저자 인정 NIH/NIGMS에서 지원 (HJN에 R01GM084135) 및 Glycoscience (부여 #110071 HJN), 그리고 톰 V. 리 토론 및 분석 실험에 대 한 제안에 대 한 감사에 대 한 미즈타 니 재단과 Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, 로버트 플레밍, 켄 어바인과 플라스 미드를 세포 초파리 게놈 자원 센터 (DGRC)

1. 가짜 최저 두 배 좌초 RNA (dsRNA)의 준비
<ol>
	<li>제품의 PCR 증폭
	<ol>
		<li>야생-타입 옐로우 화이트 (y w) 게놈 DNA와 pAc5.1 EGFP 템플릿과 다음 뇌관 쌍으로 dsRNA 합성에 사용 된 DNA 파편을 증폭을 사용 합니다. 다음 PCR 온도 프로 파일을 사용 하 여: 변성 (95 ° C, 30 s), 어 닐 링 (58 ° C, 30 s) 및 확장 (72 ° C, 1 분). 
		녹색 형광 단백질 강화 (EGFP) dsRNA 뇌관 (5'-3')- 앞으로 뇌관-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG 반전 뇌관-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG 
		Shams dsRNA 뇌관 (5'-3')- 앞으로 뇌관-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT 반전 뇌관-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA 참고: EGFP dsRNA 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>젤-제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 젤 정화 키트를 사용 하 여 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 제품을 정화.</li>
	<li>전사 체 외에 상업 제품 제조 업체의 프로토콜에 따라 T7 발기인에서 속기의 능력을 사용 하 여 수행 합니다.</li>
	<li>제조 업체의 프로토콜에 따라 RNA 정화 키트를 사용 하 여 dsRNA를 정화 하 고-80 ° c.에 저장</li>
	<li>다음 단계 (1.5.1-1.5.5)를 사용 하 여 가짜 최저의 효율성을 평가 합니다.
	<ol>
		<li>태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 100 U/mL 페니실린-스 셀 사용 하 여 수동으로 hemocytometer 및 플레이트 5 x 105 s 2 셀에는 6의 각 잘 잘 플레이트 1 mL/슈나이더의 매체의 10% 보충 수.</li>
		<li>각 잘 하 EGFP-또는 shams dsRNA의 7.5 µ g을 추가 하 고 24 시간에 대 한 25 ° C에서 품 어.</li>
		<li>수확 컨트롤 (EGFP dsRNA 치료) 및 25 ° C에서 5 분 동안 1000 x g와 RNA 분리에 따라 RNA 추출 키트를 사용 하 여 프로세스에서 원심 분리에 의해 아래로 산 뒤 부드러운 pipetting으로 shams dsRNA 취급 S2 셀 제조 업체의 프로토콜입니다.</li>
		<li>분 광 광도 계 및 프로세스 100 사용 하 여 RNA를 정량 1 단계 qRT-PCR 상업 정량 시 약 및 뇌관/프로브와 다음 PCR 온도 프로 파일을 사용 하 여에 대 한 RNA의 ng: 변성 (95 ° C, 15 s) 및 소 둔/확장 (60 ° C, 1 분). 참고: 뇌관/프로브 세트와 이러한 연구에서 shams 및 제어 qRT-PCR 실험을 위해 사용 하는 악기에 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
		<li>2-ΔΔCT 방법16를 사용 하 여 상대 shams mRNA 레벨을 계산 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 평가의 노치 수용 체와 트랜스사이의 바인딩-ligands
<ol>
	<li>신호 수신 셀 (S2 노치 수용 체를 표현)을 준비 합니다.
	<ol>
		<li>hemocytometer를 사용 하 여 수동으로 셀 및 플레이트 5 x 105 S2 및 안정적인 S2-노치 셀에 1 ml에서 6 잘 플레이트/슈나이더의 매체의 잘 각 잘 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스. 참고: S2 노치 셀, 초파리 게놈 자원 센터 (DGRC)에서 사용할 수 있는 미디어에 200 nM 토트를 추가 합니다. 0.5 m m 토트 재고 솔루션을 준비 하려면 먼저 1 M NaOH의 250 µ L에 20 mM 토트 솔루션 준비. 다음, 0.5 m m 1 M 인산 염 버퍼 식 염 수에-20 ° c.에가을이 솔루션을 희석 S2-노치 셀에 노치 단백질의 표정은 pMT 벡터에 초파리 metallothionein 발기인의 제어.</li>
		<li>각 잘 하 dsRNA의 7.5 µ g을 추가 하 고 24 시간에 대 한 25 ° C에서 품 어.</li>
		<li>0.7 m m 노치의 표현을 유도 하 여 25 ° C에서 3 일 동안 품 어 CuSO4 를 추가 합니다. 참고: CuSO4 metallothionein 발기인에 의해 제어 하는 단백질의 표정을 유도 하는 데 사용 됩니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>신호를 보내는 셀 (S2 셀 델타 또는 Serrate ligands 표현)을 준비 합니다.
	<ol>
		<li>사용 하 여 수동으로 hemocytometer를 접시 ~ 5 x 106 안정 S2 델타 또는 S2 Serrate톰 셀 1 ml에서 6 잘 플레이트의 각 음에 셀/슈나이더의 매체의 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스. 참고: 미디어에 S2-델타 셀 200 nM 토트와 100 µ g/mL hygromycin S2 Serrate톰 셀을 추가 합니다. 델타와 Serrate톰의 표정-Serrate12의 토마토 태그, 기능 버전- pMT 벡터에 초파리 metallothionein 발기인을 받고 있다.</li>
		<li>0.7 m m ligands의 표현을 유도 하는 3 h 25 ° C에서 품 어 CuSO4 를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>신호 보내기 및 신호 받기 셀 사이의 집계를 수행 합니다.
	<ol>
		<li>DsRNA 취급 S2 수확 (제어)과 부드러운 pipetting 접시 2.5 x 105 셀/잘 hemocytometer에 의해 수동 계산 후 24-잘 접시에에서 의해 S2-노치 셀.</li>
		<li>5 x 105 안정 S2 델타 또는 S2 Serrate톰 셀 슈나이더의 매체의 200 µ L의 전체 볼륨에 추가 (보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스). 참고: 모든 S2 셀 (를 포함 하 여 도금, 유도 및 dsRNA 처리) 처리는 biosafety 캐비닛 아래 이루어졌다.</li>
		<li>150 rpm (942.48 rad/min)에서 궤도 통에 접시를 놓습니다.</li>
		<li>1 분 후 각의 내용을 혼합 하 고 꺼내 20 µ L의 수를 계산 합니다.<ol>
			<li>10 배 확대 (PLL 10/0.25 목표)를 사용 하 여 거꾸로 화합물 현미경 대표 이미지 걸릴 동시에.</li>
			<li>수동으로 집계를 계산 (&#62; 6 셀)는 hemocytometer를 사용 하 여.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>통에 접시를 놓습니다.</li>
		<li>이미지 수집 및 5 분 후, 15 분 집계의 계산을 반복 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>트랜스의 정량화를 수행-바인딩.
	<ol>
		<li>배경 컨트롤 S2 셀과 S2 델타 또는 S2 Serrate톰 셀 간의 mL 당 집계 수를 계산 합니다.</li>
		<li>S2-노치와 S2-델타 또는 S2 Serrate톰 셀 사이의 mL 당 집계 수를 계산 ( 트랜스의 크기-바인딩).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3입니다.노치와 트랜스간의 바인딩의 저해의 평가- Cis에 의해 ligands-ligands
<ol>
	<li>신호 수신 셀을 준비 합니다.
	<ol>
		<li>플레이트 5 x 105 s 2 셀의 1 mL에는 6-잘 접시/슈나이더의 매체의 잘 각 잘 보충 10 %FBS 및 100 U/mL 페니실린-스.</li>
		<li>각 잘 하 dsRNA의 7.5 µ g을 추가 하 고 24 시간에 대 한 25 ° C에서 품 어.</li>
		<li>공동 transfect dsRNA 치료 셀 pBluescript 및 pMT 노치11 (DGRC) 혼자 또는 pMT 노치 및 pMT 델타11 (DGRC) 또는 pMT Serrate총17 DNA는 2 µ g/잘 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 transfection 시 약의 농도. 참고: pBluescript 컨트롤로 사용 됩니다. 공동 transfected 세포 S2-노치 이라고 불릴 것 이다 &#38; 델타과도 또는 S2-노치 &#38; Serrate과도 셀이.</li>
		<li>뚜렷이 페 S2 셀 24 h에 대 한 25 ° c를 품 어.</li>
		<li>0.7 m m 노치와는 ligands의 표현을 유도 하 여 25 ° C에서 3 일 동안 품 어 CuSO4 를 추가 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2.2에 설명 된 대로 신호를 보내는 셀을 준비 합니다.</li>
	<li>2.3 섹션에 설명 된 대로 신호 보내기 및 신호 받기 셀 사이의 집계를 수행 합니다.</li>
	<li>트랜스의 저해를 계량- cis에 의해 바인딩-ligands.
	<ol>
		<li>배경 컨트롤 S2 셀과 S2 델타 또는 S2 Serrate 셀 간의 mL 당 집계 수를 계산 합니다.</li>
		<li>Cis에 의해 억제의 크기를 정량화-다음과 같이 ligands.<ol>
			<li>S2-노치과도 S2-델타 세포 사이의 집계의 수로 A 를 정의 합니다.</li>
			<li>S2 셀 사이의 집계 수 노치와 델타 정도 공동 페 B 정의 (S2-노치 &#38; 델타과도)와 S2-델타 세포.</li>
			<li>상대 집계 C 계산 = (B x 100) /A</li>
			<li>Cis-ligand (델타 또는 Serrate) 100-의해 억제의 크기를 계산 C. 참고: 한 예로, 상대 집계가 45%, cis-ligands 횡단을 억제 하는 것으로 간주 됩니다-55% 바인딩.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+regulates+veinlet+expression+and+establishes+boundaries+between+veins+and+interveins+in+the+Drosophila+wing.">Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).</li><li>Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling:+the+core+pathway+and+its+posttranslational+regulation.">Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation.</a> Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).</li><li>del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+and+significance+of+cis-inhibition+in+Notch+signalling.">Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling.</a> Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).</li><li>Sprinzak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-interactions+between+Notch+and+Delta+generate+mutually+exclusive+signalling+states.">Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states.</a> Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).</li><li>Kopan, R., Ilagan, M. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+notch+signaling+by+xylose.">Negative regulation of notch signaling by xylose.</a> PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).</li><li>Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xylosylation+of+the+Notch+receptor+preserves+the+balance+between+its+activation+by+trans-Delta+and+inhibition+by+cis-ligands+in+Drosophila.">Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).</li><li>Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+interactions+between+the+protein+products+of+the+neurogenic+loci+Notch+and+Delta,+two+EGF-homologous+genes+in+Drosophila.">Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila.</a> Cell. 61 (3), 523-534 (1990).</li><li>Fleming, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extracellular+region+of+Serrate+is+essential+for+ligand-induced+cis-inhibition+of+Notch+signaling.">An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling.</a> Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).</li><li>Saj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+ex+vivo+and+in+vivo+RNAi+screen+for+notch+regulators+in+Drosophila+reveals+an+extensive+notch+interaction+network.">A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network.</a> Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).</li><li>Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+ligand-mediated+inhibition+in+Notch+signaling+activity+in+Drosophila.">Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila.</a> Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).</li><li>Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adhesion+force+of+Notch+with+Delta+and+the+rate+of+Notch+signaling.">The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling.</a> J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+notch-ligand+binding+by+protein+O-fucosyltransferase+1+and+fringe.">Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe.</a> J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).</li><li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rumi+is+a+CAP10+domain+glycosyltransferase+that+modifies+Notch+and+is+required+for+Notch+signaling.">Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling.</a> Cell. 132 (2), 247-258 (2008).</li><li>Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyltransferase+activity+of+Fringe+modulates+Notch-Delta+interactions.">Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions.</a> Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).</li><li>Yamamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+EGF+repeat-8+of+Notch+discriminates+between+Serrate/Jagged+and+Delta+family+ligands.">A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands.</a> Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).</li></ol>

저자는 전혀 충돌의 관심이 없다.

정식 노치 신호 노치 수용 체와 ligands5간의 상호 작용에 따라 달라 집니다. 노치 통로에 대부분의 연구는 주로 노치와 인접 셀 (트랜스)에 ligands의 바인딩은 고려, 하지만 노치와 같은 셀 ligands 할 상호 작용, 그리고 이러한 소위 cis-상호 작용 단계에서 억제 역할을 재생할 수 있습니다 신호3,4. 따라서, 정식 노치 신호에 한?...

정식 노치 신호 노치 수용 체와 그들의 ligands1간의 상호 작용을 촉진 하기 위하여 세포를 이웃의 육체적 인 접촉을 필요로 하는 단거리에 셀 통신 메커니즘입니다. Ligands와 노치 수용 체 (신호 수신 세포의 표면에 존재 하는)의 상호 작용 (신호 전송의 표면에 세포) 노치 신호를 시작 하 고 트랜스로 알려져 있다-활성화2. 다른 한편으로, 노치와 동일한 셀에 있는 그것의 ligands 사이 상호 작용 노치 통로의 억제를 지도 하 고 cis로 알려져 있다-금지3. 트랜스-와 cis사이의 균형-상호 작용 최적의 ligand 의존 노치4신호를 확인 하는 데 필요한. 초파리 는 포유류, 4 개의 노치 수용 체 있고 5 개의 ligands에 반대 한 노치 수용 체 및 두 ligands (델타와 Serrate) [가변 1 (JAG1), JAG2, 델타 같은 1 (DLL1), DLL3 및 DLL4]5. 이 단순 데, 초파리 모델 부드럽게 해 부 연구 노치 ligand 상호 작용 및 이후에 노치 신호 통로 한정자의 효과를 제공 합니다. ( 초파리날개 개발 포함), 동물 개발 하는 동안 특정 상황에서 cis-및 트랜스-상호 적절 한 노치 신호를 달성 하기 위해 운명1,6 셀 관련 . 시스- 트랜스대에 이러한 상황에서 노치 통로 한정자의 효과 구별 하는 것이 중요 하다-그것의 ligands와 노치의 상호 작용.
우리의 그룹은 이전 부정적인 초파리 노치를 xylose 라는 탄수화물 잔류물의 날개 개발7을 포함 한 특정 컨텍스트에서 노치 신호 조절 보고. Shams 의 손실 (효소는 xylosylates 노치) "날개 정 맥의 손실" 형7리드. 최근에, 유전자 복용량 실험 및 클론 분석 shams 의 손실 델타 중재 노치 내 서 향상을 보여 사용 되었다. Shams 돌연변이에 향상 된 노치 신호는 감소 cis의 결과 여부를 구별 하는 것-금지 또는 증가 트랜스-활성화, 애벌레 윙 imaginal 디스크에 노치 ligands의 소성 overexpression 학문 민 진 당-GAL4 드라이버를 사용 하 여 수행 했다. Shams 트랜스규제를 제안 하는 증거를 제공 하는이 실험-노치 cis를 영향을 주지 않고 델타에 의해 노치의 활성화-ligands8에 의해 저해. 그러나, 피드-다시 규정 그리고 내 인 성 ligands의 효과 소성 overexpression 학문1,,69의 해석 복잡 하 게 만들 수 있습니다.
10 사용 되었다 초파리 S2 세포가이 문제를 해결 하려면는 노치 ligand 상호 작용 연구11,12간단한 체 외에 시스템을 제공 합니다. S2 셀 하지 생 노치 수용 체 델타 리간드11 을 표현 하 고 표현 Serrate13, 노치 ligand 집계 실험8에 영향을 주지 않는 낮은 수준. 따라서, S2 셀 수 수 안정적으로 또는 정도 페 노치 또는 개별 ligands 델타 (Serrate) 독점적으로 노치 수용 체 또는 그것의 ligands의 하나를 표현 하는 세포를 생성 하 또는 그들의 조합에 의해. Heterotypic 수용 체 ligand 바인딩11,,1214중재의 형성에 S2 셀 결과 ligand 표현 S2 노치 표현 세포의 혼합. 트랜스의 측정을 제공 하는 집계 형성의 정량화-노치와 그것의 ligands15 (그림 1) 사이의 바인딩. 마찬가지로, S2 셀 노치와 델타 또는 Serrate ligands와 공동 transfected 수 (즉, cis-ligands). Cis-S2 노치 표현 세포에 ligands 파기 트랜스와 노치의 바인딩-ligands 및 결과에 집계 형성8,,1214감소. Cis에 의해 발생 하는 집계 형성의 상대적 감소- cis의 억제 효과의 측정을 제공 하는 ligands-노치와 트랜스간의 바인딩에 ligands-ligands (그림 2). 따라서, 셀 집계 분석 트랜스-와 cis에 xylosylation의 손실의 영향을 검토 하 활용 했다-노치와 그것의 ligands 사이 상호 작용.
여기, 선물이 상세한 프로토콜 트랜스와 노치의 바인딩을 평가를 겨냥 한 셀 집계 분석 실험-ligands 및 cis에 의해 그것의 억제-ligands 초파리 S2 세포를 사용 하 여. 예를 들어, 제공 하는 데이터 바인딩 노치와 트랜스사이 노치 xylosylation의 효과 결정 하는-델타8. 이러한 간단 분석 노치 ligand 상호 작용에서 생체 외에서 의 반 정량적 평가 제공 하 고 기본 노치 통로 한정자의 비보에 효과 분자 메커니즘을 결정 하는 데 도움이.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1127">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:415px;">BioWhittaker Schneider&#8217;s Drosophila medium, Modified</td>
			<td style="width:187px;">Lonza</td>
			<td style="width:131px;">04-351Q</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution</td>
			<td style="width:187px;">GE Healthcare lifescience&#160;</td>
			<td style="width:131px;">SV30010</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">CELLSTAR 6 well plate</td>
			<td style="width:187px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:131px;">657 160</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">CELLSTAR 24 well plate</td>
			<td style="width:187px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:131px;">662160</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">VWR mini shaker</td>
			<td style="width:187px;">Marshell Sceintific</td>
			<td>12520-956</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Sceintific&#160;</td>
			<td>267110</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td style="width:187px;">Promega</td>
			<td style="width:131px;">E2311</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">MEGAscrip T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:187px;">Ambion</td>
			<td style="width:131px;">AM1334</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit)</td>
			<td style="width:187px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:131px;">R1054</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">VistaVision Inverted microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:415px;">9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software</td>
			<td style="width:187px;">AmScope</td>
			<td style="width:131px;">MU-900</td>
			<td style="width:396px;">Image acquisition using ToupView software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">PureLink Quick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">K210012</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:415px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:187px;">GenDepot</td>
			<td style="width:131px;">F0600-050</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Methotrexate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A6770-10</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">HY068-L6</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:415px;">Copper sulphate</td>
			<td style="width:187px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:131px;">4448-02</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2 cells</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">R69007</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">S2-SerrateTom cells</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2-Delta cells</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">152</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">S2-Notch cells</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">154</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pMT-Delta vector</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">1021</td>
			<td style="width:396px;">Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:415px;">pMT-Serrate vector</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pMT-Notch vector</td>
			<td style="width:187px;">DGRC</td>
			<td style="width:131px;">1022</td>
			<td style="width:396px;">Gift from S. Artavanis-Tsakonas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">pAc5.1-EGFP</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:396px;">Gift from Hugo Bellen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:131px;">1611091</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td>Dm02144576_g1&#160;</td>
			<td style="width:396px;">with FAM-MGB dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32)</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td>Dm02151827_g1</td>
			<td style="width:396px;">with FAM-MGB dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td style="width:187px;">Applied Biosystem</td>
			<td style="width:131px;">4351405</td>
			<td style="width:396px;">96-well Block module</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell aggregation assays to evaluate the binding of the drosophila notch with trans-ligands and its inhibition by cis-ligands

노치 신호 동물 개발 및 성인 유지 관리에 광범위 하 게 사용 되는 진화론 보존된 셀 통신 시스템입니다. 신호 통로의 활성화를 유도 하는 이웃 세포에서 ligands와 노치 수용 체의 상호 작용 (트랜스-활성화) 신호를 억제 하는 ligands는 동일한 세포에서와 상호 작용 하는 동안, (cis-억제). 트랜스사이의 적절 한 균형-활성화 및 cis-억제 노치 동물 개발 하는 동안 일부 컨텍스트에서 신호의 최적 수준을 확립 도움이 됩니다. 노치와 많은 세포 유형에의 ligands의 겹치는 식 도메인 및 피드백 메커니즘의 존재, 트랜스- cis대에 주어진된 포스트 번역 상 수정의 효과 공부-노치의 상호 작용 및 그것의 ligands에서 비보에 어렵습니다. 여기, 우리 노치의 트랜스 와 cis각 ligand 바인딩에 노치 통로 한정자 노크의 효과 평가 하기 위해 셀 집계 분석 실험에서 초파리 S2 세포를 사용 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. S2 셀 안정적으로 또는 정도 페 노치 표현 벡터와 각 노치 ligand (S2-델타 또는 S2 Serrate)를 표현 하는 세포와 혼합 됩니다. 트랜스-수용 체와 ligands 간의 바인딩을 heterotypic 셀의 형성 귀착되 고 mL의 구성 당 집계 수 측정 된다 &#62; 6 셀. Cis의 억제 효과 검토-ligands, S2 셀 공동 노치와 각 ligand를 표현 S2 델타 또는 S2 Serrate 세포 혼합 및 위에서 설명한 대로 집계의 수 정량은. Cis의 존재로 인해 집계 수의 상대적 감소- cis의 측정을 제공 하는 ligands-ligand- 트랜스의 저해를 중재-바인딩. 이러한 간단 분석 실험 유전 또는 약리학 바인딩에 노치의에 조작의 ligands의 효과에 반 양적 데이터를 제공할 수 있습니다 그리고 vivo에서 효과의 기본 분자 메커니즘을 파악 하는 것을 도울 수 있다 노치 신호에 같은 조작.

우리의 vivo에서 관측 제안는 노치 신호 때문에 이득에 xylosyltransferase 유전자 shams 결과의 손실 증가 델타 중재 트랜스- cis를 영향을 주지 않고 노치의 활성화-의 저해 노치 ligands8. 이 테스트 하려면 셀 집계 분석 생체 외에서 수행 했다. 첫째, shams 식 S2 셀에는 뜨 shams dsRNA를 사용 하 여. EGFP dsRNA 제어로 ?...

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Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Vivo에서 시스템의 복잡성 트랜스-와 cis에 의해 활성화 노치 수용 체의 억제 사이 구별 하 게 어려운 게-ligands, 각각. 여기, 우리가 시험관에서 셀 집계 분석 실험의 트랜스를 초파리 노치의 바인딩 질적 및 반 정량적 평가 위한 기반 프로토콜 제시-ligands 대 cis-ligands.

트랜스와 초파리 노치의 바인딩을 평가를 집계 분석 셀-Ligands 및 Cis에 의해 그것의 억제-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

cell-aggregation-assays-to-evaluate-binding-drosophila-notch-with

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

7.4K 조회수.  Baylor College of Medicine. Vivo에서 시스템의 복잡성 트랜스-와 cis에 의해 활성화 노치 수용 체의 억제 사이 구별 하 게 어려운 게-ligands, 각각. 여기, 우리가 시험관에서 셀 집계 분석 실험의 트랜스를 초파리 노치의 바인딩 질적 및 반 정량적 평가 위한 기반 프로토콜 제시-ligands 대 cis-ligands.

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Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). We use an in vitro myelination assay, an established model for studying CNS myelination in vitro. To do this, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are added to the purified primary rodent dorsal root ganglion (DRG) neurons to form myelinating co-cultures. In order to specifically interrogate the roles that particular proteins expressed by oligodendrocytes exert upon myelination we have developed protocols that selectively transduce OPCs using the lentivirus overexpressing wild type, constitutively active or dominant negative proteins before being seeded onto the DRG neurons. This allows us to specifically interrogate the roles of these oligodendroglial proteins in regulating myelination. The protocols can also be applied in the study of other cell types, thus providing an approach that allows selective manipulation of proteins expressed by a desired cell type, such as oligodendrocytes for the targeted study of signaling and compensation mechanisms. In conclusion, combining the in vitro myelination assay with lentiviral infected OPCs provides a strategic tool for the analysis of molecular mechanisms involved in myelination.

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한<em&gt; 체외</em&gt; 수초 분석

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

연구

발생학

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

의 시금 혈액 세포 집단<em&gt; 초파리</em&gt; 유충

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

개발<em&gt; 체외</em&gt; 분석은 중간 엽 세포를 시행 한 상피 - 중간 엽 전환의 수축 기능을 평가하는

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

방법은 림프 글 랜드와 혈구 세포에서를 검사합니다<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

마우스 파골 세포 전구체의 노치 신호 전달의 자극

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

초파리 배아에 구슬 없는 광학 핀셋으로 셀 역학 조사

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted epithelial morphogen. In this assay, Fog is used as an agonist to activate Rho through a signaling cascade that includes a G-protein-coupled receptor (Mist), a G&#945;12/13 protein (Concertina/Cta), and a PDZ-domain-containing guanine nucleotide exchange factor (RhoGEF2). Fog signaling results in the rapid and dramatic reorganization of the actin cytoskeleton to form a contractile purse string. Soluble Fog is collected from a stable cell line and applied ectopically to S2R+ cells, leading to morphological changes like apical constriction, a process observed during developmental processes such as gastrulation. This assay is amenable to high-throughput screening and, using RNAi, can facilitate the identification of additional genes involved in this pathway.

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Here we describe a contractility assay using Drosophila S2R+ cells. The application of an exogenous ligand, folded gastrulation (Fog), leads to the activation of the Fog signaling pathway and cellular contractility. This assay can be used to investigate the regulation of cellular contractility proteins in the Fog signaling pathway.

조사 비 근육 Myosin II 수축 통해 접혀 gastrulation 신호 전달 경로 초파리 S2R + 셀에 셀 기반 분석 결과

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...