수익률 4SU​​ 노출 1 시간 (시간)에 따라 새로 전사 RNA는 약 1 대표 - 전체 세포 RN​​A의 4 %를. 그들은 더 이상 세포 성장 / 복제 계정에 RNA를 합성하지 않기 때문에이 성장 체포 세포에서 낮은 것입니다. 총 RNA의 80 μg - 1 시간 동안 붙일 경우, 우리는 60와 분석을 시작하는 것이 좋습니다. biotinylation 단계 이후 확인하기 어려운 작은 RNA 펠렛 총 RNA 결과보다 30 μg으...

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Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

전체 세포 RN​​A 단기 RNA 합성과 붕괴의 변화뿐만 아니라 RNA 처리 속도론을 연구 가난한 템플릿을 제공합니다. 여기에, 우리는 4 thiouridine에 새로 전사 RNA의 대사 라벨을 설명하는 이러한 한계를 극복 할 수 있도록 새로 전사 RNA의 싸이 특정 biotinylation 및 정제에 의해 따랐다.

세포 배양에서 RNA 합성, 처리 및 부패의 높은 해상도 유전자 발현 프로파일에 대한 새로 전사 RNA 대사 라벨링

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

metabolic-labeling-newly-transcribed-rna-for-high-resolution-gene

Research

JoVE Journal

Biology

27.0K 조회수.  Max von Pettenkofer Institute. 전체 세포 RN​​A 단기 RNA 합성과 붕괴의 변화뿐만 아니라 RNA 처리 속도론을 연구 가난한 템플릿을 제공합니다. 여기에, 우리는 4 thiouridine에 새로 전사 RNA의 대사 라벨을 설명하는 이러한 한계를 극복 할 수 있도록 새로 전사 RNA의 싸이 특정 biotinylation 및 정제에 의해 따랐다.

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

연구

생물학

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

유전자 발현 분석을위한 배아 Zebrafish 및 cDNA 합성에서 RNA 격리

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

세포 배양의 유도와 Hypoxia의 시험

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HELA 세포 Transfection 얹는 Gaussia의 루시페라제의 mRNA의 시험 관내 스크립트 작성 및 상한에

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

대사율의 측정에<em&gt; 초파리</em&gt; Respirometry를 사용하여

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

RNA 결합 단백질의 검출에 의해<em&gt; 체외</em지방 세포 문화&gt; RNA 풀다운

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

세포 배양에서 RNA 합성, 처리 및 부패의 높은 해상도 유전자 발현 프로파일에 대한 새로 전사 RNA 대사 라벨링

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